Dans cette thèse de doctorat, la structure de membranes naturelles et modèles et leurs interactions avec des molécules biologiquement actives ont été étudiées au moyen de la réflectométrie de neutrons. Les lipides naturels ont été extraits de la levure Pichia pastoris, poussée en milieux deutéré et hydrogéné. L’analyse a montré que la quantité relative de phospholipides n’est pas affectée par le changement en composition isotopique du milieu de croissance. Cependant, les cellules de levures deutérées contiennent principalement des acides gras C18 :1 alors que le degré d’insaturation est plus élevé chez les levures hydrogénés. Diminuer la température du milieu de croissance permet d’augmenter le degré d’insaturation des acides gras chez les levures deutérées. Une analyse qualitative des sphingolipides a été réalisée et un protocole pour séparer les fractions phosphocholines et phosphoethanolamine a été établi.<p><p>La structure de bicouches composées des lipides de levures a été étudiée par réflectivité de neutrons. La bicouche composée de lipides deutérés polaires a une épaisseur similaire aux bicouches faites de phosphocholines C18:1 synthétiques. En présence de stérols, la rugosité aux interfaces entre les têtes polaires et les chaînes augmente. La bicouche composée de lipides polaires hydrogénés est plus mince que celle deutérée. Ceci est dû à la composition en acides gras beaucoup plus variée et du plus grand nombre d’insaturations. En présence de stérols, l’épaisseur de la bicouche hydrogénée augmente. <p>L’interaction de ces bicouches avec l’amphotéricine B (AmB) a été étudiée. L’AmB est un antifongique qui interagit fortement avec les membranes contenant de l’ergostérol et moins fortement avec des membranes contenant du cholestérol. Dans tous les cas, les molécules d’AmB forment une couche épaisse et diluée au dessus de la bicouche lipidique. En présence de stérols, les molécules d’AmB pénètrent dans la bicouche et change sa structure selon la composition en acide gras.<p><p>La structure de bicouches lipidiques de plante et leurs interactions avec des intermédiaires de synthèse ont aussi été étudiées par réflectivité de neutrons. Des mélanges ternaires de plantes étaient déposés sur silicium et des mélanges quaternaires sur saphir. L’épaisseur de la bicouche composée de mélange ternaire est de 38 Å, tandis que celle du mélange ternaire est de 28 Å, la différence venant probablement d’un effet de substrat. La présence de diacylglycérol (DAG) a comme conséquence d’augmenter l’aire par lipide, et ainsi de changer la conformation des têtes polaires. L’interaction des bicouches de lipide de plante avec l’acide phosphatidique (PA) dans le but d’observer un flip-flop possible a aussi été étudiée mais le PA a tendance à désorbé les bicouches du substrat et aucun mécanisme de flip flop n’a été détecté.<p><p>Finalement, la localisation d’une petite molécule, le resvératrol, dans des bicouches modèles a été étudiée. Le resvératrol est connu pour être responsable du « paradoxe français » qui est une corrélation inverse entre la consommation d’aliment gras et un faible taux de maladie cardiaque. Quand le resvératrol est adsorbé à partir de la phase liquide, il induit une réorganisation des têtes polaires. Quand il est déposé sur le substrat en présence des lipides, il est présent à l’interface entre les têtes polaires et les chaines.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cell surface transport proteins play a crucial role in all cells, from unicellular organisms to mammals, by conferring to the plasma membrane selective permeability to a wide range of ions and small molecules. The activity of these proteins is very often regulated by controlling their amount at the plasma membrane where they are removed by means of selective endocytosis in response to signals and changes in the environment.<p>One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose regulation has been extensively studied is the general amino acid permease. Previous studies on Gap1 and other yeast permeases revealed that ubiquitin plays a key role in the membrane trafficking of these proteins by providing a signal that triggers their internalization in endocytic vesicles and that promote their sorting into intra-endosomal vesicles for subsequent delivery into the lumen of the vacuole, the lysosome of yeast. <p>In the first part of this work, we report the isolation of 64 mutant forms of the Gap1 protein and their exploitation in a systematic functional study of the predicted intracellular regions of the permease. The phenotypic analysis of these mutants revealed an important role of certain amino acid sequences in the (i) transport of the permease through the secretory pathway (ii) intrinsic activity of the permease at the plasma membrane (iii) stability of the protein at the cell surface (iv) sorting of the protein into intra-endosomal vesicles. Further investigation of some of these mutants allowed us to unravel an original mechanism for the degradation of the permease that is independent of its ubiquitylation.