A linhagem de glioma de rato C6 tem sido amplamente utilizada para investigar vários aspectos da biologia celular. Esta linhagem apresenta variações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de acordo com o número de passagens em cultivo. Segundo a literatura, culturas de passagens recentes apresentam características similares a glioblastomas, enquanto que culturas de passagens tardias assemelham-se à astroglia madura. Devido a isso, muitos estudos têm utilizado a linhagem C6 como modelo celular de glioblastoma e de astrócitos para investigar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico, como por exemplo, captação de glutamato. Entretanto, até o presente momento a caracterização e comparação desses parâmetros entre as culturas da linhagem C6 de passagens recentes e tardias ainda não foram avaliadas. O objetivo desta dissertação foi investigar e comparar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico entre as culturas de C6 com passagens recentes e tardias. As passagens recentes apresentaram um conteúdo intracelular de [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu 55% maior quando comparadas às passagens tardias e ambas as culturas atingiram o platô a partir dos 120min de incubação. Além disso, ambas as culturas apresentaram, após incubação com glutamato, os mesmos níveis de incorporação de iodeto de propídeo. Este resultado indica que o menor nível intracelular de [3H] observado nas culturas de passagens tardias não se deve a uma alteração na permeabilidade ou integridade de membrana dessas células. Ambas as culturas expressam somente o transportador Na+ dependente de alta afinidade EAAC1 (carreador de aminoácido excitatórios 1), sendo que sua expressão total foi similar tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias. Para verificar se a captação de L-[3H]-Glu estava ocorrendo através de outro sistema de transporte, as culturas foram incubadas na presença ou ausência de PDC (L-trans-2,4--trans-Pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid ) ou TBOA (DL-threo-β-Benzyloxyaspartic acid). O tratamento com os inibidores reduziu de forma similar a captação de L-[3H]-Glu tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias, indicando que este aminoácido é captado principalmente através do transportador de alta afinidade EAAC1. Com relação à liberação de glutamato, observou-se que 50% da radioatividade incorporada na forma de L-[3H]-Glu foi liberada para o meio extracelular tanto nas passagens recentes quanto nas tardias após 2h de incubação. Este resultado pode estar relacionado com o estabelecimento do platô do conteúdo intracelular de [3H] observado após 120 min de captação de L-[3H]-Glu. Para investigar se a liberação de L-[3H]-Glu ocorreu via transporte reverso dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade, ambas as culturas foram incubadas na presença do inibidor não transportável TBOA. Não foi observada alteração no perfil de liberação de radioatividade intracelular nas culturas após incubação com TBOA. Para verificar se a metabolização do L-[3H]-Glu estaria relacionado com a diferença nos níveis intracelulares de [3H], ambas as culturas foram incubadas com o análogo não-metabolizável D-[3H]-Asp. Tanto as passagens recentes como as tardias apresentaram um aumento tempo-dependente do conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp, não atingindo o platô. Além disso, o bloqueio dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade por PDC ou TBOA reduziu a captação de D-[3H]-Asp em ambas as culturas, indicando que sua captação ocorreu principalmente através deste tipo de transporte. Além disso, diferentemente do observado com L-[3H]-Glu, apenas 10% do D-[3H]-Asp captado é liberado após 2h de incubação em ambas as culturas. Este resultado, juntamente com a não inibição por TBOA da liberação da radioatividade captada na forma de L-[3H]-Glu, indica que possivelmente o que está sendo liberado para o meio extracelular é um metabólito marcado com [3H] e não o próprio L-[3H]-Glu. Além disso, nas passagens tardias, o conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp foi menor quando comparado com as passagens recentes aos 60 e 120 min de incubação, sugerindo que as passagens recentes possuem intrinsecamente uma maior capacidade de transporte tanto de L-[3H]-Glu quanto de D-[3H]-Asp quando comparadas às passagens tardias. Os resultados dessa dissertação demonstram que as passagens recentes e tardias da linhagem de glioma C6 diferem na sua capacidade de acumular o [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu. A maior capacidade das passagens recentes da