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Local translation of mRNAs in dendrites is vital for synaptic plasticity and learning and memory. Tight regulation of this translation is key to preventing neurological disorders resulting from aberrant local translation. Here we find that CNOT7, the major deadenylase in eukaryotic cells, takes on the distinct role of regulating local translation in the hippocampus. Depletion of CNOT7 from cultured neurons affects the poly(A) state, localization, and translation of dendritic mRNAs while having little effect on the global neuronal mRNA population. Following synaptic activity, CNOT7 is rapidly degraded resulting in polyadenylation and a change in the localization of its target mRNAs. We find that this degradation of CNOT7 is essential for synaptic plasticity to occur as keeping CNOT7 levels high prevents these changes. This regulation of dendritic mRNAs by CNOT7 is necessary for normal neuronal function in vivo, as depletion of CNOT7 also disrupts learning and memory in mice. We utilized deep sequencing to identify the neuronal mRNAs whose poly(A) state is governed by CNOT7. Interestingly these mRNAs can be separated into two distinct populations: ones that gain a poly(A) tail following CNOT7 depletion and ones that surprisingly lose their poly(A) tail following CNOT7 depletion. These two populations are also distinct based on the lengths of their 3’ UTRs and their codon usage, suggesting that these key features may dictate how CNOT7 acts on its target mRNAs. This work reveals a central role for CNOT7 in the hippocampus where it governs local translation and higher cognitive function.

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Au cours des dernières années, la synthèse des protéines axonales a été établie comme un mécanisme important pour réguler correctement la réactivité spatiale et temporelle des neurones aux variations de leur microenvironnement, en particulier lors du développement axonal et de la régénération. Pour cela, les transcrits d'ARNm doivent être localisés dans les axones afin d'être traduits. De fait, plusieurs populations d'ARNm ont été identifiées le long des axones de divers types de neurones vertébrés. Le transport approprié des ARNm du corps cellulaire vers le compartiment axonal nécessite des séquences ou des structures spécifiques, généralement trouvées dans le 3'UTR du transcrit. Seules quelques études ont confirmé que le transport et la traduction des ARNm ont lieu dans les axones des vertébrés vivants et que ces mécanismes peuvent être impliqués dans des fonctions neuronales distinctes, comme le maintien de l'homéostasie axonale, le guidage, la croissance et la ramification axonales. Notre laboratoire a précédemment démontré in vivo la présence d'ARNm spécifiques, comme le transcrit de nefma, dans les axones en croissance chez l'embryon de poisson zèbre. En utilisant un système rapporteur développé au sein du laboratoire, il a été démontré que le transport axonal (ou la rétention au corps cellulaire) de plusieurs transcrits dépendait de leur 3'UTR. Se basant sur ces résultats importants, dans une première partie de ce travail, nous avons cherché à étudier la fonction du transcrit nefma transporté dans les axones en développement de l'embryon de poisson zèbre. En effet, Nefma est une protéine cytosquelette propre aux neurones, dont l'expression est déclenchée lors de la différenciation neuronale. Nous avons montré que l’immunoréactivité 3A10 est réduite à mesure que la concentration de MO augmente et que ce marquage est utile pour tester l'efficacité du MO, suggérant que l'anticorps 3A10 pourrait reconnaître nefma. Nous avons également démontré que les neurones de Mauthner se différencient au bon moment et au bon endroit chez les morphants. De plus, nous avons constaté que le « zigzagging » des axones morphants augmente avec la concentration de MO et que la protéine mbp s'accumule inégalement autour des faisceaux axonaux dans les morphants nefma. Cependant, les défauts de perte de fonction de nefma ne sont pas totalement pénétrants et difficiles à quantifier. En outre, dans une deuxième partie de la présente étude, nous avons mis au point une technique de détection de la traduction axonale d'ARNm spécifiques dans le même modèle in vivo. Pour cela, nous avons développé un système inspiré de la technique «TimeSTAMP» développée par l'équipe de Roger Tsien, qui nous permet d'identifier les sites de traduction en étiquetant de manière ingénieuse les protéines nouvellement synthétisées. / In recent years, axonal protein synthesis has been established as an important mechanism to fine regulate spatial and temporal neuronal responsiveness to the varying microenvironment, especially during axonal development and regeneration. For that, mRNA transcripts have to be localized to the axons in order to be translated. In fact, several mRNA populations have been identified along the axons of diverse vertebrate neuronal types. The proper transport from the cell body to the axonal compartment requires specific sequences or mRNA structures, usually found in the 3’UTR of the transcript. Only a few studies have confirmed that mRNA transport and translation take place in axons of living vertebrates, and that these mechanisms can be involved in distinct neuronal functions, as the maintenance of axonal homeostasis, pathfinding, and axonal growth and branching. Our lab previously demonstrated in vivo the presence of specific mRNAs, as nefma transcript, in growing axons of the zebrafish embryo. Thanking advantage of a reporter system developed in the lab, it was shown that axonal transport (or retention at the cell body) of several transcripts depended on their 3’UTR.Building upon these important results, in a first part of this work, we sought to investigate the function of the axonally transported nefma in the developing axons of the zebrafish embryo. Indeed, Nefma is a neuron-specific cytoskeletal protein, which expression is triggered during neuronal differentiation. We showed that the 3A10 signal is reduced as the MO concentration increases and this staining is a useful readout for the efficiency of the MO, suggesting that the 3A10 antibody might recognize nefma. We also demonstrated that the Mauthner neurons differentiate at the right time and place in the morphants. Moreover, we saw that the morphant axons zigzagging increases with increasing MO concentrations and that mbp accumulates in patches around axonal bundles in nefma morphants. However, nefma loss-of-function defects are not totally penetrant and difficult to quantify. Furthermore, in a second part of the present study, we aimed at optimizing a technique facilitating the visualization of axonal translation of specific mRNAs in the same in vivo model. For this, we developed a translation reporter system, inspired on the ‘TimeSTAMP’ technique developed by Roger Tsien’s team, which allows the identification of translation sites along the axons by labeling newly synthesized protein in an ingenious fashion.