<p>In the second part of the work, we used yet other Gap1 mutants to study the signals and pathways inducing the ubiquitylation and endocytosis of the permease. Also, we further investigated the molecular mechanisms inducing Gap1 ubiquitylation. <p>All these results together allow us to better understand the mechanisms controlling the ubiquitin dependent down-regulation of plasma membrane proteins. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en sciences appliquées / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans une démarche d'optimisation et de maîtrise d'un bioprocédé, une préoccupation importante concerne la mesure et le suivi de l'état des cellules. Au cours de cette thèse, des mesures in situ et/ou permettant de mettre en évidence une variabilité phénotypique au sein d'une population de levures ont été recherchées. La spectroscopie d'impédance, basée sur la capacité des cellules viables à se polariser sous l'effet d'un champ électrique, a été retenue pour estimer l'état des cellules en-ligne. Pour effectuer des mesures de morphologie et de viabilité à l'échelle de la cellule, un système complet de microscopie et d'analyse d'image automatisées a été développé, en parallèle de l'utilisation d'un compteur de cellules de type Coulter. Enfin, des suivis individuels de croissance sur milieu gélosé ont été réalisés afin de caractériser la population en termes de temps de latence et de vitesse de croissance. Le procédé modèle de cette étude est la production de bioéthanol, qui expose les levures utilisées (S. cerevisiae) à d'importantes contraintes physicochimiques (température, acétate, furfural,...) qui affectent leur état physiologique et limitent l'efficacité de l'étape de fermentation. La population, homogène sur le plan cinétique dans des conditions de culture non stressantes, devient hétérogène lorsqu'une perturbation est appliquée. La mesure de cette hétérogénéité peut être utilisée comme marqueur de la sévérité du stress subi. Au cours des phases de déclin, la mort s'accompagne d'une diminution de la taille des cellules et d'une modification de leur aspect en microscopie. Ces changements permettent d'estimer la proportion de cellules viables à partir des distributions de taille obtenues avec le compteur d'une part, et l'analyse des images de microscopie d'autre part. La spectroscopie d'impédance donne une estimation fiable de la fraction volumique de cellules viables et permet de mesurer la capacitance membranaire Cm, ainsi que la conductivité intracellulaire sin, des paramètres liés à l'état de la membrane et du cytoplasme. Cm, constante tant que les cellules sont viables, s'annule à leur mort, tandis que sin varie selon la phase de culture et en réponse aux stress. / For bioprocess control and optimization, biomass monitoring and physiological state evaluation is an important issue. During this work, in situ and at-line measurements have been used to evaluate cell state and detect a phenotypic variability within a yeast population. Dielectric spectroscopy, based on the polarization of viable cell membranes exposed to an electrical field, has been selected to infer cell state on-line. In parallel with the use of a Coulter-type cell counter, a dedicated system of automated microscopy and image analysis has been developed to measure cell morphology and viability. Single-cell growth on agar medium was monitored to characterize individual cells with regard to lag-time and initial growth rate. Bioethanol production with S. cerevisiae has been chosen as a model process since the yeast cells are exposed to strong physicochemical stresses (temperature, acetate, furfural,?) which affect their physiological state and impair fermentation efficiency. The cell population, kinetically homogeneous during stress-free fermentations, became heterogeneous when a perturbation was applied. The mean and the variance of lag-time distributions were related to the stress severity. During the decline phase, cell death went along with a decrease in cell size and changes of their microscopy aspect. These changes were significant enough to infer the proportion of viable cells directly from the size distributions obtained with the cell counter or from microscopy image analysis. Dielectric spectroscopy gave reliable estimates of the viable cell volume fraction and enabled the measurements of membrane capacitance Cm and intracellular conductivity sin, parameters related to membrane and cytoplasm states. The Cm value remained constant as long as the cells were viable and dropped to zero at cell death, while sin varied significantly depending on the growth phase and in response to stress.

