Les levures du genre Brettanomyces sont considérées depuis longtemps comme des contaminants par les industries vinicoles et brassicoles dû aux composés phénoliques indésirables qu’elles produisent. Cependant, l’utilisation des espèces B. bruxellensis et B. anomalus en brasserie est maintenant plus répandue grâce à leur capacité à diversifier les composés aromatiques produits par la traditionnelle levure Saccharomyces cerevisiae. Malgré cette émergence dans le domaine brassicole, peu d’informations sont disponibles en ce qui concerne la diversité génétique des souches et leur potentiel en fermentation. À notre connaissance, aucune méthode permettant de caractériser, d’identifier rapidement les souches de Brettanomyces spp. et pouvant facilement être mise en place dans un contexte industriel est présentement disponible. L’objectif de l’étude était donc de développer une nouvelle méthode rapide et fiable pour le typage moléculaire des levures Brettanomyces spp. dans l’optique de différencier les espèces et les souches, ainsi que de prédire leur potentiel brassicole. À cet effet, la méthode de typage génétique Random Amplification of Microsatellites (RAM)-PCR utilisant l’amorce (CGA)₅ a été développée et validée avec la méthode Restriction Endonuclease Analysis-Pulsed-Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE) sur vingt-deux (22) souches de Brettanomyces spp., une (1) souche de Pichia kluyveri, une (1) souche de Candida parapsilosis, une (1) souche de Schizosaccharomyces pombe et une (1) souche de Saccharomyces cerevisiae, toutes isolées de bières, ferments commerciaux, vin rouge, levain et kombucha. Des essais de fermentation primaire ont révélé que les souches ayant un bon potentiel brassicole se trouvent dans les mêmes groupes phylogénétiques générés avec la méthode RAM-PCR et l’amorce (CGA)₅. Le projet a donc permis de fournir un outil efficace pour les brasseurs et les fournisseurs de levures pour l’identification rapide des espèces, des souches et du potentiel brassicole de levures Brettanomyces spp. provenant de différents substrats, sans avoir à faire appel aux techniques de séquençage et d’essais de fermentation qui sont plus coûteux ou qui demandent plus de temps à réaliser. / The yeasts of the genus Brettanomyces are often considered as a major contaminant in the wine and beer industries because of their production of phenolic off-flavors. Recently, few species of this genus, especially B. bruxellensis and B. anomalus, have been used in beers to enlarge the pool of aromatic compounds produced by the traditional Saccharomyces cerevisiae starter used for decades in breweries. The characterization of Brettanomyces species is therefore crucial to identify the strains showing interesting technological traits. However, to our knowledge, no fast method is currently available to evaluate the genetic diversity of the genus Brettanomyces which can be easily adapted in an industrial context. The aim of this study was to develop and optimize a new, fast and reliable typing method used for the species and strains differentiation of Brettanomyces spp. isolates and for the prediction of their brewing potential. Twenty-two (22) strains of Brettanomyces, one (1) Pichia kluyveri, one (1) Candida parapsilosis, one (1) Schizosaccharomyces pombe and one (1) Saccharomyces cerevisiae were isolated from beer, red wine, kombucha, sourdough, chicha and commercial starters and used for the development of a method based on the Random Amplification of Microsatellites (RAM)-PCR technique with (CGA)₅. This method was validated with the already existent and reliable Restriction Endonuclease Analysis coupled with Pulsed-Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE) method. Further fermentation assays revealed that potential brewing isolates were clustered in the same phylogenetic group generated with RAM-PCR electrophoretic profiles. The study allowed the development of a useful tool for brewers and yeast suppliers for the identification at the species and strains levels and the brewing potential of various Brettanomyces spp. isolates, without the need for sequencing and laborious fermentation assays.

