L’oxaliplatine (OXA) est un anticancéreux couramment employé en oncologie, son efficacité étant reconnue en première ligne dans le traitement de nombreux cancers. Cependant, son utilisation est limitée par l’apparition de neuropathies impactant la qualité de vie du patient. Pour identifier et étudier des marqueurs cliniques, plasmatiques et électrochimiques de neuropathie chronique induite par l’oxaliplatine (NPIO), deux études pilotes (LIPIDOXA et CANALOXA) ont été réalisées. Les patients de l’étude LIPIDOXA ont été inclus avant traitement par OXA et ont été évalués avant traitement, tout au long du traitement et six mois après l’arrêt. Entre mai 2014 et juin 2016, 35 patients ont été inclus. L’apparition d’une hypoesthésie thermique a été mise en évidence six mois après arrêt de l’OXA, révélateur d’un processus neurotoxique qui se poursuit même après l’arrêt du traitement. L’étude des marqueurs plasmatiques a révélé, en fin de traitement, une augmentation de la production de prostaglandines E2, un niveau moins élevé de stress oxydant chez les patients souffrant d’une neuropathie de grade 2 ainsi qu’une diminution de la concentration des triglycérides polyinsaturés associée à une tendance à l’augmentation des acides gras libres polyinsaturés. Les patients de l’étude CANALOXA, tous neuropathiques, ont été inclus en cours de traitement par OXA et évalués une seule fois. Entre avril 2016 et mars 2017, 36 patients ont été inclus. Les valeurs des conductances électrochimiques de la peau (ESC) étaient pathologiques pour un tiers des patients. Les valeurs d’ESC étaient bien corrélées avec le score de douleur neuropathique.Ces marqueurs sont cependant peu spécifiques et semblent d’apparition tardive. Aussi, ils sont difficilement utilisables en pratique clinique pour un éventuel suivi de la tolérance neurologique au traitement. Au-delà de l’apport clinique et thérapeutique modéré, ce travail renforce la compréhension de la physiopathologie de la NPIO dans le domaine de la neuropathie à petites fibres, les processus inflammatoires associés et la perturbation du métabolisme lipidique chez le patient traité par oxaliplatine.La complémentarité et les similarités de ces travaux rappellent que la prise en charge du patient doit être globale et conjuguer des éléments variés au sein desquels le patient doit rester au cœur de la gestion de la NPIO. Ce projet de recherche s’inscrit dans une dynamique d’amélioration continue et les résultats des études pilotes constituent une base pour approfondir les travaux. / Oxaliplatin (OXA) is an anti-cancer drug widely used in oncology, its effectiveness is recognized in first-line chemotherapy regimen in many cancers. However, its use is limited by an onset of a disabling peripheral neuropathy with a negative association with quality of life. To identify and study clinical, plasma and electrochemical markers of oxaliplatin-induced chronic neuropathy (OIPN), two pilot studies (LIPIDOXA and CANALOXA) were conducted.Patients in the LIPIDOXA study were included prior to OXA treatment and were evaluated before treatment, during treatment, and six months after discontinuation. Between May 2014 and June 2016, 35 patients were included. The onset of thermal hypoaesthesia was highlighted six months after OXA completion, revealing a neurotoxic process that extends beyond treatment. The study of plasma markers revealed, at the end of treatment, an increase of prostaglandins E2 release, a lower level of oxidative stress in patients suffering from grade-2 neuropathy as well as a decrease in the concentration of polyunsaturated triglycerides associated with a tendency in polyunsaturated free fatty acids increase. The patients in the CANALOXA study, all neuropathic, were included during treatment with OXA and evaluated once. Between April 2016 and March 2017, 36 patients were included. The values of the electrochemical conductances of the skin (ESC) were pathological for one third of patients. ESC values were well correlated with the neuropathic pain score.However, these markers are sparsely specific and seem to be of late onset. Thus, they are are not suitable for a possible monitoring of the neurological tolerance of the treatment in the current care practice. Beyond the moderate clinical and therapeutic contribution, this work strengthens the understanding of the pathophysiology of OIPN in the field of small-fiber neuropathy, the associated inflammatory processes and the disruption of lipid metabolism in the patient treated with oxaliplatin.The complementarity and similarity of this work remind us that the patient care must be global and combine various elements in which the patient must remain at the heart of the management of the OIPN. This project takes part in a dynamic of continuous improvement and the results of these pilot studies constitute the basis for further research in this field.