L'analyse de l'organisation à grande échelle des chromosomes, par des approches d'imagerie et de biologie moléculaire, constitue un enjeu important de la biologie. Il est maintenant établi que l'organisation structurelle du génome est un facteur déterminant dans tous les aspects des " transactions " génomiques: transcription, recombinaison, réplication et réparation de l'ADN. Bien que plusieurs modèles aient été proposés pour décrire l'arrangement spatial des chromosomes, les principes physiques qui sous-tendent l'organisation et la dynamique de la chromatine dans le noyau sont encore largement débattus. Le noyau est le compartiment de la cellule dans lequel l'ADN chromosomique est confiné. Cependant, la mesure quantitative de l'influence de la structure nucléaire sur l'organisation du génome est délicate, principalement du fait d'un manque d'outils pour déterminer précisément la taille et la forme du noyau. Cette thèse est organisée en deux parties: le premier axe de mon projet était d'étudier la dynamique et les propriétés physiques de la chromatine dans le noyau de la levure S. cerevisiae. Le deuxième axe visait à développer des techniques pour détecter et quantifier la forme et la taille du noyau avec une grande précision. Dans les cellules de levure en croissance exponentielle, j'ai étudié la dynamique et les propriétés physiques de la chromatine de deux régions génomiques distinctes: les régions codant les ARN ribosomiques regroupés au sein d'un domaine nucléaire, le nucléole, et la chromatine du nucléoplasme. Le mouvement de la chromatine nucléoplasmique peut être modélisé par une dynamique dite de " Rouse ". La dynamique de la chromatine nucléolaire est très différente et son déplacement caractérisé par une loi de puissance d'exposant ~ 0,7. En outre, nous avons comparé le changement de la dynamique de la chromatine nucléoplasmique dans une souche sauvage et une souche porteuse d'un allèle sensible à la température (ts) permettant une inactivation conditionnelle de la transcription par l'ARN polymérase II. Les mouvements chromatiniens sont beaucoup plus importants après inactivation transcriptionnelle que dans la souche témoin. Cependant, les mouvements de la chromatine restent caractérisés par une dynamique dite de " Rouse ". Nous proposons donc un modèle biophysique prenant en compte ces résultats : le modèle de polymère dit "branched-Rouse". Dans la deuxième partie, j'ai développé "NucQuant", une méthode d'analyse d'image permettant la localisation automatique de la position de l'enveloppe nucléaire du noyau de levures. Cet algorithme comprend une correction post-acquisition de l'erreur de mesure due à l'aberration sphérique le long de l'axe Z. "NucQuant" peut être utilisée pour déterminer la géométrie nucléaire dans de grandes populations cellulaires. En combinant " NucQuant " à la technologie microfluidique, nous avons pu estimer avec précision la forme et la taille des noyaux en trois dimensions (3D) au cours du cycle cellulaire. "NucQuant" a également été utilisé pour détecter la distribution des regroupements locaux de complexes de pore nucléaire (NPCs) dans des conditions différentes, et a révélé leur répartition non homogène le long de l'enveloppe nucléaire. En particulier, nous avons pu montrer une distribution particulière sur la région de l'enveloppe en contact avec le nucléole. En conclusion, nous avons étudié les propriétés biophysiques de la chromatine, et proposé un modèle dit "branched Rouse-polymer" pour rendre compte de