L'alimentation du porcelet pendant la période critique du sevrage est d'une grande importance pour assurer une transition harmonieuse et limiter les répercussions sur sa croissance à court et à long termes. Cette étude avait pour objectif de déterminer les effets de l'incorporation d'acides gras à chaîne moyenne (MCFAs), de levures et d'avoine nue sur la santé intestinale ainsi que sur la consommation alimentaire des porcelets en pré et en post-sevrage. Trois traitements d'alimentation à la dérobée ont été distribués aléatoirement aux porcelets de 24 portées à partir du 10e jour de lactation, soit à base de maïs (M), d'avoine nue (AN) ou d'avoine nue combinée avec un supplément de levures et de MCFAs (AN+). Le statut alimentaire (mangeur ou non-mangeur) a également été évalué pendant la lactation. En post-sevrage, 48 porcelets ayant reçu de l'aliment à la dérobée ont été placés selon le traitement en pré-sevrage et leur statut alimentaire. Peu de répercussions ont été notées chez les truies, sauf la perte de poids qui était plus élevée pour AN+ (P < 0,01). Aucune différence n'a été mesurée pour la croissance ou la consommation alimentaire des porcelets en pré ou en post-sevrage. La hauteur des villosités intestinales n'a pas été affectée, tandis que la profondeur des cryptes et le ratio hauteur des villosités/profondeur des cryptes ont été significativement influencés par l'interaction aliment x statut (P < 0,05). Les porcelets non-mangeurs en pré-sevrage et exposés au supplément de MCFAs/levures ont eu une profondeur des cryptes plus élevée. Cette étude a montré que l'avoine nue, les MCFAs et les levures ont eu une faible répercussion sur la croissance en pré et en post-sevrage. Toutefois, les résultats ont confirmé que la maximisation de la prise alimentaire dans les premiers jours en post-sevrage peut permettre de limiter les répercussions négatives sur la morphologie intestinale.

Le séchage est une opération unitaire pratiquée depuis des millénaires pour laquelle les connaissances scientifiques sont encore très incomplètes. Il est cependant de plus en plus nécessaire de « bien » sécher afin d’atteindre une combinaison optimale du temps de séchage, de l’énergie consommée et surtout de la qualité du produit final. Ceci est d’autant plus vrai dans le cadre du séchage alimentaire où de nombreux produits sont très sensibles à la température et à la déshydratation. C’est le cas de la levure de boulanger dont la capacité à dégager du CO2, pour faire gonfler la pâte à pain par exemple, diminue très souvent lorsque le séchage est réalisé dans des mauvaises conditions opératoires. L’utilisation de séchoirs particuliers tels que les lits à jet coniques devrait permettre d’améliorer le séchage en terme d’efficacité et de qualité finale. L’objectif principal de cette thèse est de contribuer à mieux comprendre et modéliser le séchage de levures en lit à jet conique en utilisant une approche multi-échelles. <p>Le séchage d’un grain de levure isolé est caractérisé à l’aide d’un nouveau dispositif thermogravimétrique dans lequel il est possible de mesurer l’évolution des dimensions du grain ainsi que sa température de surface. Les résultats obtenus sont alors utilisé pour construire et valider un nouveau modèle du séchage d’un grain de levure basé sur l’existence de trois types d’eau et permettant de prédire l’évolution du contenu en eau et de la température du grain. L’analyse combinée du modèle et des résultats expérimentaux permet de mettre en avant que le rétrécissement des grains de levures au cours du séchage n’a pas d’impact significatif sur la vitesse de séchage et qu’il est essentiel de modéliser correctement la température du grain.<p>L’écoulement de solides dans le lit à jet conique est caractérisé expérimentalement au moyen de la technique de poursuite de particule radioactive (RPT). Un post-traitement des données brutes (évolution temporelle de la position du traceur) est développé pour déduire un certain nombre de paramètres liés à l’écoulement du solide :forme des régions du lit à jet (jet, anneau et fontaine), distributions de l’écoulement des solides entre les régions, distribution de temps de séjour des solides dans le lit, vitesses et débits moyens des solides, et taux de gaz dans le jet et l’anneau. Les résultats expérimentaux ont notamment permis de montrer que la forme du jet ne dépend quasiment pas de la vitesse d’injection de l’air; de même, le rapport du débit volumique de solides d’une région du lit à l’autre avec la vitesse moyenne du solide dans l’anneau donne une valeur constante pour une hauteur de lit stagnant donnée. Des corrélations empiriques sont également développées pour prédire les vitesses et débits moyens de solides ainsi que les temps de séjour moyens des solides dans les différentes régions du lit.