linhagem C6 em acumular a radioatividade não está relacionada a uma maior expressão dos transportadores de glutamato e nem a uma reduzida liberação de L-[3H]-Glu para o meio extracelular. Como conclusão, os resultados obtidos nesta dissertação indicam que o número de passagens deve ser considerado em futuros estudos que pretendam avaliar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico utilizando a linhagem C6 como modelo celular. / Rat C6 lineage has been widely used to investigate several aspects of cell biology. This lineage presents morphological, biochemical and physiological variations according to number of passages in culture. Early passage cells exhibit characteristics similar to glioblastomas, whereas later passage cells resemble mature astroglia. Thus, many studies have been using C6 lineage as astroglial and glioma model to investigate several parameters related to glutamatergic system, such as glutamate uptake. However, the characterization and comparison of these parameters between C6 cultures at early and late passages have not been evaluated. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare some glutamatergic system parameters between early and late passage C6 cells in cultures. Early passages have an L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H] 55% higher when compared to later passages and both cultures reached plateau at 120 min. In addition, after incubation with glutamate, both cultures showed the same levels of propidium iodide incorporation. This result indicates that lower levels of intracellular [3H] in later passages are not due to an alteration of cellular membrane permeability. Both cultures expressed only the higher affinity Na+ dependent transporter EAAC1, and its total expression was similar in early and later passage cultures. To verify if L-[3H]-Glu uptake occurred through another kind of glutamate transport system, the cultures were incubated in the presence or absence of PDC or TBOA. Treatment with this inhibitors reduced the L-[3H]-Glu uptake in both cultures at same levels, indicating that glutamate is taken up mainly by the higher affinity transporter system. Regarding the release of glutamate, it was observed that 50% of the radioactivity incorporated as L-[3H]-Glu was released to extracellular medium in both early and late passages after 2 h of incubation. This result could be related to the establishment of the plateau observed after 120 min for intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake. To investigate if the release of L-[3H]-Glu occurred trough reverse transport, both cultures were incubated in the presence of non-transportable inhibitor TBOA. There was no alteration of intracellular radioactivity release in cultures after incubation with TBOA. In order to verify if the metabolism of L-[3H]-Glu could be related to the differences in intracellular levels of [3H], both cultures were incubated with the non-metabolizable analogue D-[3H]-Asp. Early and late passage C6 cells showed a time-dependent increase in intracellular content of [3H] derived from D-[3H]-Asp uptake, without reaching the plateau. Moreover, blockade of Na+ dependent transporters of high affinity by PDC or TBOA reduced D-[3H]-Asp uptake in both cultures, indicating that uptake occurred mainly through EAAC1. Moreover, differently from L-[3H]-Glu, only 10% of D-[3H]-Asp captured is released after 2 h of incubation in both cultures. This result, taken together with the fact that TBOA did not inhibit the release of radioactivity captured as L-[3H]-Glu, indicates that a [3H]-metabolite is being released to extracellular medium and not L-[3H]-Glu itself. Moreover, in later passages, D-[3H]-Asp-derived intracellular content of [3H] was lower when compared to early passages at 60 and 120 min of incubation, suggesting that early passage C6 cells intrinsically have a greater capacity to transport both L-[3H]-Glu and D-[3H]-Asp when compared to later passages. This study demonstrates that early and late passage C6 cells differ in their ability to accumulate L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H]. From 60 min of incubation, early passages have an intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake 55% higher in relation to later passages. This increased capacity is not related to a higher expression of glutamate transporters nether nor by reduced release of L-[3H]-Glu to extracellular medium. In conclusion, our results indicate that the number of passages should be considered in future studies that intent to evaluate parameters relating to glutamatergic system using Rat C6 lineage as cell model.