ces propriétés. De plus, nous avons développé "NucQuant", un algorithme d'analyse d'image permettant de faciliter l'étude de la forme et la taille nucléaire. Ces deux travaux combinés vont permettre l'étude des liens entre la géométrie du noyau et la dynamique de la chromatine. / Chromosome high-order architecture has been increasingly studied over the last decade thanks to technological breakthroughs in imaging and in molecular biology. It is now established that structural organization of the genome is a key determinant in all aspects of genomic transactions. Although several models have been proposed to describe the folding of chromosomes, the physical principles governing their organization are still largely debated. Nucleus is the cell’s compartment in which chromosomal DNA is confined. Geometrical constrains imposed by nuclear confinement are expected to affect high-order chromatin structure. However, the quantitative measurement of the influence of the nuclear structure on the genome organization is unknown, mostly because accurate nuclear shape and size determination is technically challenging. This thesis was organized along two axes: the first aim of my project was to study the dynamics and physical properties of chromatin in the S. cerevisiae yeast nucleus. The second objective I had was to develop techniques to detect and analyze the nuclear 3D geomtry with high accuracy. Ribosomal DNA (rDNA) is the repetitive sequences which clustered in the nucleolus in budding yeast cells. First, I studied the dynamics of non-rDNA and rDNA in exponentially growing yeast cells. The motion of the non-rDNA could be modeled as a two-regime Rouse model. The dynamics of rDNA was very different and could be fitted well with a power law of scaling exponent ~0.7. Furthermore, we compared the dynamics change of non-rDNA in WT strains and temperature sensitive (TS) strains before and after global transcription was actived. The fluctuations of non-rDNA genes after transcriptional inactivation were much higher than in the control strain. The motion of the chromatin was still consistent with the Rouse model. We propose that the chromatin in living cells is best modeled using an alternative Rouse model: the “branched Rouse polymer”. Second, we developed “NucQuant”, an automated fluorescent localization method which accurately interpolates the nuclear envelope (NE) position in a large cell population. This algorithm includes a post-acquisition correction of the measurement bias due to spherical aberration along Z-axis. “NucQuant” can be used to determine the nuclear geometry under different conditions. Combined with microfluidic technology, I could accurately estimate the shape and size of the nuclei in 3D along entire cell cycle. “NucQuant” was also utilized to detect the distribution of nuclear pore complexes (NPCs) clusters under different conditions, and revealed their non-homogeneous distribution. Upon reduction of the nucleolar volume, NPCs are concentrated in the NE flanking the nucleolus, suggesting a physical link between NPCs and the nucleolar content. In conclusion, we have further explored the biophysical properties of the chromatin, and proposed that chromatin in the nucleoplasm can be modeled as "branched Rouse polymers". Moreover, we have developed “NucQuant”, a set of computational tools to facilitate the study of the nuclear shape and size. Further analysis will be required to reveal the links between the nucleus geometry and the chromatin dynamics.