<p>L’écoulement du gaz dans le lit à jet conique est caractérisé expérimentalement par la mesure des distributions de temps de séjour (RTD) du gaz dans le lit par l’injection et la détection d’un gaz radioactif dans le lit à jet en opération. L’existence d’un écoulement non négligeable du gaz dans l’anneau du lit est mise en évidence. Les vitesses moyennes du gaz dans le jet et l’anneau ainsi que la portion du débit total qui passe dans le jet sont déduites des courbes de RTD. Il est identifié que le gaz circule au moins deux fois plus vite dans le jet que dans l’anneau, ce qui mène à des échanges de matières entre un solide et le gaz plus intenses dans le jet que dans l’anneau.<p>Des expériences de séchage de levure sont réalisées dans un lit à jet conique afin de caractériser l’effet des conditions opératoires sur le séchage. Un nouveau modèle multi-échelles décrivant le séchage de levure en lit à jet est présenté; celui-ci est basé sur les résultats des caractérisations expérimentales et des modélisations du séchage d’un grain de levure isolé et de l’écoulement solide-gaz dans le lit à jet conique. Le modèle phénoménologique ne possède qu’un seul paramètre et permet de très bien reproduire les résultats des expériences de séchage de levure en lit à jet conique. Il tient notamment compte du fait que dans un lit à jet, la saturation de l’air en vapeur d’eau au passage du lit peut être un phénomène limitant pour la vitesse de séchage, surtout en début de séchage.<p>La caractérisation de l’évolution au cours du séchage de la capacité de la levure à dégager du CO2 dans une pâte à pain a également été réalisée pour un grain de levure isolé et pour le séchage en lit à jet conique. Des conclusions similaires sont présentées dans les deux cas. En effet, la dégradation de la levure est liée à l’enlèvement de l’eau intracellulaire (type D, fin du séchage en-dessous de contenu en eau d’environ 0,5 (d.b.)) et c’est avant tout la vitesse avec laquelle cette eau est enlevée qui contrôle la qualité finale du produit. L’enlèvement de l’eau intercellulaire (type E, début du séchage) n’a pas d’influence significative sur la dégradation de la levure. Dans tous les cas, la dégradation est amplifiée lorsque la température du solide dépasse 40°C.<p>/<p>Drying is a unit operation that is practiced since thousands of years and which for scientific knowledge is still very incomplete. However it is more and more necessary to dry « well » in order to reach an optimal combination between drying duration, consumed energy and also final product quality. This is even truer in the case of food drying involving a lot of products that are very sensitive to temperature and dehydration. Baker’s yeast often encounters a drastic decrease of its gassing power, which makes for instance inflate bread dough, when drying is operated in wrong conditions. Using special driers such as conical spouted beds should allow improving drying in terms of efficiency and final quality. The main objective of this thesis is to contribute to better understand and model Baker’s yeast drying in a conical spouted bed by using a multiscale approach.<p>Drying of a single Baker’s yeast pellet is characterised by using a new thermogravimetric set up where the evolution of the pellet dimensions and surface temperature can be measured during drying. The obtained results are then used to develop and validate a new model of the drying of a Baker’s yeast pellet. The model is based on the existence of three types of water in yeast and it allows predicting the evolution of the pellet’s moisture content and temperature during drying. The combined analysis of the model and the experimental results permits to put forward that pellet’s shrinkage during drying have no significant influence on the drying rate and that it is really essential to correctly model the pellet’s temperature.