Pre-treatment with polyunsaturated fatty acids or bioactive lipid mediators has been shown to reduce neuronal injury in rodent models of focal ischaemia, but the molecular mechanisms underlying this neuroprotection are unclear. In this study, we aimed to investigate whether systemic administration of alpha linolenic acid (ALA) leads to changes in the profile of mouse brain phospholipid and bioactive lipid mediators in both mouse brain and plasma within the previously determined neuroprotection time window. Mass spectrometry (MS) and tandem mass spectrometry (MS/MS) allowed us to detect and identify 47 phospholipids in mouse cerebral cortex, including several phospholipid species not previously reported in brain lipidomic studies. These included a phosphatidylethanolamine species with m/z 720 that has been associated with retinal stem cells. No widespread changes in cerebral cortex phospholipid composition were observed following intravenous ALA. Several significant changes in lipid mediators (P<0.05 with two-way ANOVA and post hoc Dunnett¿s t test) were detected in ALA-treated animals compared to untreated and vehicle-injected animals. Many of the affected lipid mediators are ligands for prostanoid receptors which have been demonstrated to play a role in the development of brain injury following cerebral ischaemia, implying that changes in bioactive lipid mediators or modulation of prostanoid receptors may occur following ALA pre-treatment in mice. This study illustrates the potential of advanced lipidomic analysis as a novel tool for neurochemists.

La photothérapie dynamique (PDT) consiste à injecter un photosensibilisateur (PSr) au patient, puis à illuminer sa tumeur. En présence d’oxygène, le PSr activé entraîne la formation d’oxygène singulet cytotoxique. Nos collaborateurs à l’Institut Curie ont synthétisé des dérivés porphyriniques glycoconjugués(TPP) pour traiter le rétinoblastome par PDT.Des études de caractérisation de ces TPP in vitro ont montré une internalisation dans la cellule par voie passive. C’est dans ce contexte que nous avons analysé l’interaction de certaines TPP avec les lipides membranaires.Dans un premier temps, cette interaction a été étudiée par une approche chromatographique sur des colonnes C18/C8, PolarTec, HILIC et IAM. Nous avons démontré une variation de l’interaction selon la structure des TPP. Par la suite, nous avons mis en évidence par DSC, les changements d’organisation de bicouches phospholipidiques produits par deux TPP d’intérêt, et déterminé par FTIR-ATR, la localisation de la perturbation au niveau des têtespolaires ou des chaines aliphatiques des lipides.Cette approche a été poursuivie par l’évaluation de la localisation des TPP à l’échelle cellulaire,par microspectroscopie IR couplée au rayonnement synchrotron. Une discrimination des TPP a été mise en évidence par des outils chimiométriques pour les cellules Y79, mais pas pour les lignées WERI-Rb1 ni ARPE-19. Afin de développer un modèle membranaire artificielde rétinoblastome, nous avons réalisé par spectrométrie de masse (Orbitrap) une analyse lipidomique approfondie des phospholipides des membranes plasmiques et mitochondriales des lignées Y79 et ARPE-19,. Nous avons analysé les propriétés visco-élastiques des extraits membranaires et proposé un modèle artificiel complexe mimant au moins partiellement ces propriétés. Ce modèle pourrait permettre le criblage in vitro des TPP. / Photodynamic therapy (PDT) is atreatment modality in which a photosensitizer(PSr) is injected to a patient. Then the tumor isilluminated with a laser. The excited PSrinduces the production of cytoxic singletoxygen. Our collaborators at the Institut Curiehave synthesized glycoconjugated tetraphenylporphyrins(TPP) for the treatment ofretinoblastoma by PDT. These