Une protéine prion peut adopter deux conformations distinctes, l’une cellulaire et l’autre prion. La conformation prion est le résultat de son agrégation en fibre amyloïde. Cette fibre est le support de l’information prion à partir duquel les isoformes cellulaires sont convertis en forme prion de façon autocatalytique. La transmission de l’information prion repose donc sur la transmission de cette fibre au cours des divisions cellulaires, qui est réalisée par de petits polymères. Ceux-ci sont le résultat d’un équilibre entre la fragmentation et la polymérisation de la fibre. Une perturbation de cet équilibre provoque une agrégation massive de la protéine prion, menant à la perte de l’information prion.L’objectif de ma thèse était de comprendre ce qui définit in vivo la transmission du prion. Mon modèle d’étude est la protéine Ure2p propageant le prion [URE3] dans la levure S. cerevisiae. J’ai montré que la concentration cellulaire d’Ure2p détermine la vitesse d’agrégation de la protéine prion et donc son efficacité de transmission. En effet, de trop fortes concentrations cellulaires sont incompatibles avec la propagation du prion. La concentration cellulaire d’Ure2p définit également la diversité des souches prions. Un crible génétique m’a permit de mettre en évidence que la présence de séquences centromériques surnuméraires dans la cellule interfère avec la transmission du prion [URE3]. Le même phénomène est observé avec une augmentation du niveau de ploïdie de la cellule. Dans les deux cas, la surexpression du chaperon Hsp104 restaure une propagation normale du prion. / A prion protein can adopt two distinct conformations, one cellular and one prion. Prion conformation is the result of its aggregation into amyloid fibers. This fiber is the support of the prion information from which the cellular isoforms are converted into prion form by autocatalytic manner. The prion information transmission is therefore based on the transmission of this fiber during cell division, which is done by small polymers. These are the result of a balance between fragmentation and polymerization of the fiber. A disturbance of this balance causes a massive aggregation of the prion protein, leading to the prion information loss.The objective of my thesis was to understand what defined in vivo the prion transmission. My studying model was the Ure2p protein propagating the [URE3] prion in S. cerevisiae yeast. I showed that the Ure2p cellular concentration determined the aggregation speed of the prion protein and thus its transmission efficiency. Indeed, too high cellular concentrations are incompatible with the prion propagation. The cellular concentration of Ure2p also defines the prion strains diversity. A genetic screen allowed me to highlight that the presence of centrometric supernumerary sequences in the cell interferes with the [URE3] prion transmission. The same phenomenon is observed with an increase in the cell ploidy. In both cases, overexpression of the Hsp104 chaperone restores normal prion propagation.

P53 est un gène suppresseur de tumeur ubiquitaire qui empêche la prolifération de cellules malignes chez l’humain. En réponse à des dommages à l’ADN ou à des stress cellulaires, p53 entraine l’arrêt du cycle cellulaire et initie la réparation des lésions du génome. Si ces réparations échouent, p53 déclenche alors la mort de la cellule endommagée par apoptose. De plus, p53 présente une forte homologie avec deux autres gènes suppresseurs de tumeur : p63 et p73. Ces trois protéines forment une famille de facteurs de transcription qui protège l’organisme contre le développement de tumeurs. Ce système de défense est enrichi par les multiples isoformes de p53, p63 et p73 dont les rôles sont encore mal décrits. La neutralisation de la fonction de suppression de tumeur de p53, p63 et p73 est un mécanisme clef du développement tumoral auquel participent les mutants hotspots de p53 ainsi que certaines isoformes de p53, p63 et p73 par un effet dominant-négatif. Toutefois, de nombreuses zones d’ombre limitent notre compréhension de ce phénomène. Tout d’abord, l’identification des membres de la famille de p53 impliqués dans l’effet dominant-négatif reste incomplète. Ensuite, les mécanismes responsables de l’effet dominant-négatif sont débattus, suite notamment à l’émergence d’une nouvelle hypothèse impliquant un mécanisme de type prion. Enfin, l’effet dominant-négatif de la famille de p53 pourrait également être mis en cause dans d’autres types de pathologies comme les syndromes développementaux associés à des mutations de p63. Au cours de cette thèse, j’ai étudié l’impact fonctionnel des mutations hotspots de p53 ainsi que celui des principales isoformes de la famille de p53 sur l’activité transcriptionnelle des isoformes actives de p53, p63 et p73. En utilisant comme modèle d’étude un eucaryote