Nodular lymphocyte predominant Hodgkin's lymphoma (NLPHL) is a rare and unique subtype of Hodgkin's lymphoma (HL), accounting for approximately 5% of HL. On histology, NLPHL presents with “popcorn cells” composed of lymphocytic and histiocytic cells that express CD20 and CD45, unlike the pathognomonic Reed-Sternberg cells in classic HL (cHL) that express CD15 and CD30. Such differences in histopathology may require alternative treatment approaches. We present a rare case of NLPHL with atypical features at presentation with excellent response to treatment regimen used in Non Hodgkin’s Lymphoma (NHL). A 36-year-old male presented with acute onset back pain. He also noted multiple gradually enlarging lumps in his neck, axilla, and anterior chest wall for a few months. He mentioned significant constitutional symptoms including fatigue, weight loss, and drenching night sweats. No evidence of end-organ damage was present, except significant hypercalcemia suggestive of hypercalcemia of malignancy. An excisional biopsy of his axillary lymph node confirmed the diagnosis of NLPHL with immuno-stains that were positive for CD20, CD45 and negative for CD15 and CD30. PET scan demonstrated extensive tumor burden in the skeletal system, including the sternum, and multi-stationary lymphadenopathy. Splenomegaly with lymphomatous infiltration was also present. He was assigned stage IV based on the Ann Arbor staging system. R-CHOP (rituximab, cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone) was initiated with a goal of 6 cycles, differing from ABVD (adriamycin, bleomycin, vinblastine, dacarbazine) regimen that is used for cHL. Interval PET scan post 4 cycles of R-CHOP showed no evidence of residual disease. PET scan after 6 cycles demonstrated a complete response (CR), including resolution of hypermetabolic uptake in the spleen, lymph nodes and bones. NLPHL is often considered indolent in clinical courses but with a tendency for multiple late relapses compared to cHL. It still maintains a favorable prognosis. In contrast to cHL, NLPHL less frequently presents with constitutional symptoms, increased tumor burden, or at an advanced stage, which is associated with a worse prognosis. Our patient had multiple features that are unusual in NLPHL such as hypercalcemia, extensive bony involvement with hypermetabolic lytic lesions and significant constitutional symptoms. The clinical conundrum with this rare subtype is whether to treat with HL vs NHL regimens. Literature and the guidelines recommend a conservative approach for low stage NLPHL with observation vs radiation vs single agent rituximab (used in NHL!). Advanced stages require multi-agent regimens ranging from one end of the spectrum with ABVD (used in cHL) to the other end with R-CHOP and its variants (used in NHL). Our patient with a rare subtype of HL had a very unusual and aggressive presentation with CR to R-CHOP demonstrating that rituximab based regimens should be the mainstay of treatment.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Yes / Our previous case-control study observed isolated lymphocytes from 208 individuals and determined the differences in the sensitivity to genomic damage of lymphocytes derived from cancer patients, pre/suspect cancer patients and healthy volunteers using the Comet assay (Anderson et al, 2014). We adapted the LGS technique using a slightly different method and examined 700 more blood samples from 598 patients with cancer or suspected cancer and 102 healthy individuals. To help increase the sensitivity of the test and detect cancer at the level of each individual, we joined with the IMSTAR team who analysed our cells with their fully automated Pathfinder™ cell reader-analyser system. With this reading and analysis system 4,000 to 10,000 cells were able to be read per slide. The new test which is called TumorScan is a highly sensitive test to detect any cancer at an early stage through the response of the white blood cells to UV treatment. These patient blood samples have also been collected at the stage before confirming diagnosis and treatment. There were four of these individuals with cancer who had received anti-cancer treatment. The results from these patients showed a reverse pattern compared to non-treated cancer patients and followed the pattern seen in healthy individuals. The results are consistent with the early results as reported in the above 2014 paper. Given the results from these samples were in a particularly challenging subgroup, whose cancer status was difficult to distinguish, the data suggest that the technique using the TumorScan system could exceed the area under the ROC curve >93% obtained in the earlier study on a group basis, whereas this present study was to detect cancer at an early stage in each individual. / Department of Research and Knowledge Transfer at the University of Bradford, Bradford, UK