compoundswere characterized in vitro and studies showedthat the most promising porphyrin crossed thecell membrane by passive transport. It is in thiscontext that this research was developed: theobjective was to study the interaction of aseries of porphyrins with membrane lipids.Firstly, porphyrin interaction with lipids wasstudied by a chromatographic approach onC18/C8, PolarTec, HILIC and IAM columns.Results showed a variation in the interactionaccording to porphyrin structures.Then, we demonstrated the effect of two TPPson phospholipid bilayers organization by DSC,and determined the localization of thisinteraction (polar heads or lipid aliphaticchains) by FTIR-ATR. The effect of TPPs onlipids and proteins was studied at the cellularlevel by IR microspectroscopy coupled withsynchrotron radiation. A discrimination ofporphyrins could be made by chemometrictools for Y79 cells but not for WERI-Rb1 norARPE-19 ones. In order to develop an artificialmembrane model, we performed lipidomicanalysis by mass spectrometry (Orbitrap) ofplasma and mitochondrial lipid membranes ofY79 and ARPE-19 cells. We determined theviscoelastic properties of lipid extracts andproposed an artificial lipid model partiallymimicking these viscoelastic properties. Thismodel could allow TPP screening in vitro.

This work expands the knowledge on phospholipid metabolism in the kinetoplastid parasites: T. brucei, T. cruzi, Leishmania spp. that cause neglected tropical diseases and the related non-human pathogenic Crithidia fasiculata. As a close relative of parasitic kinetoplasts, specifically Leishmania, it is hypothesised that Crithidia fasiculata possesses a similar lipid biosynthetic capability and therefore represent an attractive model organism. Database mining the Crithidia genome revealed the ability to biosynthesise all of the main phospholipid species. Utilising various lipidomic techniques, a high level of an ω-6 18:3 fatty acid was observed, alongside an uncommon Δ19:0 fatty acid that was later identified to be exclusive attributed to PE species. Sphingolipid metabolism was shown to resemble that of Leishmania and T. cruzi, given the exclusive production of inositol-phosphoceramide species and no sphingomyelin species being observed. Using labelled precursors, Crithidia were seen to uptake and incorporate extracellular inositol into both phosphatidylinositol and inositol-phosphoceramide species. Crithidia were also shown to utilise both the Kennedy pathway and methylation of phosphatidylethanolamine to form phosphatidylcholine. The phospholipidome of T. cruzi revealed several phosphatidylserine species for the first time, suggesting a functional phosphatidylserine synthase. Current knowledge of T.cruzi sphingolipid biosynthesis was also confirmed as only inositol xxxi phosphoceramide species were observed. The identification and subsequent characterisation of novel phosphonolipid species are reported for the first time. Utilising lipidomic methodologies and labelled precursors, the relative contribution of the intracellular inositol pools within bloodstream and procyclic T. brucei towards PI biosynthesis was examined. This highlighted that the synthesis/turnover rates for specific phosphatidylinositol and inositol-phosphoceramide species are unequal. Efforts to optimise media conditions highlighted that under reduced levels of serum/glucose/inositol, bloodstream T. brucei unexpectedly adjusts its inositol metabolism. The procyclic parasite exemplifies this fact, as under inositol/glucose deficient media conditions they appear to have adapted to utilising glucogenesis and inositol de-novo synthesis. This work highlights that these parasites are rapidly dividing, their unique features of lipid metabolism may be exploitable for drug discovery purposes.

