Le système immunitaire comporte différents mécanismes de tolérance périphérique permettant de contrôler la réponse des cellules T CD8+. Dans certaines conditions encore peu connues, des cellules T potentiellement auto-réactives peuvent contourner les mécanismes de tolérance et se différencier en cellules effectrices, capables d’attaquer différentes organes de l’organisme, dans un processus d’auto-réactivité. En utilisant une souris transgénique exprimant un antigène modèle dans les cellules bêta du pancréas, j’ai étudié deux processus fondamentaux impliqués dans la différenciation des cellules T CD8+ en réponse aux antigènes du soi.1) Rôle de la translocation des lipopolysaccharides (LPS) dans la rupture de la tolérance. Nous avons préalablement démontré dans le laboratoire que des protocoles de lympho-déplétions, tels l’irradiation, étaient capables d’induire une rupture de la tolérance périphérique dans les cellules T CD8+. L’irradiation provoque la translocation des LPS des bactéries commensales vers la circulation sanguine, ce qui induit une activation du système immunitaire inné. Mes données ont montré que la translocation des LPS était corrélée avec l’activation systémique des cellules dendritiques (DC) CD11c+, en particulier les DC CD8+, responsables de la cross-présentation des auto-antigènes pancréatiques dans les tissus lymphoïdes. Alors que le traitement par des antibiotiques avant l’irradiation permet de prévenir la translocation des LPS, l’activation des DC n’est que partiellement affectée, et le développement de l’auto-immunité résultant d’une rupture de la tolérance périphérique des cellules T CD8+ ne peut pas être empêchée par le traitement.2) Visualisation de la coopération entre cellules T CD4+ et CD8+ effectrices dans la destruction des cellules bêta pancréatiques in vivo. En utilisant la microscopie intra-vitale à 2-photons, j’ai pu analyser, pour la première fois, la dynamiques des cellules T CD4+ et CD8+ auto-réactives exprimant un marqueur fluorescent, lors de l’infiltration du pancréas et du développement du diabète auto-immun. J’ai mis en évidence que l’infiltration des cellules T était accompagnée d’un remodelage de la matrice extracellulaire du pancréas, permettant la migration dirigée des lymphocytes. De plus, j’ai montré que l’arrêt MHC classe II-dépendant des cellules T CD4+, dû à des interactions avec des cellules présentatrices d’antigène recrutées au site d’inflammation et impliquant dans certains cas également les cellules T CD8+, contribuait au maintien des fonctions effectrices des cellules T CD8+. / The immune system has evolved multiple mechanisms of peripheral tolerance to control CD8+ T cell responses. Under particular conditions that are not yet well understood, potentially autoreactive T cells may override tolerance and differentiate into effector cells capable of targeting the own components of the organism resulting in self-reactivity. Utilizing transgenic mice expressing a model antigen in the beta cells of the pancreas, I have studied two important processes involved in CD8+ T cells differentiation in response to self-antigens. 1) Role of lipopolysaccharides (LPS) translocation in the breakdown of CD8+ T cell tolerance. It has been previously shown in our laboratory that lymphodepleting protocols, such as total body irradiation, promote breakdown of peripheral CD8+ T cell tolerance. Irradiation induces translocation of commensal bacteria LPS, a potent innate immune system activator, into the bloodstream. My data demonstrated that LPS translocation correlated with systemic activation of CD11c+ dendritic cells (DC), in particular CD8+ DC, responsible for pancreatic self-antigen cross-presentation, in lymphoid tissue. While antibiotic treatment of mice before irradiation prevented LPS translocation, DC activation was only partially affected, and onset of autoimmunity and breakdown of CD8+ T cell tolerance could not be prevented.2) Intra-vital visualization of effector CD8+ and CD4+ T cell cooperation in beta cell destruction in the pancreas. Using two-photon microscopy, I have been able, for the first time, to simultaneously analyze dynamics of fluorescently tagged autoreactive CD8+ and CD4+ T cells as they infiltrated the pancreas and induced autoimmune diabetes. I found that T cell infiltration promoted extracellular matrix remodeling in the pancreas, which in turn served as a scaffold for T cell migration. In addition, I showed that MHC class II dependent arrest of effector CD4+ T cells, due to interactions with antigen presenting cells, occasionally also implicating CD8+ T cells, provided help to effector CD8+ T cells in maintaining their effector functions.