<p>Solid flow in the conical spouted bed is experimentally characterised by using a radioactive particle tracking technique (RPT). A post-treatment of rough data (time-evolution of the tracer position) is developed in order to predict a series of parameters linked to the solid flow: shape of the bed regions (spout, annulus and fountain), distributions of solid flow in the bed regions, residence time distribution of the solids in the bed, mean solids velocities and flowrates, and voidage in the spout and annulus. Experimental results allowed to show that the shape of the spout is nearly not influenced by inlet air velocity; also, the ratio of volumetric solid flowrate between the different regions of the bed and of the mean solids velocity in the annulus has a constant value for a given static bed height. Empirical correlations are also developed in order to predict the mean solids’ velocities and flowrates, and the mean residence time of the solids in each region of the bed.<p>Gas flow in the conical spouted bed is experimentally characterised by measuring gas residence time distributions (RTD) in the bed through the injection and detection of a radioactive gas tracer into the operated spouted bed. The existence of non-negligible gas flow in the annulus of the bed is highlighted. Mean gas velocities in the spout and annulus, and the part of the total gas flow going to the spout are deducted from the RTD curves. It is identified that gas moves at least twice faster in the spout than in the annulus, which leads to mass exchanges between solid and gas that are more intense in the spout than in the annulus.<p>Baker’s yeast drying experiments are done in a conical spouted bed in order to characterise the effects of operating conditions on drying. A new multiscale model, describing Baker’s yeast drying in conical spouted bed, is presented; it is based on experimental results and on the models of a single pellet drying and of gas-solid flows in the conical spouted bed. This phenomenological model has only one unknown parameter and permits reproducing the experimental results of Baker’s yeast drying in conical spouted bed. It takes into account the fact that, in a spouted bed, vapour saturation of the air during its residence time in the bed can be a limiting phenomena for the drying rate, especially in the beginning of the drying.<p>The characterisation of the evolution of the Baker’s yeast gassing power in a bread dough during the drying has also been done in the case of a single pellet drying and in the case of spouted bed drying. Similar conclusions are presented for both cases. Indeed, yeast degradation is linked to intracellular water removal (type D, end of the drying below a moisture content of around 0,5 (d.b.)) and it is mostly the rate of this water removal that controls the final quality of the product. Intercellular water removal (type E, beginning of the drying) has no significant influence on yeast degradation. In all the cases, degradation is amplified when solid temperature is higher than 40°C.<p> / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'expression génique est régulée à de nombreuses étapes de la vie cellulaire. La synthèse des protéines ou traduction, étape ultime de cette expression, est finement régulée. Elle comporte trois phases: l'initiation, l'élongation et la terminaison. L'initiation commence par l'établissement de la sous-unité ribosomique 40S sur cet ARNm qu'elle balaye ensuite jusqu'au codon initiation. Pour cela, des facteurs canoniques sont impliqués. Parmi eux, le facteur eIF3 interagit directement avec celle-ci. Au cours de mes travaux, j'ai étudié dans une première partie l'interaction putative entre le facteur eIF3 et la petite sous-unité ribosomique 40S. Le ribosome est constitué par deux types d'entités : des protéines ribosomiques et l'ARNr. Le facteur eIF3, contient au moins 13 sous-unités, dont deux possèdent un RRM, et sont potentiellement capables de lier cet ARNr via leur RRM: p44 et p116. eIF3p44 a montré auparavant qu'elle pouvait lier l'ARNr 18S. J'ai effectué un criblage d'une banque de fragments de cet ARNr pour identifier un site de liaison de p44 sur la sous-unité 40S. Les ARNm néo-synthétisés sont transportés et localisés afin de permettre l'expression des protéines au moment opportun et en un lieu précis de la cellule. Dans une deuxième partie, j'ai étudié des interactions impliquées dans le contrôle de l'initiation de la traduction d'un ARNm localisé chez la levure S. cerevisiae pendant son transport : l'ARNm ASH1. Il est régulé par Khd1p, protéine à trois domaines KH, qui lie directement un de ses éléments de localisation. Cette interaction est abolie par la phosphorylation de Khd1p lorsque l'ARNm est correctement localisé.