Os gliomas malignos, tumores que normalmente originam-se de células da linhagem astrocítica, são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. O Glioblastoma multiforme (GBM) é a classe mais freqüente e uma das formas mais agressivas de câncer. Como conseqüência, a sobrevivência após o diagnóstico é geralmente de menos de um ano. Desta maneira, novas estratégias terapêuticas se fazem necessárias. Durante as últimas décadas, estudos sobre compostos naturais têm tido sucesso no que diz respeito à pesquisa de agentes anti-câncer, sendo que os alcalóides aporfinóides representam uma categoria com grande potencial. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da boldina, um alcalóide aporfinóide do Peumus boldus, em linhagens de glioma, e investigar os possíveis mecanismos de ação envolvidos com este efeito. A boldina foi capaz de diminuir o percentual de células das linhagens U138-MG, U87-MG e C6. Neste estudo, observamos células necróticas após tratamento na linhagem C6. O mesmo efeito não foi observado para baixas concentrações do tratamento nas linhagens U138-MG e U87-MG. A exposição à boldina por 24 h não causou ativação das caspases 3 e 9, executoras-chave da apoptose, ou clivagem do substrato PARP. De acordo com a análise do ciclo celular, boldina induziu parada na fase G2/M. O índice mitótico também demonstrou redução no número de mitoses. O tratamento com boldina não causou dano no DNA das células U138-MG e não afetou células normais (fatias organotípicas de hipocampo de ratos) com a mesma extensão que afetou as células tumorais. De acordo com estes resultados, sugerimos que a boldina pode ser um novo composto para o desenvolvimento de estratégias anticâncer. / Malignant gliomas, tumors that usually arise from cells of astrocytic lineage, are the most common and devastating primary tumors of the central nervous system. Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent class and one of the most aggressive forms of cancer. As a consequence, survival after diagnosis is normally just less than 1 year. In this manner, new therapeutic strategies are urgently needed. During the last decades, works on natural compounds have been particularly successful in the field of anticancer drug research, and the aporphines alkaloids represent an interesting, potencially useful category of this agents. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of boldine, an aporphine alkaloid of Peumus boldus, in glioma cell lines, and investigate the possible mechanisms involved in this effect. Boldine was capable to decrease the percentage of cells in U138-MG, U87-MG and C6 glioma lineages. In this study we observed necrotic cells in C6 lineage after treatment. The same effect was not seen in low concentrations of treatment in U138-MG and U87-MG lineages. The exposure to boldine for 24 h did not result in increase of the activation of caspase-3 and caspase-9, key executioners in apoptosis. No increase in cleavage of the downstream substrate PARP was observed. According to cell cycle analysis, boldine appeared to induce G2/M arrest in U138-MG cells. Mitotic index also showed a reduction in the percentage of cells in mitosis. The treatment with boldine did not caused DNA damage in U138-MG cells and did not affect normal cells (rat organotypic hippocampal slices) to the extent that it affects tumor cells. According to these results, we suggest that boldine could be a new compound to the development of anticancer therapies.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

A fibrose e a cirrose hepática são doenças crônicas do fígado que representam uma das maiores causas de mortalidade humana. A GRX é uma linhagem representativa das células estreladas hepáticas (HSC), que estão associadas ao desenvolvimento da fibrose que, em último estágio, acarreta em cirrose. No fígado saudável, estas células apresentam um fenótipo quiescente ou lipocítico, caracterizado pela sua capacidade de armazenar gotas lipídicas. Danos contínuos ao fígado desencadeiam uma resposta que gera estímulos autócrinos e parácrinos mediados por citocinas e espécies reativas de oxigênio. Este quadro leva a uma modulação destas células ao fenótipo ativado ou miofibroblástico, relacionada com um aumento da capacidade de produzir componentes de matriz extracelular, cuja deposição exagerada configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas, ao qual são atribuídos inúmeros efeitos benéficos devido a sua capacidade antioxidante, antiproliferativa e pró-apoptótica.Recentemente, tem se discutido um possível efeito pró-oxidante desta molécula em alguns sistemas celulares. O presente estudo mostra que a dose de 50 μM de RSV induziu uma diminuição da viabilidade e da proliferação celular nas células GRX devido a um efeito pró-oxidante observado nas primeiras 24 horas de tratamento. Essas