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont spécialisées dans la lutte antivirale, notamment grâce à leur capacité à sécréter des IFN de type I. Néanmoins, elles sont aussi impliquées dans Pactivation des réponses immunitaires adaptatives, et des lymphocytes T (LT) en particulier. C'est pourquoi, lors d'épisodes inflammatoires chroniques ou incontrôlés, les pDC sont à l'origine de l'initiation ou du maintien de syndromes inflammatoires et du développement de pathologies auto-immunes. Il doit donc exister des mécanismes permettant de contrôler l'activité de ces cellules. À l'aide d'un modèle in vivo d'inflammation non virale induite par l'injection d'un anticorps anti-CD3 (Ac aCD3), nous avons observé une apoptose des pDC dans différents organes lymphoïdes, et ce de façon dépendante de l'activation des lymphocytes T. De plus, nous avons pu observer que la diminution de la survie des pDC dans ce contexte inflammatoire n'était pas associée à l'orage cytokinique induit par l'efièt mitogénique de l'Ac aCD3. En revanche nos résultats montrent que les LT CD8* et la voie cytotoxique de la perforine dans ce contexte inflammatoire aigu sont responsables de la déplétion des pDC. Nous avons également étendu ces résultats à d'autres situations inflammatoires stériles comme lors de la maladie du greffon contre l'hôte. Ces données suggèrent que cette voie de régulation pourrait être utilisée à des fins thérapeutiques, afin de contrôler la survie des pDC impliquées dans la physiopathologie de syndromes auto-immuns comme le lupus érythémateux disséminé, le psoriasis, la sclérose en plaques ou encore le diabète de type I. / Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are specialized in type I interferons (IFN-I) secretion to control viral infections. However, these cells can also activate adaptive immune responses, and polarize T cells. Indeed, during chronic or uncontrolled inflammatory episodes, pDC can induce or maintain inflammatory syndromes and autoimmune diseases. So some mechanisms should exist to control the fonction of these cells. In an in vivo modcl of non viral inflammation induced by the injection a CD3-specific antibody (aCD3 Ab), we could observed pDC's apoptosis dependent of T cell activation in different lymphoid organs. Moreover, we could observe that this depletion of pDC was not associated with the cytokinic storm induced by the mitogenic effect after aCD3 Ab treatment. On the other hand our data shovved that CD8+ T cells and the perforin pathway in this acute inflammatory context are responsible for pDC depletion We also obtained the same results in other non viral inflammation settings such as graft versus host disease. Overall, these data suggesi that this regulation pathway could be used for therapeutic purposes, to control pDC survival and avoid their involvement in the physiopathology of autoimmune disorders like systemic lupus erythematosus, psoriasis, multiple sclerosis or type I diabetes.

L’autophagie est un mécanisme de dégradation lysosomale ubiquitaire impliqué dans la lutte contre les infections. Les agents infectieux ont développé des stratégies pour éviter ou utiliser l’autophagie à leur profit. Cette dégradation peut être hautement sélective grâce à l’intervention de « récepteurs autophagiques », comme p62/SQSTM1, chargés de l’adressage de substrats à la machinerie autophagique grâce à leur interaction avec les protéines de la famille ATG8. Notre équipe a montré que les protéines d’enveloppe du VIH‐1 (Env) déclenchent l’autophagie dans les lymphocytes T CD4. Lorsque ces cellules sont infectées de façon productive, le processus autophagique est bloqué par le virus. Au cours de ma thèse nous avons montré que l’autophagie exerce une fonction anti‐VIH en dégradant sélectivement son transactivateur Tat, via son interaction avec p62. Au contraire, lorsque les cellules cibles ne sont pas productivement infectées, car le cycle viral est interrompu après l’étape d’entrée, l’autophagie n’est pas contrôlée et conduit à la mort par apoptose, suggérant que l’autophagie dégrade sélectivement un facteur de survie cellulaire. Mes travaux de thèse montrent qu’Env induit un stress oxydatif impliqué dans la mort par apoptose des cellules cibles non infectées. Nos résultats préliminaires suggèrent que les peroxysomes seraient des cibles de l’autophagiedans ces conditions. Ces organelles étant chargées de détoxifier la cellule, nous avons donc formulé l’hypothèse que l’autophagie, induite par Env, conduit à la dégradation sélective des peroxysomes, entraînant l’accumulation espèces oxydées dans les cellules cibles et ainsi, leur mort par apoptose. / Autophagy is an ubiquitous degradation pathway involved in innate immunity. Numerouspathogens have therefore developed strategies to block or use the autophagy machinery to their own benefit. This degradation can be highly selective, thanks to the intervention of autophagy receptors, like p62/SQSTM1, involved in the specific targeting of substrates to autophagosomes after their interaction with the ATG8 family of autophagic proteins. Our team has demonstrated that the HIV‐1 envelope proteins (Env) are responsible for autophagy triggering in CD4 T lymphocytes. If the target cells become productively infected, the autophagy process is blocked by the virus. During my thesis, we report that autophagy exerts an anti‐HIV effect by selectively degrading the HIV‐1 transactivator Tat, via its interaction withp62. On the contrary, if the target cells are not productively infected because the viral cycle is interrupted after the entry step, autophagy is not controlled and leads to apoptosis. These results suggest that the degradation of cellular components could be responsible for the induction of apoptosis. My thesis work indicates that Env induces an oxidative stress in the uninfected target cells and that this stress is involved in their death. Our preliminary results suggest that the peroxisomes would be targeted to autophagic degradation in these conditions. As these organelles are involved in the detoxification of the cells, we have made the assumption that Env‐induced autophagy triggers the selective degradation of these peroxisomes that leads to the accumulation of reactive oxygen species, and ultimately to apoptotic cell death.