Le palmier à huile est la première culture oléagineuse, avec environ 40% de la production mondiale, et son fruit accumule deux huiles de composition très différente dans le mésocarpe et l’amande. Chez les plantes, les acides gras sont assemblés en huile dans le réticulum endoplasmique, ceci par la voie dite de Kennedy à laquelle s’ajoutent des mécanismes d’édition impliquant le métabolisme de la phosphatidylcholine. Nous avons utilisé les outils de la lipidomique pour analyser la variabilité au sein de différentes populations de palmier ainsi que pour caractériser l’accumulation d’huile durant le développement du mésocarpe et de l’amande. Puis, nous avons entrepris de tester, dans le système du double hybride de levure, les interactions entre toutes les enzymes de la voie de Kennedy et celles responsables des mécanismes d’édition, et mis en évidence 241 interactions, dont 132 sont fortes, 73 moyennes et 36 faibles. Ces résultats suggèrent que ces enzymes pourraient s’assembler en complexes supra-moléculaires susceptibles de former des métabolons. Certaines isoformes d’une même enzyme ont des profils d’interaction distincts, ce qui ouvre des perspectives pour de futures recherches. De plus, nous avons caractérisé, par expression fonctionnelle dans un mutant de levure dépourvu de TAG, une acyltransférase présumée (EgWSD1-like) ainsi que les trois formes majeures de diacylglycérol acyltransférases du mésocarpe. EgWSD1-like ne restaure que l’activité de synthèse d’esters de cire dans le mutant, tandis que les trois DGAT complémentent toutes la déficience en TAG du mutant, avec d’apparentes spécificités distinctes vis-à-vis des acides gras. / Oil palm is the highest oil-yielding crop-plant, accounting for approximately 40% of the total world vegetable oil production. The fruit accumulates oil, made of triacylglycerol (TAG) molecules, in both mesocarp and kernel with totally different fatty acid profiles. Fatty acids are assembled into oil through Kennedy pathway in the endoplasmic reticulum, which is complicated by editing processes involving phosphatidylcholine metabolism. To investigate oil assembly in oil palm, we use lipidomics as a tool to analyze different populations of palm to search for TAG structural diversity, and to further characterize changes in lipid content and composition in mesocarp and kernel during fruit ripening. We used yeast two-hybrid system (split ubiquitin) to test protein-protein interactions for almost all the enzymes (32) involved in oil assembly pathway, and we demonstrated 241 interactions, including 132 strong interactions, 73 medium interactions and 36 weak interactions. Our results suggest that all enzymes might assemble into one or several complexes that may form metabolons. In addition, different isoforms of enzymes showed distinct interaction profiles, providing hints for future studies. Moreover, we also characterized the in vivo function of a putative acyltransferase (designated EgWSD1-like) possibly involved in oil assembly and the three major diacylglycerol acyltransferase (DGAT) isoforms of palm mesocarp in the mutant yeast H1246, which is devoid of neutral lipid synthesis. EgWSD1-like only shows wax ester synthase activity in yeast, while three EgDGATs all can restore TAG biosynthesis in yeast with different substrate specificities.