La traduction locale permet un contrôle spatial de l'expression des gènes. Dans ce travail, j'ai participé à deux cribles de localisation d'ARNm concernant plus de 1000 transcrits. Le premier était un crible double ARNm/protéine qui utilisait une approche de BAComics pour co-détecter les ARNm et la protéine pour laquelle ils codent. Le second a été réalisé à l'aide d'une nouvelle approche smFISH à haut-débit et a analysé tous les ARNm codant pour des protéines centrosomales et des régulateurs mitotiques. Le premier crible a révélé des cas de traduction locale dans divers compartiments subcellulaires, et notamment au niveau des protrusions cytoplasmiques, des centrosomes, de l’appareil de Golgi, des endosomes et des pores nucléaires, ce qui n'avait jamais été décrit auparavant. De manière remarquable, la traduction du peptide naissant était nécessaire pour le transport de nombreux transcrits localisés. De plus, j'ai montré que plusieurs ARNm (tels que ASPM et DYNC1H1) sont traduits dans des structures dédiées appelées usines de traduction.Le deuxième crible a révélé 8 transcrits localisés et traduits au niveau des centrosomes. J'ai montré que la localisation de ces 8 transcrits est régulée par le cycle cellulaire et qu'elle nécessite également la traduction du polypeptide naissant. En utilisant le gène ASPM comme modèle, j'ai visualisé des ARNm et des polysomes uniques avec les systèmes MS2 et SunTag, respectivement. Cela a révélé un transport dirigé des polysomes ASPM vers les centrosomes au début de la mitose, lorsque cet ARNm commence à être localisé. Ces données fournissent des preuves fortes d'un mécanisme de ciblage co-traductionnel dépendant de moteurs moléculaires ainsi que de la protéine naissante. Cela va à l'encontre du dogme actuel selon lequel le transport d'ARNm est un processus basé sur l'ARN et agissant sur des molécules réprimées pour la traduction. En revanche, cela suggère que des mécanismes tels que celui utilisé par le SRP sont plus répandus qu'on ne le pensait auparavant. / Local translation allows a spatial control of gene expression. Here, I participated in two mRNA localization screens imaging more than 1000 transcripts in total: (i) the first was a dual mRNA/protein screen that used a BAComics approach to co-detect mRNAs and the protein they encode; (ii) the second was done using a new high-throughput smFISH approach to screen all genes that encode centrosomal proteins and mitotic regulators. The first screen revealed cases of local translation at various subcellular compartments including cytoplasmic protrusions, centrosomes, Golgi, endosomes and the nuclear pore, which was never described before. Remarkably, translation of the nascent peptide was required for the transport of many localized transcripts. In addition, I showed that several mRNAs (such as ASPM and DYNC1H1) are translated in dedicated structures called translation factories.The second screen revealed 8 transcripts that are localized and translated at the centrosome. I showed that the localization of these 8 transcripts is regulated by the cell cycle, and that it also requires translation of the nascent polypeptide. Using the endogenous ASPM gene as a model, I imaged single mRNAs and polysomes with the MS2 and SunTag systems, respectively. This revealed a directed transport of ASPM polysomes towards centrosomes at the onset of mitosis, when this mRNA starts localizing. These data provide definitive evidence for a co-translational targeting mechanism dependent on motors as well as the nascent protein. This argues against the current dogma that mRNA transport is an RNA-based process acting on translationally repressed molecules. Instead, it suggests that SRP-like mechanisms are more widespread than previously thought.