The cytoplasm of eukaryotic cells contains several membrane-delimited compartments of specific molecular compositions and functions. Among those, the vacuole of fungal cells is often described as an organelle equivalent to the lysosomes of animal cells and the vacuoles of plant cells. These compartments indeed share two similar features: they contain a wide variety of hydrolases and are the most acidic compartments of the cell, which accounts for their key role in the intracellular degradation of macromolecules. In humans, dysfunctions of the lysosomes often give rise to lysosomal related diseases, such as lysosomal storage disorders. These are a class of metabolic disorders caused by the accumulation of non-degraded macromolecules or impaired export of hydrolytic degradation products. Cystinosis is an autosomal recessive disorder (1/200 000 incidence) generally associated with renal dysfunctions. It is caused by the accumulation and crystallization of cystine, the disulfide of cysteine, into the lumen of lysosomes. Cystinosin, the causative gene product of cystinosis, is present at the lysosomal membrane and catalyses the export of cystine from this compartment. The human cystinosin is a member of the Lysosomal Cystine Transporter (LCT) family. LCT proteins are conserved in all eukaryotic species and are defined by the presence of highly conserved PQ-loop motifs. <p>During this thesis work, we have studied three LCT proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae, named Ypq1, Ypq2 and Ypq3 (Yeast PQ-loop proteins 1, 2 and 3). We first showed that these proteins localize to the vacuolar membrane. We next studied the roles of these proteins, the regulation of their genes and the mechanisms and signals implicated in their delivery to the vacuolar membrane. We also contributed to the functional characterization of a mammalian homologue of yeast Ypq proteins, named rPqlc2. <p>In the first part of this work, we report that the Ypq proteins are most probably implicated in the export of basic amino acids from the vacuole to the cytosol. More precisely, Ypq2 and Ypq3 behave like vacuolar arginine and lysine exporters, respectively. Interestingly, the mammalian rPqlc2 protein expressed in yeast reaches the vacuolar membrane and functions as an orthologue of the Ypq proteins. Our results also reveal that the expression of the YPQ3 gene is regulated by the Lys14 transcription factor, responsible for the transcriptional activation of the LYS genes encoding enzymes implicated in the biosynthesis of lysine. We have also noted that, in general, the expression of the expression of the YPQ genes is regulated according to the quality of the nitrogen source available in the extracellular medium, eg. YPQ3 is sensitive to the nitrogen catabolite repression regulatory mechanism. <p>In the last part of this thesis work, we investigated the intracellular trafficking of the Ypq proteins and show that these predominantly reach the vacuolar membrane via the ALP (alkaline phosphatase) pathway due to the presence of a dileucine-based sorting signal in their sequences. Interestingly, a similar mechanism seems responsible for targeting to the yeast vacuole of the mammalian rPqlc2 protein.<p><p><p>Une caractéristique des cellules eucaryotes est leur organisation en compartiment internes délimité par une membrane lipidique, appelé organelles. Ces compartiments intracellulaires présentent une composition lipidique et protéique particulaire conforme à leur identité et fonction. Les lysosomes de cellules de mammifères et la vacuole fongique jouent un rôle clé dans la digestion intracellulaire de macromolécules et de ce fait leurs lumières sont enrichis d’enzymes hydrolytiques nécessaires à cette action. Des disfonctionnements du lysosome peuvent être la conséquence de pathologie chez l’homme, regroupé sous le nom de maladie lysosomale, lié à un à une accumulation de macromolécules non digéré ou un default d’export des produits d’hydrolysé depuis la lumière du lysosome. La cystinose est une maladie autosomale récessive avec une faible fréquence d’incidence (1/200 000) qui regroupe trois formes cliniques :deux formes rénales graves et une forme extra-rénale. Cette maladie est due à une accumulation et cristallisation de cystine dans la lumière du lysosome qui est corrélé à des mutations ponctuelles dans le gène CTNS qui code pour l’exporteur de cystine, la cystinosine. Cette protéine est un membre de la famille LCT (Lysosomal Cystine Transporter) qui possède des représentants chez les cellules animales, végétales et fongiques. Les protéines de la famille possèdent une taille et une topologie prédite similaire (7 segments transmembranaires) et on retrouve aussi au sein de ces protéines deux exemplaires de motifs PQ. Lors de ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à trois membres de la famille LCT chez Saccharomyces cerevisiae que nous avons nommé Ypq1, Ypq2 et Ypq3 pour Yeast PQ-loop proteins. Ces protéines n’ayant pas fait l’objet de nombreuses études, nous nous sommes orientés vers une analyse fonctionnelle et transcriptionnelle. De plus, nous avons également étudié les mécanismes et signaux impliqué dans leur adressage vers la vacuole. Finalement, nous avons également inclus dans notre étude un homologue mammalien de ces protéines, rPqlc2. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le rôle des protéines dans la prise alimentaire et en particulier la caractérisation de son effet satiétogène ont fait l'objet de nombreuses études ces dernières années. Si le caractère sur-satiétogène des protéines par rapport aux autres macronutriments est avéré, les mécanismes mis en jeu dans l'apparition de cet effet demeurent cependant incertains et sujet à débat. En outre, la modulation de l'effet satiétogène en fonction de la nature des protéines utilisées et son effet sur les mécanismes d'action demeurent controversés. L'objectif de ce travail est d'étudier dans un premier temps l'activation de certaines régions du système nerveux central connues pour être impliquées dans la régulation du comportement alimentaire suite à l'ingestion de protéines, après avoir fait état des données bibliographiques quant au rôle et au fonctionnement de ces régions. Dans un second temps, nous avons étudié l'effet satiétogène induit par des extraits de protéines de levure spécifiques, développés par la société Bio-Springer, ainsi que leur effet sur l'activation du système nerveux central. Nos résultats montrent que les protéines en général activent des régions contrôlant la prise alimentaire à court et à moyen terme, en particulier les neurones noradrénergiques du noyau du tractus solitaire, ainsi que les neurones mélanocortiques du noyau arqué de l'hypothalamus. Cette activation s'accompagnerait d'une relative inhibition des réseaux de l'hédonisme associés à la palatabilité des aliments. En outre, les protéines n'activent pas le cortex pyriforme antérieur, région capable de détecter les carences en acides aminés essent iels. Concernant les protéines et peptides de levure, ces extraits ont exprimé un pouvoir satiétogène supérieur a celui obtenu avec les sources protéiques traditionnellement utilisées, à la fois chez le rat et chez l'Homme, Dans le cas des peptides de levure, cette diminution de la prise alimentaire se poursuit même après habituation à moyen terme. Cet effet satiétogène va de pair avec une activation plus importante des réseaux mélanocortiques du noyau arqué de l'hypothalamus. Malgré des effets satiétogènes d'ampleur similaire, protéines et peptides de levure ont manifestement des mécanismes d'action différents

Au cours de l'endocytose, les cargos de membrane plasmique (PM) sont internalisés puis dirigés vers l'endosome précoce (EE), les corps multivésiculaires (MVBs), puis le lysosome/vacuole pour dégradation. Le ciblage des protéines vers les zones invaginées des MVBs requiert l'action des complexes ESCRTs. Chez la levure comme chez les mammifères, les mutants déficients pour ces complexes présentent un compartiment endosomal anormal (Cl E) et une accumulation à la PM de diverses protéines. Nous avons montré que chez S. cerevisiae la stabilisation de la perméase à uracile (Fur4p) à la PM dans les mutants ESCRTs résulte de son recyclage vers la PM après internalisation. Fur4p ne traverse pas les compartiments Golgiens lors de son recyclage depuis le compartiment Cl E. Cette voie de recyclage est distincte de celle empruntée par la v-SNARE Snc1p. Fur4p est également capable de recycler depuis l'EE et suit alors la même voie de recyclage que Snc1p. Ceci suggère une complexité inattendue des voies de recyclage chez la levure.<br />Nous nous sommes aussi intéressés à Irs4p et Tax4p, 2 protéines à domaine EH, un domaine trouvé jusqu'alors dans des protéines impliquées dans l'endocytose ou le recyclage. Irs4p et Tax4p ne sont pas impliquées dans ces processus mais interviennent de façon redondante au cours de l'autophagie, un transport catabolique vésiculaire de fractions de cytoplasme ou d'organelles vers le lysosome/vacuole. Irs4p et Tax4p interagissent physiquement avec la machinerie d'autophagie et sont partiellement localisées à la structure Pré-autophagosomale, d'où émanent les vésicules d'autophagie. Ces résultats étendent donc la panoplie des fonctions des protéines à domaine EH.