Projet I : Les endospores représentent un état de dormance des bactéries leur permettant de résister à des conditions extrêmes et de persister pendant des années. La formation d'endospores a façonné l'évolution puisqu’elle se produit exclusivement chez les Firmicutes. Plusieurs études ont rapporté la formation d'endospores chez des espèces en dehors des Firmicutes, en particulier chez deux espèces de Protéobactéries, Rhodobacter johrii et Serratia marscescens, et une espèce d'Actinobacteries, Mycobacterium marinum. Le fait d’identifier les endospores en dehors des Firmicutes pourrait affecter la forme de l'arbre de vie et aiderait dans notre lutte contre les agents pathogènes humains. Par conséquent, nous avons visé d’étudier l'endosporulation chez ces trois espèces en utilisant des approches avancées d'imagerie et d'analyse, y compris la microscopie corrélative alliant la microscopie optique et électronique (CLEM), la tomographie de cryo- électron (cryo-ET) et la lipidomique. Nous avons utilisé la bactérie sporulante bien caractérisée Bacillus subtilis comme contrôle positif de la sporulation. L'examen de R. johrii, S. marcescens et M. marinum en utilisant CLEM et cryo-ET a montré que les objets à phase brillante ne ressemblaient à aucun stade de l'endosporulation. Les cryo-tomogrammes ont montré que les objets à phase brillante chez S. marcescens étaient des débris cellulaires agrégés de cellules mortes, alors qu'ils présentaient des structures granulaires typiques des cellules bactériennes chez les R. johrii et M. marinum. L'analyse lipidomique chez R. johrii a identifié les structures granulaires comme des granules de stockage potentiels enrichis en triacylglycérides (TAG). Nous pensons que les TAG peuvent fournir une source d'énergie pour résister à l'épuisement des nutriments. Des approches biochimiques et bioinformatiques supplémentaires ont soutenu nos conclusions selon lesquelles R. johrii, S. marcescens et M. marinum sont des bactéries non sporulantes. Projet II : Les plasmides jouent un rôle vital dans la propagation des gènes de résistance au sein et entre les espèces bactériennes. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les systèmes bactériens impliqués dans le transfert et la maintenance des plasmides pour mieux aider dans notre lutte contre la propagation de la résistance aux antibiotiques. Dans cette thèse de doctorat, nous avons cherché à caractériser l'opéron alp7ARC, en utilisant l'homologue de l'actine bactérienne Alp7A pour séparer le plasmide pLS20 codant pour la résistance à la tétracycline dans B. subtilis. La stabilité du plasmide s'est avérée dépendante de l'opéron alp7ARC, indiquant un rôle essentiel dans la ségrégation plasmidique. Nos résultats préliminaires sur Alp7A ont montré qu'il s'assemble dans une nouvelle nanostructure tubulaire plutôt que des filaments, suggérant un nouveau mécanisme de ségrégation de l'ADN par Alp7A. Nous avons également étudié la structure d'Alp7A in vivo en utilisant une combinaison d'approches, notamment la biologie moléculaire, la Cryo-ET et la fLM. Nous avons également utilisé la CLEM pour localiser Alp7A dans des cellules entières à une résolution macromoléculaire. En outre, nous avons étudié la structure et la fonction d'Alp7A in vitro en transfectant B. subtilis et E. coli avec diverses constructions plasmidiques incorporant des mutations dans le gène d’Alp7A. Nous avons déployé différentes méthodes pour la purification de la protéine Alp7A, y compris la séparation par chromatographie, et le fractionnement au sulfate d'ammonium. J'ai discuté des divers défis que nous avons rencontrés dans ces expériences, tels que la contamination, l'instabilité de la protéine Alp7A et l'épaisseur bactérienne. Enfin, j'ai proposé des approches expérimentales alternatives qui aideraient à étudier le mécanisme de ségrégation des plasmides par Alp7ARC. / Project I: Endospores represent a dormant state of bacteria that allows them to withstand extreme conditions and persist for years. Endospore formation has shaped evolution, whereby it exclusively occurs in Firmicutes. Several studies have reported endospore formation in species outside of Firmicutes, particularly in two species of Proteobacteria, Rhodobacter johrii and Serratia marcescens, and one species of Actinobacteria, Mycobacterium marinum. Identifying endospores outside of Firmicutes would affect the shape of the tree of life and aid in our fight against human pathogens. Therefore, we aimed to investigate endosporulation in these three species using advanced imaging and analytical approaches, including correlative light and electron