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Axonal protein synthesis is rapidly regulated by extrinsic cues during neural wiring but the full landscape of proteomic changes and their translational control mechanisms remain unknown. The ability to investigate the nascent proteome on subcellular compartments has been hampered by the low sensitivity of existing methodology on quantity-limited samples combined with the difficulty of obtaining sufficient amounts of pure material. By combining pulsed Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture (pSILAC) with Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3), I have established an approach to characterize the nascent proteome from quantity-limited somaless retinal axons (~2μg) on an unparalleled rapid time-scale (5 min). The results show that a surprisingly large number of proteins (>350) is translated constitutively in axons, many of which are linked to neurological disease. Axons stimulated by different cues (Netrin-1, BDNF, Sema3A) each show a signature set of up/down newly synthesised protein (NSP) changes (>100) within 5 min. Remarkably, conversion of Netrin-1-induced responses from repulsion to attraction triggers opposite translational regulation for 73% of a common subset corresponding to >100 NSPs. Further, I show that pharmacological increase in cAMP, known to induce chemoattractive response, also leads to rapid and wide-scale remodelling of the nascent axonal proteome (~100 NSP changes). I find that the cAMP-elicited NSP changes underlie the attractive turning but are distinct from those induced by the physiological chemoattractant Netrin-1, suggesting that the same type of chemotropic response can be mediated by different protein synthesis-dependent mechanisms. Finally, I show that Sema3A, but not Slit1, triggers a physiological and non-canonical PERK-eIF2α-eIF2B signalling pathway required in neural wiring to elicit the rapid (< 15 min) local translation control of a specific subset of NSPs. Collectively my findings lead to the general conclusion that guidance molecules rapidly induce cue-specific remodelling of the nascent axonal proteome via distinct regulatory mechanisms.

Die asymmetrische Verteilung von mRNA und Proteinen innerhalb einer Zelle definiert die Polarität. Dies ermöglicht eine strikte Regulierung der Genexpression in Raum und Zeit. Ich habe in dieser Arbeit untersucht, wie das Soma und die Neuriten in induzierten Neuronen sich hinsichtlich ihres Transkriptoms und Translatoms unterscheiden. Eine räumliche ribosomale Profilanalyse ergab, dass die Hälfte des lokalen Proteoms durch die mRNA-Lokalisierung und der lokalen Translation definiert wird. Dies sind Prozesse, die durch die synergistische Aktivität von trans- und cis-agierenden Elementen durchgeführt werden. In dieser Arbeit konzentrierte ich mich auf MOV10 als trans-agierendes Element und die alternativen 3′UTRs als cis-agierende Elemente, um ihre Rolle in der Asymmetrie zu untersuchen. MOV10 ist eine RNA-Helikase, welche an vielen Aspekten des RNA-Metabolismus beteiligt ist. Mit den Methoden RIP und PAR-CLIP konnte ich zeigen, dass sowohl MOV10-Ziele als auch MOV10 selbst in den Neuriten lokalisiert sind. Aus ̈erdem ist MOV10 möglicherweise an der translationalen Repression mitinvolviert. In der Tat konnte ich unter den MOV10-Protein-Interaktoren mehrere Proteine identifizieren, welche an der translationalen Repression beteiligt sind, wie z.Bsp. AGO2, FMR1, und TRIM71. Für die Identifizierung der cis-agierenden Elemente führte ich das "Mapping" von alternativen 3′UTRs durch. Diese Analyse zeigte mehrere Gene, die differentiell lokalisierte 3′UTR-Isoformen exprimieren. Insbesondere habe ich mich auf Cdc42 konzentriert. Ich konnte beweisen, dass die beiden Isoformen von Cdc42 auf mRNA-Ebene unterschiedlich lokalisiert sind und dass die 3′UTR der entscheidende Faktor für die mRNA- und Proteinlokalisierung ist. Darüber hinaus habe ich mehrere RBPs identifiziert, die an der Cdc42-Lokalisierung beteiligt sind. Diese Analyse zeigt, dass für die differenzierte Lokalisierung von funktional unterschiedlichen alternativen Protein-Isoformen die Verwendung von alternativen 3′UTR Isoformen als neu-entdeckter Mechanismus eine entscheidende Rolle spielt. / Asymmetric distribution of mRNA and proteins inside a cell defines polarity, which allow tight regulation of gene expression in space and time. In this thesis I investigated how asymmetric distribution characterizes the somatic and neuritic compartments of in induced neurons, in terms of transcriptome and translatome. Spatial ribosome profiling analysis revealed that half of the local proteome is defined by mRNA localization and local translation. These, are processes accomplished by the synergistic activity of trans- and cis-acting elements. I focused on MOV10 as trans-acting element, and on alternative 3′UTRs as cis-elements, to investigate their role in asymmetry. MOV10 is an RNA helicase which participates to many aspects of RNA metabolism. With RIP and PAR-CLIP I showed that MOV10 targets are localized to the neurites, consistently with MOV10-neuritic localization, and that MOV10 might be involved in translational repression. Indeed, among MOV10 protein interactors, I identified several proteins involved in translational repression, i.e. AGO2, FMR1, and TRIM71. On the side of cis-elements, I performed mapping of alternative 3′UTRs. This analysis identified several genes expressing differentially localized 3′UTR isoforms. In particular, I focused on Cdc42. I showed that the two isoforms of Cdc42 are differentially localized at mRNA level, and that the 3′UTR is the driver of mRNA and protein localization. Moreover, I identified several RBPs that might be involved in Cdc42 localization. This analysis points to usage of alternative 3′UTR isoforms as a novel mechanism to provide for differential localization of functionally diverse alternative protein isoforms.