alterações foram atenuadas ao longo de 120 horas de exposição. Observamos um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) e uma diminuição da atividade da catalase (CAT) no grupo que recebeu 50 μM de RSV em 120 horas de tratamento, que resulta em um desequilíbrio na atividade de ambas enzimas e possivelmente gera uma produção alta de H2O2. As células que receberam 50 μM de RSV apresentaram dano mediado por lipoperoxidação, tanto em 24 horas quanto em 120 horas de exposição, embora este parâmetro tenha sido menor no modelo crônico. De maneira complementar, avaliamos os efeitos do RSV sobre os parâmetros de migração das células GRX. Observamos um aumento na capacidade de migração destas células já nas primeiras 8 horas de exposição às doses de 1, 10 e 50 μM de RSV. Estes resultados mostraram que o RSV induz um aumento de migração e uma adaptação das células GRX que sobrevivem ao choque tóxico das primeiras 24 horas. / Fibrosis and hepatic cirrosis are chronic diseases of the liver, standing for one of the highest causes of human mortality. GRX cell line is representative of hepatic stellate cells (HSC) that are associated to fibrosis development which, at its last stage, turns into cirrosis. In a healthy liver, such cells present a quiescent or lipocytic phenotype, characterized by its capacity to store lipid droplets. Continuous injuries to the liver generate autocrine and paracrine stimuli mediated by cytokines and reactive oxygen species (ROS). This may cause modulation to the activated or myofibroblastic phenotype, related to an increase of cells capacity to produce matrix components which excessive deposition is responsible for the pathologic condition of fibrosis. Resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic capacity. Recently, a possible pro-oxidant effect of this molecule in some cell systems has been put into discussion. The present study shows that 50 μM of RSV induced a decreased cell viability and proliferation of GRX cells due a pro-oxidant effect during the first 24 hours of treatment. These alterations were attenuated during 120 hours of exposure. We observed an increased SOD activity as well as a decreased CAT activity, in the 50 μM RSV-treated group at 120 hours of treatment, leading to an imbalance in the ratio of both enzymes activities, and possibly resulting in an over-production of H2O2. The cells that received 50 μM RSV presented oxidative damage, mediated by lipoperoxidation, at 24 hours as well as at 120 hours, although some of these parameters were smaller in the chronic model. Additionally, we evaluated RSV effects on the GRX cell migration. We observed an increase in the migration capacity of these cells during the first 8 hours of exposition to the 1, 10 and 50 μM RSV. Such results demonstrate that RSV induces migration increase as well as an adaptation of GRX cells which survive the first 24-hour toxic shock.

OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular. / AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.

A presença de Ad com competência para replicar (RCA, replication-competent adenovirus) nas preparações é um dos maiores problemas para a produção de Ad em larga escala. RCAs são gerados pela recombinação entre seqüência do vetor e seqüência homóloga do gene E1 presente nas células helper. Objetivo: desenvolver uma nova linhagem auxiliar para produção de Ad livre de RCA - LEY79 - derivada da linhagem de retinoblastoma humano Y79, tratando-se da primeira linhagem empacotadora de adenovírus com inativação mutacional da proteína supressora de tumor pRb, que crescem em suspensão. Células Y79 foram infectadas com o retrovírus pCLDE1A/E1BSN, selecionadas com G418. A eficiência de produção de AdeGFP na linhagem LEY79 foi testada e comparada com a HEK293A. Células Y79 foram adaptadas em meio livre de soro. Esperamos com a linhagem LEY79SF inovar no campo de processos para a produção de Ad recombinante. / The presence of Ad with the ability to replicate (RCA, replication-competent adenovirus) in preparations is a major problem in the large-scale production of Ad. RCAs are generated by recombination between the vector sequence and sequence of the homologous gene in E1 helper cells. Objective: To develop a new helper cell line for the production of RCA-free Ad., called LEY79, derived from the Y79 of human retinoblastoma line, the first line Packer adenovirus with mutational inactivation of the tumor suppressor protein pRb, which are adapted to grow in suspension. Y79 cells were infected with the retrovirus pCLDE1A/E1BSN, selected with G418. The efficiency of production of AdeGFP in the LEY79 was tested and compared with the HEK293A. Y79 cells were adapted to grow in serum-free medium. We hope that use of the the LEY79SF cell line will promote innovation in the processing and production of recombinant Ad.