microscopy (CLEM), cryo-electron tomography (cryo-ET), and lipidomics. We used the well-characterized sporulating bacterium Bacillus subtilis as a positive control of sporulation. Examination of R. johrii, S. marcescens, and M. marinum using CLEM and cryo-ET showed that phase-bright objects did not resemble any stages of endosporulation. Cryo-tomograms revealed that the phase-bright objects in S. marcescens were aggregated cellular debris of dead cells, whereas they displayed granular structures typical of bacterial cells in R. johrii and M. marinum. Lipidomic analysis in R. johrii identified the granular structures as potential storage granules enriched with triacyl-glycerides (TAGs). We speculate that TAGs may provide an energy source to withstand the nutrient depletion. Additional biochemical and bioinformatics approaches supported our conclusions that R. johrii, S. marcescens, and M. marinum are non-sporulating bacteria. Project II: Plasmids play a vital role in the spread of resistance genes within and across bacterial species. Therefore, it is essential to understand the bacterial systems involved in the transfer and maintenance of plasmids to better aid in our fight against the spread of antibiotic resistance. In this doctorate, we aimed to characterize the alp7ARC operon, employing the bacterial actin homolog Alp7A to segregate the tetracycline resistance-encoding plasmid pLS20 in B. subtilis. The stability of the plasmid was shown to be dependent on the alp7ARC operon, indicating an essential role in plasmid segregation. Preliminary results on Alp7A showed that it assembles into a novel tubular nanostructure rather than filaments, suggesting a novel mechanism for DNA segregation by Alp7A. We further studied the structure of Alp7A in vivo using combination of approaches, including molecular biology, cryo-ET, and fLM. We also used CLEM to localize Alp7A in whole cells to a macromolecular resolution. Besides, we investigated the structure and function of Alp7A in vitro by transfecting E. coli with various plasmid constructs and purification by several methods, including affinity chromatography and ammonium sulfate precipitation. I discussed the diverse challenges we encountered in these experiments, such as bacterial thickness, contamination, and Alp7A protein instability. Finally, I proposed alternative experimental approaches for investigating the mechanism of plasmid segregation by Alp7ARC.

La résistance aux lactones macrocycliques (LM) constitue une préoccupation croissante dans le contrôle des nématodes parasitaires, notamment l'Haemonchus contortus chez les ruminants. Parmi les mécanismes étudiés dans la résistance aux LM chez les nématodes d’importance en santé animale, il y a les pompes ABC, principalement les glycoprotéines-p, connues pour leur rôle dans la détoxification des LM chez les strongles. Il n'existe toutefois aucune étude sur l'extrusion des lipides par les pompes ABC en tant que produits excrétoires/sécrétoires provenant d'H. contortus (Hc-PES). Nous émettons l’hypothèse que les pompes ABC chez H. contortus sont à la fois impliquées dans l’extrusion de LM (contribuant à la résistance aux antihelminthiques) et dans l’efflux de lipides secrétés par le parasite. Notre objectif était de caractériser le rôle des pompes ABC chez H. contortus dans le contexte de la résistance aux LM et de l'extrusion des lipides. L'efficacité de l'ivermectine, un membre de LM, a été évaluée dans 8 fermes étudiées par un test de réduction de la numération des œufs dans les selles (TRNOS). Les niveaux d'expression des pompes ABC ont été évalués dans des isolats de champ d’H. contortus avec des résultats TRNOS faibles (présumé souches résistantes). D’ailleurs, des vers adultes d’H. contortus ont été incubés avec trois inhibiteurs de pompes ABC, dont le Fumitremorgin C, le Kétoconazole et le Mk-571 à concentrations différentes. Les lipides ont été identifiés par CL/SM dans les milieux de culture récupérés à 2 h, à 4 h et à 8 h après l'incubation d’H. contortus dans les groupes contrôle et traités. L'expression des gènes Hco-pgp-2 et Hco-pgp-3 était augmentée chez les isolats de champ d’H. contortus. Nous avons identifié 1045 lipides appartenant à diverses catégories. L'extrusion des lipides en Hc-PES a changé en présence d'inhibiteurs de pompes ABC, en particulier pour les lipides composés de structures correspondant à celles pour le transport par les pompes ABC. Nous avons donc conclu que les pompes ABC chez H. contortus représentent un système de multi-extrusion et sont impliquées dans la sécrétion de lipides avec importance dans l’interaction