simple, la levure S. cerevisiae, nous avons pu démontrer que l’effet dominant-négatif des mutants et isoformes de la famille de p53 repose sur la formation d’hétéro-tétramères entre formes actives et inactives de ces protéines et n’implique pas de mécanisme de type prion. De plus nos travaux ont montré que certains mutants de p53 interfèrent avec les isoformes actives de p63 et p73 par un mécanisme partiellement basé sur la tétramérisation. En outre, nos résultats préliminaires suggèrent que les mutants de p63 impliqués dans les syndromes développementaux EEC, ADULT et NSCL1 exercent également un effet dominant-négatif similaire à celui des mutants de p53. L’identification des mécanismes de l’effet dominant-négatif observé au sein de la famille de p53 permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques tant dans les cancers que dans certaines maladies rares du développement humain. / P53 is a ubiquitous tumor suppressor gene that prevents damaged cells from proliferating. Following DNA damage or cellular stress, p53 induces a cell cycle arrest and initiates an attempt to repair the lesions. If the repair fails, p53 triggers the apoptosis of the cell. p53 shares a high homology with two other tumor suppressor genes: p63 and p73. Together they form a family of transcription factors, which are actively protecting the organism from tumor development. This defense network is enriched by multiple N-terminal and C-terminal isoforms of p53, p63 and p73. The loss of p53, p63 and p73 tumor suppression function is a key step of cancer progression. Mutants of p53 and isoforms of p53, p63 and p73 often exhibit a dominant-negative behavior resulting in the loss of p53 tumor suppression activity. However, the extent of the dominant-negative effect within p53 family remains unclear. The mechanisms behind the dominant-negative effect are also debated due to the recent emergence of a prion-like hypothesis. Finally, the dominant-negative effect of p53 family members could be involved in other pathologies such as p63-related developmental syndromes During this PhD, I studied the functional consequences of hotspot mutations of p53 and of the main isoforms of the p53 family on the transcriptional activity of p53, p63 and p73. Using the naïve eukaryotic model S. cerevisiae we have demonstrated that the dominant-negative effect of mutants and isoforms of the p53 family relies on the formation of hetero-tetramers between functional and non-functional members of the family but not on a prion-like mechanism. In addition, certain p53 mutants are able to interfere with p63 and p73 isoforms though a mechanism that is only partially based on tetramerization. Of note, we obtained preliminary results suggesting that mutants of p63, which are involved in EEC, ADULT and NSCL1 developmental syndromes, behave like dominant-negative hotspot mutants of p53. The identification of the mechanisms of the dominant-negative effect occurring within p53 family could lead to new therapeutic targets both in cancer and in rare developmental syndromes.1 EEC : ectrodactyly, ectodermal dysplasia and cleft lip/palate syndrome, ADULT : acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth syndrome, NSCL : non-syndromic cleft lip

Les mitochondries sont des organites qui remplissent d'importantes fonctions au sein de la cellule eucaryote notamment dans le métabolisme énergétique. En fonction de l'état physiologique (par exemple une variation de la demande énergétique), on peut constater d'importantes variations du contenu mitochondrial cellulaire. Ces variations impliquent une modification de la biogenèse mitochondriale qui est un processus complexe mettant à contribution divers acteurs protéiques ainsi que les génomes nucléaire et mitochondrial. Nous avons étudié la régulation de la biogenèse mitochondriale chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Chez cet organisme, un des éléments clés de la biogenèse du compartiment mitochondrial est le facteur de transcription hétéromérique HAP. Ce dernier est constitué de 4 sous-unités dont la sous-unité activatrice est la protéine Hap4p. Nous avons mis en évidence une régulation de la protéine Hap4p par le stress oxydant et l'état rédox du glutathion. Ainsi, un stress oxydatif induit par des molécules pro-oxydantes ou encore un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale induit une diminution de la protéine Hap4p. Cette diminution conduit à une diminution de la quantité de marqueurs mitochondriaux tels que les cytochromes et une forte diminution de la vitesse de respiration et de la vitesse de croissance. Nous nous sommes aussi intéressés à la régulation du complexe HAP par la molécule d'hème. Nos résultats sont les premiers à clairement mettre en évidence une régulation positive de la quantité de Hap4p par l'hème et suggèrent aussi une régulation