A presença de Ad com competência para replicar (RCA, replication-competent adenovirus) nas preparações é um dos maiores problemas para a produção de Ad em larga escala. RCAs são gerados pela recombinação entre seqüência do vetor e seqüência homóloga do gene E1 presente nas células helper. Objetivo: desenvolver uma nova linhagem auxiliar para produção de Ad livre de RCA - LEY79 - derivada da linhagem de retinoblastoma humano Y79, tratando-se da primeira linhagem empacotadora de adenovírus com inativação mutacional da proteína supressora de tumor pRb, que crescem em suspensão. Células Y79 foram infectadas com o retrovírus pCLDE1A/E1BSN, selecionadas com G418. A eficiência de produção de AdeGFP na linhagem LEY79 foi testada e comparada com a HEK293A. Células Y79 foram adaptadas em meio livre de soro. Esperamos com a linhagem LEY79SF inovar no campo de processos para a produção de Ad recombinante. / The presence of Ad with the ability to replicate (RCA, replication-competent adenovirus) in preparations is a major problem in the large-scale production of Ad. RCAs are generated by recombination between the vector sequence and sequence of the homologous gene in E1 helper cells. Objective: To develop a new helper cell line for the production of RCA-free Ad., called LEY79, derived from the Y79 of human retinoblastoma line, the first line Packer adenovirus with mutational inactivation of the tumor suppressor protein pRb, which are adapted to grow in suspension. Y79 cells were infected with the retrovirus pCLDE1A/E1BSN, selected with G418. The efficiency of production of AdeGFP in the LEY79 was tested and compared with the HEK293A. Y79 cells were adapted to grow in serum-free medium. We hope that use of the the LEY79SF cell line will promote innovation in the processing and production of recombinant Ad.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: Laura Cristina Sichero Vetorazzo / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Resumo: A hepatite C é a inflamação do fígado decorrente da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), frequentemente evolui para quadros crônicos, sendo considerada mundialmente a maior causa de cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento padrão com PEG-IFN e ribavirina não é efetivo contra alguns genótipos do HCV, possui alto custo e efeitos colaterais severos. Portanto, novos tratamentos vêm sendo buscados. A cafeína vem sendo associada a um efeito benéfico sobre várias doenças hepáticas incluindo a melhora da bioquímica anormal do fígado, cirrose e carcinoma hepatocelular. A cafeína atua diretamente desacelerando a progressão da fibrose, além de melhorar a função de vias celulares hepáticas, dentre elas vias utilizadas durante o ciclo replicativo do HCV. Embora a cafeína tenha demonstrado efetividade no controle de doenças hepáticas e interação direta com vias celulares utilizadas pelo HCV, não há na literatura correlação direta entre o efeito da cafeína e as etapas do ciclo replicativo do HCV. Assim, o presente estudo propôs estabelecer a relação direta entre a cafeína e sua capacidade inibitória sobre as diferentes etapas do ciclo replicativo completo do HCV. Para esse estudo foram utilizados o replicon subgenômico SGR-JFH-FEO, os replicons completos FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi e JFH-1 e a linhagem celular Huh-7.5. A expressão viral foi avaliada por ensaios de Luciferase, Western Blotting, Imunofluorescencia indireta e qPCR. A cafeína demonstrou inibição da replicação viral em todos os níveis avaliados, apresentando IC50 de 0.7263 mM e atingindo em concentrações seguras, inibição máxima da replicação de HCVcc em torno de 79 %. A cafeína demonstrou ainda inibição de 30 % sobre a entrada quando aplicada em conjunto ao sobrenadante infeccioso. Entretanto, essa inibição dobra quando há a exposição das partículas à cafeína previamente à introdução em cultura de células, ... / Abstract: Hepatitis C is the liver inflammation arising from hepatitis C virus (HCV) infection, often evolves to chronic conditions and has been considered the major world cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Standard treatment using PEG-IFN and ribavirin is not effective against some HCV genotypes, besides that it has high cost and severe side-effects. Therefore, new treatments have been sought. Caffeine has been found to have beneficial effect in several liver disorders, including the improvement of abnormal liver biochemistry, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Caffeine acts directly by delaying fibrosis, beyond improving the function of liver cellular pathways and interfering with pathways used by the HCV replication cycle. Although, the caffeine showed positive effects for liver disorders and a direct interaction with cell pathways used by HCV, there is no evidence of a direct correlation between caffeine and HCV replication cycle. Thus, the current study proposed to establish the direct relationship between caffeine and different steps of HCV replication cycle. To this study, it was used the subgenomic replicon SGR-JFH-FEO, the full-length replicons FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi and JFH-1; and Huh-7.5 cell line. The viral expression was evaluated by Luciferase, Western blotting, Indirect immunofluorescence and qPCR. The caffeine demonstrated to be able to inhibit viral replication on different stages of viral replication, demonstrating an IC50 value of 0.7263 mM and reaching on safe concentrations, HCVcc maximal replication inhibition around 79 %. Caffeine demonstrated also 30 % of inhibition on viral entry on host cells when tested in combination with infectious supernatant. Moreover, this inhibition increased two fold when particles were exposed to caffeine before introduction on cell culture, possibly, indicating an interaction between caffeine and viral proteins. On the other hand, there is no influence of caffeine on viral ... / Mestre

O núcleo é uma estrutura organizada e possui verdadeiras organelas nucleares. Entre elas, estão os nucléolos e os corpúsculos de Cajal (CBs). Estes compartimentos nucleares são estruturas dinâmicas, mantidos pela associação de macromoléculas envolvidas na expressão gênica que interagem entre si delimitando-as. A principal proteína encontrada nos CBs é a p-80-coilin e, portanto, o principal epítopo capaz de marcar essas estruturas. Suas funções específicas ainda tem sido alvo de estudo. Existe uma proteína em comum a ambas as estruturas, a fibrilarina que participa no processamento de rRNA. Estes corpúsculos já foram descritos na periferia dos nucléolos ou mesmo fisicamente ligados a ele. Acredita-se que os corpúsculos de Cajal participem da síntese de rRNA, maturação, transporte e associação das subunidades ribossômicas.Diante esta relação, este trabalho visa estudar a inter-relação entre estas estruturas em células normais e as respectivas linhagens de células tumorais em cultura antes e após tratamentos com actinomicina D. Esta droga se usada em baixas concentrações, bloqueia a transcrição dos genes que foram decodificados pela RNA polimerase I e II, e -amanitin, por sua vez bloqueia a transcrição de genes decodificado pela RNA polimerase II . Além disso, também visa investigar uma relação entre a proliferação das linhagens estudadas e freqüência dos corpúsculos de Cajal nas células controle e tratadas. O microscópio confocal de varredura a laser permitiu o estudo dessas estruturas em preparações imunofluorescência fornecendo uma análise tridimensional destas estruturas quando utilizados anticorpos específicos. Linhagens de células que apresentaram um crescimento mais lento foram aquelas que tinham uma maior freqüência de corpúsculos por núcleo. Por outro lado, aquelas que apresentaram um crescimento mais intenso, foram aquelas que apresentaram maior variação no número de corpúsculos por núcleo. Após o tratamento com inibidores de síntese de RNA, tanto os corpúsculos de Cajal quanto os nucléolos, apresentaram alterações morfológicas, às vezes apresentando um grande acúmulo na região dos corpúsculos ou desorganizando os nucléolos. Mudanças no tamanho e forma também puderam ser destacadas. / The nucleus is a structure that has sub-compartments which can be called nuclear organelles. Among them, may be cited the nucleoli and the Cajal bodies (CBs). These nuclear compartments are dynamic structures, maintained by association and stock of macromolecules involved in gene expression. The main protein found in the CB is a p-80-coilin and therefore the main epitope able to label these structures. Their functions are still to be clarified. There is a protein in common to the nucleolus and Cajal bodies, the fibrillarin that takes part in the processing of rRNA. The CBs can be found at the periphery of the nucleoli or even physically connected to them. It is believed that the CBs may have role in the synthesis of rRNA and maturation, transport and association of ribosome subunits. In view of this relationship between Cajal bodies and nucleoli, this work aims to study the interrelationship between these structures in normal cells and their respective tumor cell line in culture before and after treatments with actinomycin D, which in low concentrations, blocks the transcription of genes that were decoded by the RNA polymerase I and II and -amanitin, which is responsible for blocking the transcription of genes decoded by the RNA polymerase II and find out a relationship between cell proliferation and Cajal bodies frequencies in control and treated cells. The confocal microscope of laser scanning enabled the study of these structures in preparations immunofluorescent providing a three-dimensional analysis of these structures when used specific antibodies before and after treatment. Cell lines that shown low cell grow, appears to have lass CB/ nucleus in the other hand, cell lines that have fastest grow shown nuclei with more Cajal bodies frequencies and more variation in the number of Cajal/nucleus After treatment with inhibitors, both Cajal bodies as nucleoli, made quite clear morphological changes, sometimes giving large accumulation of proteins in organelles and sometimes appeared disorganized in the nucleoplasm. Changes in the size and shape were also highlighted. The tumor cell lines also showed changes compared to their normal cell type.