avec l’hôte, mais aussi dans la résistance aux LM chez le nématode. / Macrocyclic lactones (MLs) resistance is a growing concern in controlling parasitic nematodes, particularly Haemonchus contortus in the ruminants’ industry. ABC transporters are known to participate in translocating various lipophilic molecules, including MLs and lipids. Some ABC transporters, mostly P-glycoproteins are known to be involved in MLs detoxification in parasitic nematodes; but there is no data about extrusion of lipids by ABC transporters as Excretory/Secretory Products in H. contortus (Hc-ESP). We hypothesize that ABC transporters in H. contortus have a dual role participating in the efflux of MLs, thus contributing to anthelmintic resistance, and in the extrusion of lipids out of the parasite. This study aimed to characterize the role of H. contortus ABC transporters in the context of ML resistance and the extrusion of lipids. Ivermectin (a member of MLs) efficacy was evaluated in 8 studied farms by the fecal egg count reduction test (FECRT). The expression levels of ABC transporters were evaluated in field isolates of H. contortus with low FECRT results (suspected of resistance). H. contortus adult worms were incubated with three ABC inhibitors, such as Fumitremorgin C, Ketoconazole and Mk-571 with different concentrations. Lipids were identified by LC/MS in culture media at 2h, 4h and 8h post incubation with H. contortus in control and treated groups. Hco-pgp-2 and Hco-pgp-3 were found upregulated in H. contortus field isolates. We identified 1045 lipid molecules belonging to different categories. Interestingly, the lipid profile in Hc-ESP was altered in the presence of ABC transporter inhibitors, which shows structural features compatible as substrates for nematode transporters’ activity. Therefore, ABC transporters in H. contortus participate in extrusion of lipids and also may help in detoxification of MLs, becoming a multipurpose pumping system involved in ML resistance and secretion of lipids at the interplay with the host and among nematodes.

L’objectif de ce projet doctoral a été de coupler la chromatographie en phase supercritique (SFC) avec un spectromètre de masse haute résolution pour l’analyse de substances naturelles apolaires. La SFC est une technique dite « verte » contrairement à la chromatographie liquide en phase normale (NPLC), très consommatrice de solvants organiques toxiques pour l’environnement, puisque la phase mobile est principalement constituée de CO2. Le CO2 ayant une faible viscosité, cela implique une diffusivité, des débits élevés et des temps d’analyse courts. Notre attention a été focalisée sur des molécules apolaires : les lipides. Le but était de mettre au point des dosages dans des matrices alimentaires et biologiques et de débuter une approche lipidomique d’étude de la maladie de Parkinson. La première partie a été dédiée au développement du système SFC avec une détection UV, prêté par le constructeur Agilent Technologies. La première étude s’est portée sur 6 composés de la famille des vitamines A. Une phase d’optimisation a été réalisée afin d’obtenir une séparation satisfaisante des composés, en testant différents paramètres chromatographiques comme le type de phase stationnaire ou encore la composition de la phase mobile, afin d’obtenir une résolution optimale. Ensuite, des études de linéarité et de répétabilité ont été réalisées et des limites de détection et de quantification ont été déterminées afin d’obtenir une méthode fiable et robuste. Une deuxième partie a concerné la mise en place du couplage entre la SFC et un spectromètre de masse de type quadripôle-temps de vol (Q-TOF), afin d’améliorer la spécificité et la sensibilité des analyses. Différentes sources d’ionisation ont été utilisées : ESI, APCI et APPI. Chacune des sources présente des modes d’ionisation différents, qui permettent de pouvoir balayer une large gamme de polarité des analytes. Nous avons choisi 8 dérivés de la vitamine E, composés apolaires pour lesquels la SFC paraît être la technique d’analyse idéale. La séparation de ces composés a été optimisée de façon à obtenir une bonne résolution chromatographique et un temps d’analyse minimal. L’ionisation des composés est réalisée avec les 3 sources disponibles en faisant varier les paramètres de sources ou encore le solvant « make-up », de façon à obtenir une sensibilité optimale. La source APPI a été finalement choisie après une étude sur les performances de la méthode. Cette source présente une bonne répétabilité, linéarité et des limites de détection de l’ordre de celles retrouvées dans la littérature