post-traductionnelle de Hap4p par l'état rédox de cette molécule. Tous ces résultats apportent des éléments supplémentaires dans l'étude des mécanismes de la communication mitochondrie-noyau et de la régulation de la biogenèse mitochondriale. / Mitochondria are organelles that play important functions in eukaryotic cell especially in energy metabolism. According to the physiological state (for example energy demand variation), mitochondrial content can vary in large amounts within the cell. These variations involve the modification of mitochondrial biogenesis which is a complex process which depends on many proteins and both nuclear and mitochondrial genomes. We studied the regulation of mitochondrial biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism, a key component of mitochondrial biogenesis is the heteromeric transcription factor HAP. It is constituted by 4 subunits, Hap4p being the activator subunit. We showed a regulation of Hap4p protein by oxidative stress and the glutathione redox state. Thus, oxidative stress induced by pro-oxidants or by mitochondrial respiratory chain dysfunction leads to a decrease in the Hap4p protein level. This decrease of Hap4p leads to a decrease in mitochondrial markers level such as cytochromes and a decrease of the respiratory and growth rates. We also interested in the regulation of the HAP complex by heme. Our results are the first to clearly show a positive regulation of Hap4p level by heme and also suggest a post-translational regulation of Hap4p by the heme redox state. Altogether, these results represent novel pieces to the study of the mitochondria-nucleus communication and the regulation of mitochondrial biogenesis.

Les polyomavirus sont des virus très prévalents dans la population générale. Chez les sujets immunodéprimés, quatre polyomavirus sont associés à des pathologies. Parmi ces virus, le MCPyV est quant à lui responsable du carcinome à cellules de Merkel. Son implication dans un cancer humain a conduit à un regain d’intérêt pour la famille des Polyomaviridae. Au cours de ma thèse, nous nous somme intéressés à l’épidémiologie de six nouveaux polyomavirus humains (MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9 et MWPyV). Ces études ont montré que ces virus sont très répandus dans la population générale et que les infections surviennent dès l’enfance. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux réactivités croisées entre polyomavirus humains et simiens phylogénétiquement proches. Nous avons montré qu’il existe des cross réactions entre le LPyV et l’HPyV9, entre le MCPyV et deux virus de chimpanzé (PtvPyV1 et PtvPyV2). Ces polyomavirus simiens ne circulent donc pas chez l’Homme. D’autre part, afin de mieux comprendre le cycle du MCPyV, nous avons initié l’identification des partenaires cellulaires de l’ensemble de ses protéines. Ce travail a tout d’abord été réalisé sur les protéines mineures de capside VP2/VP3. Des cribles en double hybride en levure ont permis d’identifier les partenaires cellulaires des VP2/3. L’interaction effective entre les protéines virales et cellulaires a ensuite été validée en cellules de mammifères par une approche de complémentation de la luciférase Gaussia princeps. Les partenaires cellulaires des protéines VP2/VP3 identifiés sont impliqués dans les voies de prolifération cellulaire, d’apoptose, NF?B et dans le transport intracellulaire du virus. / Polyomaviruses are ubiquitous in the general population and in immunocompromised patients, and four are associated with disease. 0f these viruses, MCPyV is responsible for Merkel ceil carcinoma, and its involvement in human cancer has led to a renewed interest in the Polyomaviridae family. My thesis work has focused on the epidemiology of six new human polyomaviruses (MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9 and MWPyV). These studies have shown that these viruses are widespread in the genera population and that infection occurs in early childhood. We have also focused on cross-reactivity between phylogenetically closely related human and simian polyomaviruses. We have shown that there is cross-reactivity between sirnian virus LPyV and HPyV9 and between MCPyV and two chimpanzee viruses (PtvPyVl and PtvPyV2). However, these simian polyomaviruses do not circulate in humans. Moreover, in order to improve understanding of the cycle of MCPyV, we set out to identify the cellular partners of its proteins. This work was initially performed on minor capsid proteins VP2 and VP3. Screening in yeast two-hybrid identified cellular partners of VP2 and VP3. Interactions between viral and cellular proteins were then validated in mammalian celis by complementation assay using Gaussia princeps luciferase. Cellular patners of VP2 and VP3 are involved in ceil proliferation, apoptosis, NFkB and intracellular transport of the virus.