Introdução: Um dos principais obstáculos para compreensão dos eventos biológicos envolvidos no câncer é a falta de modelos adequados para o estudo in vitro em especial em relação ao câncer de próstata (CaP) e ao câncer de bexiga (CaB). Há um número limitado de linhagens celulares de CaP e de CaB sendo a maioria proveniente de tumores invasivos e metastáticos. Sabe-se ainda, que existem diferenças étnicas entre as populações quanto ao comportamento de neoplasias. Desta forma, a pesquisa baseada em linhagens de uma população homogênea seria fonte de resultados limitados, não contemplando a diversidade que sabidamente ocorre entre os diferentes grupos. Além desse aspecto, as linhagens celulares comerciais são na sua maioria adquiridas na Coleção Americana de Culturas de Tecido (ATCC, do inglês American Tissue Cell Culture) que apesar de serem bem padronizadas, requerem processos de importação com aumento do custo e demandas burocráticas que dificultam a pesquisa. Portanto, consideramos vital para a compreensão dos fenômenos relacionados à carcinogênese, assim como estudos de resistência a drogas, quimioprevenção e novas estratégias terapêuticas, o desenvolvimento de linhagens tumorais derivadas de tumores primários que acometem a nossa população, peculiarmente miscigenada. No presente trabalho, fragmentos de carcinoma urotelial da bexiga e de adenocarcinoma da próstata foram obtidos durante cirurgia para remoção de tumores primários de pacientes tratados e acompanhados na Divisão de Urologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) e no Hospital Sírio Libanês. As linhagens estabelecidas a partir destes fragmentos foram caracterizadas através da análise da cinética de crescimento, análises imunocitoquímicas e anormalidades cromossômicas incluindo cariótipo e hibridização in situ por fluorescência (FISH). Além disso, as linhagens obtidas foram submetidas a estudos de quimiossensibilidade com o uso dos compostos curcumin e Prima-1. Avaliamos ainda, a tumorigenicidade de nossas linhagens em camundongos atímicos. Os resultados deste trabalho demonstram o desenvolvimento de três linhagens de CaB e três linhagens de CaP sendo as mesmas não tumorigênicas em camundongos atímicos. Além disso, demonstramos que o curcumin na concentração de 50 M induziu morte celular em todas as linhagens estudadas, sendo seu efeito mais evidente nas linhagens de CaP. Por fim, Prima-1 reduziu a viabilidade celular independente do status de p53 nas linhagens de CaB / Introduction: One of the main obstacles for understanding biological events involved in cancer is the lack of appropriated models for in vitro studies especially for prostate cancer (PC) and bladder cancer (BC). There are a limited number of PC and BC cell lines being the majority originated from metastatic and invasive tumors. Also it is well known that there are ethnic differences between populations concerning the behavior of tumors. In such a way, the research based on cell lines derived from a homogenous population should be source of limited results, not contemplating the diversity known to occur among different groups. In addition the commercial cell lines are generally acquired at American Tissue Cell Culture (ATCC) that although wellestablished requires importation processes with cost increase and bureaucratic demands that difficult the research. Therefore we consider vital to the comprehension of the carcinogenesis phenomena, as well as drug resistance studies, chemoprevention and new therapeutic strategies, the development of tumor lineages derived from primary tumors that assail our miscigenated population. At the present work, fragments of bladder urothelial carcinoma and prostate adenocarcinoma were obtained by surgical resection of primary tumors from patients treated and followed in the Division of Urology of the Clinical Hospital of the São Paulo University (FMUSP) and Syrian Lebanese Hospital. The cell lines established from these fragments were characterized through growth kinetic, immunocytochemistry and chromosome abnormalities including karyotyping and Fluorescence in situ hybridization (FISH). Moreover, the cell lines were submitted to chemosensitivity studies using curcumin and Prima-1 and analyzed regarding their tumorigenicity in athymic mice. The results of this work show the development of three BC and three PC cell lines that were not tumorigenic in athymic mice. Curcumin at 50 M concentration induced cell death in all studied lineages, being more effective in PC cell lines. Finally, PRIMA-1 reduced the cellular viability independent of the p53 status in BC cell lines