par HPLC-MS. Nous avons ensuite réalisé la quantification des ces composés dans 2 types de matrices alimentaire et biologique : l’huile de soja et le plasma de rat. Une troisième partie a été débutée sur le profilage de lipides à polarités variées par SFC-MS. Cette technique se révèle idéale de par la faible polarité de ces composés et leur absence d’absorbance dans le domaine UV. En effet, l’intégrité des lipides peut être altérée suite aux dommages causés par les radicaux libres, qui sont potentiellement impliqués dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Il parait primordial de développer des outils analytiques présentant une haute sensibilité et résolution et la possibilité d’accéder aux informations structurales. La source d’ionisation ESI nous a permis de détecter 12 lipides sur les 20 sous-classes analysées en mode positif et 8 lipides en mode négatif. Une application a été réalisée sur un échantillon de plasma humain. Il serait intéressant à l’avenir d’effectuer cette étude en utilisant la source APPI, source propice à l’analyse structurale de lipides et présentant une bonne sensibilité et répétabilité. Ce couplage SFC-MS, présentant une bonne sensibilité et répétabilité, sera par la suite étendu à l’analyse de lipides dans diverses matrices biologiques et pourra à l’avenir être appliqué à l’étude de nouveaux biomarqueurs et au screening rapide d’un grand nombre d’échantillons / The aim of this PhD project was to couple supercritical fluid chromatography (SFC) with a high resolution mass spectrometer for apolar natural compounds analysis. Because mobile phase is principally constituted of CO2, SFC is called “green technic” contrary to normal phase liquid chromatography (NPLC), which uses lot of organic solvents toxic for environment. The CO2 presents a low viscosity, in this way high diffusivity and flow rate, and lower analysis times are obtained. Our work was focused on apolar molecules: the lipids. The aim was to quantify molecules in alimentary and biological matrices and to a lipidomic approach to study Parkinson disease. The first part was to develop the system SFC with a UV detection on a system on loan by Agilent Technologies. This first study was carried out on 6 vitamin A compounds. An optimization of chromatographic parameters has been realized in order to obtain a good separation of the compounds. Then, linearity, repeatability, detection and quantification limits have been determined in order to have a reliable and robust method. A second part concerned the coupling of SFC and a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-TOF), in order to improve specificity and sensitivity of analysis. Different ionization sources have been tested: ESI, APCI and APPI. Each ion source presents different ionization mode, which permits to analyze a wide range of polarities of compounds. We have chosen 8 vitamin E derivatives, which are apolar compounds for which SFC seems to be well suited. Separation compounds have been optimized in order to have a good chromatographic resolution and a short analysis time. This compounds ionization is realized with the 3 sources, varying ionization parameters and make-up solvent, to have an optimal sensitivity. The APPI source has been chosen after a performance evaluation method. This source presents a good repeatability, linearity and detection limit in the same order of magnitude than those found in the literature by HPLC-MS. Then we have quantified these compounds in alimentary and biological matrices: a soya oil and plasma rat. A third study has been started on lipid profiling with various polarities by SFC-MS. This technic is well suited because of the low polarity of this molecules and their lack of absorbance in the UV range. The integrity of lipids can be altered with damages caused by free radicals, and are potentially involved in neurodegenerative diseases. It is essential to develop analytical systems with a high sensitivity and resolution and the possibility to access to structural information. The ESI source permits to detect 12 lipids on the 20 sub-classes analyzed in positive ion mode and 8 lipids in negative mode. An application has been realized on human plasma. In the future, it will be interesting to analyze these lipids with the APPI source, which is good choice for structural analysis of lipids, with good sensitivity and repeatability. Studies with this SFC-MS system, presenting good sensitivity and repeatability, will be extended to lipid analysis in biological matrices and could be applied to new biomarkers study and for fast screening of a large number of samples