Le stress est une problématique actuelle importante chez l'homme et chez l'animal et mettre en place des stratégies de lutte permettant de limiter ces effets parfois néfastes est crucial. En outre, l'exposition à un stress entraîne une modification du comportement alimentaire. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'effet du stress sur la prise alimentaire chez le rat nourri avec un régime standard afin d'appliquer ces résultats à l'étude de l'effet antistress d'un extrait de levure. Les modèles utilisés sont les stress aigus de nage forcée, de contention et de défaite sociale ainsi que le stress chronique variable (SCV). Dans une première partie, nous avons montré que l'application aigüe d'un stress entraînait une diminution de la prise alimentaire due à une augmentation du rassasiement. Ces mécanismes semblent être régulés par les neurones anorexigènes POMC de l'hypothalamus. De plus, nous avons montré que le SCV induisait une inhibition de la prise alimentaire qui semble s'expliquer par une augmentation chronique de l'expression de CRF dans l'hypothalamus, inhibiteur potentiel des neurones NPY orexigènes. Dans une deuxième partie, nous avons montré que l'extrait de levure étudié ne modifiait pas l'inhibition de la prise alimentaire liée au stress aigu ou chronique mais que son administration à long terme lors du SCV permettait de limiter l'hyperactivation de l'axe corticotrope. Ces résultats permettent d'avancer dans la compréhension des mécanismes à l'origine de l'inhibition de la prise alimentaire induite par le stress. D'autres études sont à envisager avant d'émettre des conclusions concernant l'effet anti-stress de l'extrait de levure testé.

Les extrémités des chromosomes eucaryotes linéaires ont une structure nucléoprotéique particulière, et sont appelées télomères. Étant donnés leur structure et le mécanisme semi-conservatif de la réplication de l’ADN, la longueur des séquences télomériques est instable. Au fil des divisions cellulaires, les réplications successives de l’ADN entraînent une réduction progressive des séquences télomériques. Des télomères courts ne sont plus fonctionnels, ce qui entraîne l’arrêt du cycle cellulaire et de l’instabilité génomique. Il est donc essentiel de prévenir ce raccourcissement. Une enzyme spécialisée rallonge les télomères : la télomérase. La télomérase est une ribonucléoprotéine (RNP) qui maintient les télomères par un mécanisme d’ajout de répétitions de la séquence télomérique. Afin de former un complexe actif, les sous-unités protéiques de l’enzyme doivent s’assembler autour d’un ARN non-codant, nommé Tlc1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cependant, le fait que la RNP nécessite plusieurs sous-unités pour son activité implique un assemblage précis et coordonné. Peu de données existent au sujet de l’assemblage de la RNP en un complexe actif, mais il semble qu’un trafic nucléo-cytoplasmique soit requis dans le cycle fonctionnel de l’enzyme. Caractériser le mécanisme d’assemblage de la télomérase permettra de mieux comprendre les phénomènes de régulation de l’activité de l’enzyme, et donc du maintien des télomères chez S. cerevisiae. À cette fin, j’ai d’abord vérifié l’état stoechiométrique de l’enzyme in vivo par des méthodes de FISH sur des molécules individuelles. J’ai ainsi pu montrer que la télomérase ne comportait qu’un seul ARN Tlc1. Ces données in vivo corrèlent avec des données publiées précédemment grâce à des techniques de biochimie, et suggèrent que l’enzyme n’est composée que de complexes individuels contenant une seule copie de chaque sous-unité protéique. Dans le but d’étudier les mécanismes d’assemblage de la télomérase, j’ai aussi développé un système de contrôle