Les lymphocytes T (LT) doivent analyser efficacement un nombre important de cellules présentatrices d'antigène (CPA) afin de détecter un antigène spécifique et d'initier une réponse immunitaire adaptée. La reconnaissance par le récepteur des cellules T (TCR) d'un peptide spécifique associé au complexe majeur d'histocompatibilité (pMHC) doit donc être extrêmement sensible et rapide. Alors que les voies de signalisation en aval du TCR sont largement étudiées, la cinétique de la discrimination des ligands par le TCR et de l'activation initiale du LT reste mal connue. Des surfaces solides recouvertes de ligands du TCR nous ont permis d'étudier les événements cellulaires initiés par la détection d'un antigène. L'utilisation de la microscopie a fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM) et la microscopie interférentielle (IRM) nous a permis de montrer que l'interaction initiale entre surface et LT est attribuable à des microvillosités mobiles. La stimulation du TCR active en quelques secondes un mouvement de rétraction de ces microvillosités. Ces mouvements actifs sont régulés par l'activation de la PLC- γ1 et sont dépendants des myosines (IIA, Ic et Ig), de la cofiline et de l'ezrine. Après cette phase d'analyse de l'environnement extracellulaire, la stimulation du TCR entraîne l'étalement rapide et actif de la cellule. L'amplitude et la vitesse d'étalement reflètent l'efficacité activatrice du ligand reconnu par le TCR. En moins de 5 minutes différents pMHC, ayant des propriétés biophysiques proches, sont donc discriminés par les LT et capables d'induire une première réponse cellulaire spécifique. / T lymphocytes need to efficiently probe a large number of antigen-presenting cell (APC) in order to detect an agonist antigen and to initiate an effective immune response. Therefore, engagement of the T-cell receptor (TCR) by peptide-bound major histocompatibility complex (pMHC) is a highly sensitive and rapid process. While signaling pathways downstream the TCR are extensively studied, little is known about antigen discrimination kinetic and initial T-cell response.Model planar surfaces coated with TCR ligand allowed us to study cellular events initiated by antigen detection. Using TIRFM (total internal reflexion microscopy) and IRM (interference reflexion microscopy) we showed that T-cell initial contacts with the surface were mediated by mobile microvilli. TCR engagement triggers a pulling motion of T cell surface microvilli within seconds. Active microvilli movements are dependent on PLC-γ1 activation and on the presence of myosins (IIA, Ic and Ig) as well as cofilin and ezrin. After this extracellular environment probing period, TCR stimulation triggered a rapid and active cell spreading. Cell spreading amplitude and speed reflect the ligand activating efficacity. In less than 5 minutes pMHC with different biophysical properties were discriminated by T-cells and triggered a first specific cellular response.

L’expression de ZAP-70 dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) est associée à une hypersignalisation du BCR et à la survenue de cytopénies auto-immunes (CAI). Les LB non tumoraux expriment aussi ZAP-70, expression corrélée à celle dans les LB tumoraux et aux CAI. Nous avons montré que ces LB non tumoraux ZAP-70+ sont polyclonaux, sans lien moléculaire entre eux ni avec le clone tumoral et qu’il n’existe pas de stéréotypie de leur BCR. Ces LB présentent par contre un enrichissement en BCR autoréactifs. Notre modèle murin knock in Zap-70+/- // Mb1-Cre+/- a montré qu’une forte expression précoce de ZAP-70 dans les LB est associée à un avantage sélectif médullaire, un enrichissement en cellules potentiellement autoréactives de type zone marginale, à un blocage partiel de la maturation et de la différentiation périphérique, ainsi qu’au développement de caractéristiques de la LLC : hypogammaglobulinémie, enrichissement en auto-anticorps circulants, hyperactivation et prolifération cellulaires augmentées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives impliquant ZAP-70 dans la compréhension du développement B et de la physiopathologie de la rupture de tolérance et de la transformation néoplasique. / ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukemia (CLL) is associated with BCR hypersignalling and autoimmune cytopenia (AIC) occurrence. Non tumoral B cells also express ZAP-70, which is correlated with those in tumoral B cells and AIC. We have shown that these non tumoral B cells ZAP-70+ are polyclonal, without molecular link between each other and tumoral B cells, and without BCR stereotypy. These cells are however enriched in autoreactive BCR. Our mouse model knock in Zap-70+/- // Mb1-Cre+/- revealed that a high and early ZAP-70 expression is associated with medullar selective advantage, enrichment in potential autoreactive B cells of marginal zone subtype, partial block for peripheral maturation and differentiation, along with some LLC characteristics: hypogammaglobulinemia, enrichment in circulating auto-antibodies, increase in cellular activation and proliferation. These results open new opportunities involving ZAP-70 in the understanding of B cell development and physiopathology of tolerance breakdown and neoplastic transformation.