Le cadre général de cette thèse est la question de la relation génotype-phénotype, abordée à travers l'analyse du phénomène d'hétérosis chez la levure, dans une approche associant biologie, mathématiques et statistiques. Antérieurement à ce travail, un très gros jeu de données hétérogènes, correspondant à différents niveaux d'organisation (protéomique, caractères de fermentation et traits d'histoire de vie), avait été recueilli sur un dispositif demi-diallèle entre 11 souches appartenant à deux espèces. Ce type de données est idéalement adapté pour la modélisation multi-échelle et pour tester des modèles de prédiction de la variation de phénotypes intégrés à partir de caractères protéiques et métaboliques (flux), tout en tenant compte des structures de dépendance entre variables et entre observations. J’ai d'abord décomposé, pour chaque caractère, la variance génétique totale en variances des effets additifs, de consanguinité et d'hétérosis, et j’ai montré que la distribution de ces composantes permettait de définir des groupes bien tranchés de protéines dans lesquels se plaçaient la plupart des caractères de fermentation et de traits d'histoire de vie. Au sein de ces groupes, les corrélations entre les variances des effets d'hétérosis et de consanguinité pouvaient être positives, négatives ou nulles, ce qui a constitué la première mise en évidence expérimentale d’un découplage possible entre les deux phénomènes. Le second volet de la thèse a consisté à interfacer les données de protéomique quantitative avec un modèle stœchiométrique du métabolisme carboné central de la levure, en utilisant une approche de modélisation à base de contraintes. M'appuyant sur un algorithme récent, j’ai cherché, dans l'espace des solutions possibles, celle qui minimisait la distance entre le vecteur de flux et le vecteur des abondances observées des protéines. J’ai ainsi pu prédire un ensemble de flux et comparer les patrons de corrélations entre caractères à plusieurs niveaux d'intégration. Les données révèlent deux grandes familles de caractères de fermentation ou de traits d'histoire de vie dont l'interprétation biochimique est cohérente en termes de trade-off, et qui n'avaient pas été mises en évidence à partir des seules données de protéomique quantitative. L'ensemble de mes travaux permet de mieux comprendre l'évolution de la relation entre génotype et phénotype. / The general framework of this thesis is the issue of the genotype-phenotype relationship, through the analysis of the heterosis phenomenon in yeast, in an approach combining biology, mathematics and statistics. Prior to this work, a very large set of heterogeneous data, corresponding to different levels of organization (proteomics, fermentation and life history traits), had been collected on a semi-diallel design involving 11 strains belonging to two species. This type of data is ideally suited for multi-scale modelling and for testing models for predicting the variation of integrated phenotypes from protein and metabolic (flux) traits, taking into account dependence patterns between variables and between observations. I first decomposed, for each trait, the total genetic variance into variances of additive, inbreeding and heterosis effects, and showed that the distribution of these components made it possible to define well-defined groups of proteins in which most of the characters of fermentation and life history traits took place. Within these groups, the correlations between the variances of heterosis and inbreeding effects could be positive, negative or null, which was the first experimental demonstration of a possible decoupling between the two phenomena. The second part of the thesis consisted of interfacing quantitative proteomic data with the yeast genome-scale metabolic model using a constraint-based modelling approach. Using a recent algorithm, I looked, in the space of possible solutions, for the one that minimized the distance between the flux vector and the vector of the observed abundances of proteins. I was able to predict unobserved fluxes, and to compare correlation patterns at different integration levels. Data allowed to distinguish between two major types of fermentation or life history traits whose biochemical interpretation is consistent in terms of trade-off, and which had not been highlighted from quantitative proteomic data alone. Altogether, my thesis work allows a better understanding of the evolution of the genotype-phenotype map.