de la transcription d’une forme taguée de Tlc1. Cet outil génétique, basé sur les systèmes Cre-Lox et MS2-GFP, permet l’insertion d’un tag MS2 dans le gène TLC1. Ce tag donne la possibilité de suivre des ARN Tlc1 in vivo et en temps réel par microscopie confocale à spinning-disk. Ce système, baptisé CrEMGaT, a permis de montrer que l’insertion du tag dans le gène entraîne l’apparition de Tlc1-MS2, et que ces ARN forment des agrégats nucléaires ayant des caractéristiques similaires aux T-Recs précédemment caractérisés lors d’une collaboration avec le Pr Chartrand. De plus, des résultats préliminaires obtenus avec le CrEMGaT suggèrent que les ARN Tlc1-MS2 finissent leur cycle fonctionnel au cytoplasme. Dans l’ensemble, les données produites et l’outil développé au cours de cette thèse donnent une meilleure idée de l’état d’assemblage de la télomérase. / Abstract : In the eukaryotic kingdom, the extremities of the linear chromosomes have a particular nucleoproteic structure, and are called telomeres. Because of this structure and the semi-conservative nature of DNA replication, telomere length is unstable. DNA replications during consecutive cell divisions leads to a progressive shortening of telomeric sequences. Below a certain threshold, telomeres are not functional, triggering cell-cycle arrest and genomic instability. It is therefore essential to prevent this shortening. A specialized enzyme elongates telomeres: Telomerase. Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP) that adds repeats of the telomeric sequence to the end of telomeres. The enzyme formation requires protein subunits to assemble onto a scaffolding ncRNA, Tlc1 in Saccharomyces cerevisiae. The fact that several subunits are needed for RNP activity implies a precise and coordinated assembly occurs. However, data are lacking about telomerase assembly into an active complex, but different observations point towards a nucleo-cytoplasmic trafficking requirement during the enzyme life-cycle. Characteristics about telomerase assembly mechanism would provide useful information in the quest for understanding the phenomena regulating the enzyme activity, and therefore telomere maintenance in S. cerevisiae. Engaged in this quest, I first verified telomerase stoichiometry in vivo. By quantitative single-molecule FISH, the results showed that the enzyme only contains one Tlc1 RNA per RNP in the cell. These in vivo data correlate with previous publications which, based on biochemical experiments, suggested single copies of the different subunits are present in the complex. Taken together, these findings are dismantling a previous dogma that stipulated telomerase is composed of two complexes, and suggest telomerase quaternary arrangement stays simple. Aiming to study telomerase assembly mechanisms, I also developed an inducible genetic system governing the transcription of a tagged version of Tlc1 (i.e. Tlc1-MS2). This system, based on the Cre-Lox and MS2-GFP systems, allows to control the insertion of a MS2 tag into the TLC1 gene. In this system, dubbed CrEMGaT, the genetic insertion is controllable and indeed leads to Tlc1-MS2 appearance. It is then possible to track these tagged RNAs in vivo and in real time with a spinning disk confocal microscope. Furthermore, these RNAs form nuclear aggregates with characteristics of the T-Recs previously described in a collaboration between our lab and Pr Chartrand’s. Finally, preliminary data obtained with the CrEMGaT suggest cytoplasm is the last cellular compartment visited by Tlc1-MS2 RNA. Overall, these data and the system developed during my thesis will give insights into telomerase assembly in vivo.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.