La sous-unité catalytique p110 de la phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) est exprimée spécifiquement dans les leucocytes, et possède un rôle central dans la biologie des lymphocytes. Des mutations germinales dominantes gain-de-fonction de PI3KCD (codant p110 ) ont été identifiées récemment chez des patients présentant une immunodéficience combinée caractérisée par une présentation clinique hétérogène incluant des infections récurrentes des voies respiratoires et des lymphoproliférations associées à une virémie EBV et/ou CMV élevée, connue sous le nom de syndromes APDS. L’hétérogénéité des présentations cliniques suggère l’existence de facteurs secondaires, génétiques ou environnementaux. Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai rapporté le cas de deux nouveaux patients présentant des anomalies génétiques affectant la voie PI3K. Le premier patient, né dans une famille consanguine, présentait une mutation gain- de-fonction de PIK3CD déjà décrite. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une seconde mutation homozygote non-sens de SEC14L2, un régulateur connu de la voie PI3K. Nous avons analysé le phénotype et la fonctionnalité des lymphocytes du patient, et avons mis en évidence in vitro certains mécanismes de régulation de l’activation lymphocytaire par SEC14L2. Enfin, nous avons réalisé une étude de transcriptome afin d’identifier les voies de régulation dérégulées chez notre patient. Dans l’ensemble, ces résultats ont permis d’identifier le premier co-facteur génétique associé au syndrome APDS. Le second patient est également né dans une famille consanguine et présentait des infections sévères des voies respiratoires et un syndrome d’infection chronique à l’EBV (CAEBV) fatal. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une mutation homozygote rare dans PIK3CD. Une modélisation de la structure de la protéine a montré que l’acide aminé muté se situe dans le domaine catalytique de p110 , dans une boucle phylogénétiquement conservée interagissant avec la sous-unité régulatrice p85↵ de la PI3K, et que la mutation conduisait à la perte de cette interaction. In vitro, la mutation de p110 cause la perte de l’activité PI3K, et les lymphocytes T du patient présentaient une diminution de phosphorylation d’AKT et de p70 S6K, deux cibles de la PI3K. Les lymphocytes T du patient présentaient également une production diminuée d’IFN- et de TNF↵, et un excès de prolifération et de flux calcium suite à la stimulation du TCR. Des lignées cellulaires Jurkat déficientes pour PIK3CD générées par CRISPR/Cas9 ont également présenté un défaut de phosphorylation d’ATK et un excès de prolifération et de flux calcium. L’expression de la version sauvage de p110 dans ces cellules, mais pas de la version mutée, a permis une restauration des réponses normales, prouvant l’implication de la mutation dans les phénotypes cellulaires identifiés. De manière intéressante, nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre entre l’activité PI3K et PLC- 1 lors de l’activation T, qui pourrait être expliqué par une compétition pour l’accès à leur substrat commun, le PIP2. Enfin, nous avons identifié chez notre patient une seconde mutation homozygote délétère dans le gène TNFRSF9. Cette mutation est également retrouvée chez la sœur saine du patient, qui présentait une réplication persistante de l’EBV dans le sang, suggérant que cette mutation pourrait agir comme facteur génétique secondaire. Dans l’ensemble, cette étude à permis l’identification de la première immunodéficience associée à des mutations perte-de-fonction de PIK3CD. / The pathway p110 catalytic subunit of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) is selectively expressed in leukocytes and has a central role in lymphocytes biology. Gain-of-function dominant germline mutations of PIK3CD (encoding p110 ) have been recently described in patients presenting a heterogeneous combined immunodeficiency associated with respiratory tract infections, lymphadenopathy and high EBV and/or CMV viremia. The heterogeneous clinical presentation suggests the existence of genetic or environmental modifying factors. In my thesis I report two new patients with different genetic defects causing CID. The first patient, born from a consanguineous family, presented a known gain-of- function mutation of PIK3CD. His clinical presentation was partially compatible with the already described patients. By whole exome sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in SEC14L2, a known regulator of PI3K pathway. We further analyzed the phenotype and functions of patient’s lymphocytes, and performed a transcriptome analysis to better characterize the implication of SEC14L2 mutation in the pathology. The second patient was born from consanguineous family and presented recurrent severe respiratory tract infections and a fatal Chronic Active EBV disease (CAEBV). By Whole Exome Sequencing, we identified a homozygous rare missense mutation in PIK3CD. 3D structure modelization showed that the mutated amino acid is located in p110 catalytic domain, in an evolutionarily conserved loop that interacts with alpha-helix of PI3K regulatory subunit p85a, which interaction is lost in mutated p110 . Phenotyping of patient’s circulating lymphocytes showed increased CD8+ T cells and reduced NK and CD4+ T cells. The mutation in PI3KCD resulted in impaired PI3K activity in vitro and in vivo. Moreover, patient’s T cells exhibited reduced activation-induced phosphorylation of AKT and p70-S6K, two indirect targets of p110 , that we restored by expressing wild type p110 . Patient’s T cells also showed a decreased induction of IFN- and TNF-↵ and an increased proliferation and calcium flux after TCR stimulation. By CRISPR CAS9 technology, we generated Jurkat T- cell lines expressing wild type or mutated PI3K. Jurkat cells expressing mutant PI3K showed decreased AKT phosphorylation and increased calcium flux and proliferation after TCR stimulation, confirming the implication of PIK3CD mutation in patient’s cells phenotype. Interestingly, we highlighted the existence of a balance between PI3K and PLC- 1 activity during T cell activation, that may be due to a competition for access to their shared substrate, the PIP2. Finally, we identified in our patient a second deleterious mutation in TNFRSF9 that is shared by his healthy sister, who also presented persistent EBV replication in blood, suggesting that this additional mutation may act as a modifying genetic factor. Taken together, the results presented in this thesis identified the first loss-of-function mutation in PIK3CD causing CID.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) constitue l'hémopathie maligne la plus fréquente dans les pays occidentaux et résulte d’une accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux matures porteurs de la glycoprotéine CD5. Les LB de LLC sont également caractérisées par une altération de l'homéostasie du calcium avec, d'une part, la mise en évidence de facteurs de survie contrôlés par le calcium tels que phospho-ERK, NFAT-2 et IL-10, et d'autre part par une progression de la maladie qui est associée à la réponse au calcium. Tout d'abord, afin de mieux comprendre l'impact de la molécule CD5 sur les dérégulations du calcium, il a été montré que l'introduction d'un plasmide d'expression pour CD5 dans les lignées de cellules B humaines s'accompagnait d'une entrée calcique à l’état basale. Ensuite, cette entrée, appelée entrée constitutive, a été recherchée dans les LB de LLC pour montrer qu'elle caractérisait les patients non traités en phase d'évolution. Comme pour les lignées de cellules B CD5, cette nouvelle voie d'entrée du calcium est autonome et indépendante de la voie classique de signalisation du LB de LLC : BCR-IP3R. L'étude des protéines responsables de cet influx a permis de mettre en évidence, premièrement trois partenaires STIM1, Orai1 et TRPC1, et deuxièmement l'importance de la fraction membranaire de STIM1 (STIMPM) puisque l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-STIM1 (Acm) est capable d’inhiber l'entrée constitutive du calcium qui à son tour agit sur la survie des LB, pour les patients STIMPM positifs, lorsque l'Acm anti-STIM1 est utilisé en association avec le rituximab, un Acm thérapeutique anti-CD20. Enfin, la modélisation de la partie Cterminale de STIM1 permet d'envisager plusieurs cibles potentielles pour le développement de nouveaux Acm anti-STIM1. En conclusion, la mise en place, par le clone malin de LLC, d'une entrée constitutive du calcium favorise son agressivité et constitue donc une nouvelle voie thérapeutique contrôlable par l'utilisation d’Acm anti-STIM1 ce qui ouvre de nouvelles perspectives comme outils diagnostiques et thérapeutiques. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common hematological malignancy in Western countries and is a result of the accumulation of mature monoclonal B lymphocytes (B-CLL) carrying the CD5 glycoprotein. The B-CLL are also characterized by an alteration of calcium homeostasis with, on the one hand, the demonstration of calcium-controlled survival factors such as phospho-ERK, NFAT- 2 and IL-10, and on the other hand by a progression of the disease which is associated with the response to calcium. Initially, in order to better understand the impact of the CD5 molecule on calcium deregulations, it has been shown that the introduction of an expression plasmid for CD5 into human B cell lines was accompanied by a calcium entry in the basal state. Then, this entry, called constitutive entry, was sought in the B-CLL to show that it characterized untreated patients in the evolution phase.As with CD5 B cell lines, this new calcium entry pathway is autonomous and independent of the classical B-CLL signaling pathway: BCR-IP3R. The study of the proteins responsible for this influx made it possible to highlight, firstly three partners (STIM1, Orai1 and TRPC1), and secondly the importance of the membrane fraction of STIM1 (STIMPM) since the use of a human monoclonal antibody (mAb) anti-STIM1 is able to inhibit the constitutive entry of calcium which in turn acts on the survival of B-CLL, for STIMPM positive patients, when the anti-STIM1 mAb was used in combination with rituximab, a therapeutic anti-CD20 mAb. Finally, the modeling of the C-terminal part of STIM1 makes it possible to envisage several potential targets for the development of new anti-STIM1 mAbs. In conclusion, the introduction by the CLL malignant clone of a constitutive entry of calcium favors its aggressiveness and thus constitutes a new therapeutic pathway controllable by the use of anti-STIM1 mAb, which opens new perspectives like diagnostic and therapeutic tools.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par la perte sélective des motoneurones du cerveau et de la moelle épinière. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire qui évolue vers une paralysie, entrainant la mort du patient dans les 3 à 5 ans après l’apparition des symptômes. Une réponse inflammatoire associée à l'accumulation de cellules immunitaire dans le système nerveux central (SNC) est une signature de la SLA. Ce travail propose d'étudier le rôle des cellules résidentes du SNC, notamment les astrocytes, et des cellules immunitaires périphériques, notamment les lymphocytes T CD8+, dans la SLA. Nous montrons qu'une fois infiltrées dans le SNC des souris mutantes modèles de la SLA (lignée SOD1G93A) des cellules T CD8+ s'activent et subissent une expansion de type oligoclonale. In vitro, les cellules T CD8+ issues de souris SOD1G93A sont capables d'induire la mort des motoneurones spécifiquement, par un mécanisme dépendant de la liaison du TCR avec le CMH de classe I. Nous rapportons que la déplétion périphérique des cellules T CD8+ chez les souris modèles de SLA permet de protéger une partie des motoneurones des processus neurodégénératifs. Une approche génétique permettra de confirmer l'implication des lymphocytes cytotoxiques dans l'évolution de la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that is characterized by the selective loss of upper and lower motoneurons. Symptoms appears as muscular weakness, which irrevocably leads to muscle paralysis and death of patients within 3 to 5 years after onset of symptoms. An inflammatory response, along with the accumulation of blood-derived immune cells in the central nervous system (CNS) is a hallmark of the disease. This work proposes to investigate the role of resident cells of the brain, such as astrocytes and especially peripheral immune cells such as T CD8+ lymphocytes, in ALS pathogenesis. We show that once infiltrated in the CNS of SOD1G93A mice, CD8+ T cells become activated and undergo an oligoclonal expansion. In vitro, CD8+ T cells isolated from ALS mouse model (SOD1G93A strain) can trigger motoneuron death, in a manner that is dependent on the recognition of the MHC class I by TCR. We report that peripheral immunodepletion of CD8+ T cells is not sufficient to improve lifespan of SOD1G93A mice, but still permit to protect motoneurons from neurodegeneration. A genetic approach will confirm implication of CD8+ T lymphocytes in the disease.