La pathogénie du syndrome néphrotique idiopathique est inconnue, mais de nombreux arguments clinques et expérimentaux favorisent l’hypothèse d’une pathogénie dys-immunitaire à expression immunologique et rénale, au cours de laquelle on observerait une altération des lymphocytes T. Cependant, le mécanisme exact reste encore mal connu. Récemment, le Rituximab, un anticorps dirigé contre l’antigène CD20, a montré une efficacité à induire une rémission à moyen et long terme suggérant l’implication d’une dysfonction des lymphocytes B et/ou un défaut de coopération T-B. Notre laboratoire a isolé un nouveau gène C-MIP dont l’expression est induite dans certaines sous-populations lymphocytaires T et B, ainsi que dans les podocytes de patients atteints de SNI en phase de poussée mais quasiment indétectable chez les sujets sains.Dans ces travaux, ancillaires au PHRC NEPHRUTIX, nous avons étudié les perturbations lymphocytaires T, avant, au moment de la rechute et en période de rémission au cours de syndrome néphrotique à lésions glomérulaires minimes et l’effet du traitement par le Rituximab. Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la rechute était associée à un effondrement des lymphocytes T régulateurs, une baisse profonde de l’interleukine-2 ainsi qu’à une surexpression significative de C-MIP, précédant la survenue de la rechute. Ces modifications se restaurent en rémission. Enfin, la rémission obtenue dans le bras Rituximab, entraîne une diminution des lymphocytes T folliculaires (Tfh), des iNKT et des cellules double-négatives DN-TCR Vα24, suggérant que le SNLGM implique un défaut des réponses immunitaires innées et adaptatives, qui peut être stabilisé par un traitement par Rituximab.Afin d’étudier le rôle de C-MIP, nous avons généré des souris transgéniques sur-exprimant ce gène dans les lymphocytes T matures périphériques. Cette surexpression est à l’origine d’un phénotype lymphocytaire altéré marqué par une accumulation de lymphocytes T naïfs, un effondrement des cytokines activatrices de type Th1 et Th2 et une accumulation des formes inactives des Src kinases. Ces résultats suggèrent que C-MIP, en inhibant les Src kinases, est un régulateur négatif de l’activation T impliqué dans la signalisation proximale et pourrait être impliqué dans l’hypo-réactivité lymphocytaire T observée chez les patients atteints de SNLGM actif. / The pathogenesis of minimal-change nephrotic syndrom (MCNS) is unknown, but, supported by many clinical and experimental arguments, it was suggested that MCNS is a dys-immune disorder with immunogical and renal expression, during which T-cell alteration would be observed. However, the exact mechanism remains unknown. Recently, Rituximab, a B-cell depleting agent, is effctive in inducing mid- and long-term remission suggesting involvement of B-cell dysfunction and/or lack of T-B cooperation. Our laboratory identified a new gene: C-MIP. We have shown that C-MIP abundance is increased in some T and B lymphocyte subpopulations, as well as in podocytes of MCNS patients during relapse phase but undetectable in healthy subjects.In this work, ancillary to the NEPHRUTIX PHRC, we studied T-cell disturbances before and during the relapse or during the remission time in MCNS and the effect of Rituximab therapy. In this study, we found that relapses were associated with significant decrease in regulatory T cell and interleukin-2 expression, while C-MIP abundance was significantly increased. These changes are restored during remission time. Finally, remission after Rituximab therapy leads to a decrease in follicular T cells (Tfh), iNKT and double-negative (CD4- CD8-) T cells expressing the invariant Vα24 chain, suggesting that MCNS involves a disorder of innate and adaptative immune response, which can be stabilized by Rituximab treatment.In order to study the C-MIP role, we generated transgenic mice overexpressing this gene in the peripheral mature T-cells. This overexpression leads to an altered lymphocyte phenotype with an accumulation of naive T lymphocytes, a significant decrease of Th1 and Th2 activating cytokines and accumulation of inactive Src kinases. These results suggest that, by inhibiting Src kinases, C-MIP is a negative regulator of activation T involved in proximal signalling and may be responsable of the lymphocyte T hypo-reactivity observed in patients with active MCNS.

L'obésité et ses complications métaboliques comme le syndrome métabolique (SM) deviennent des épidémies mondiales qui partagent une composante commune qu’est l'inflammation chronique. Les acteurs principaux de cette inflammation sont les lymphocytes T. L’utilisation des polyphénols capables de moduler les fonctions de lymphocytes T pour lutter contre les maladies métaboliques inflammatoires fait l’objet de nombreuses investigations. Dans cette étude, nous avons analysé l'effet de la delphinidine, un anthocyane connu pour préserver l'intégrité de l'endothélium par un mécanisme dépendant au récepteur aux oestrogènes alpha (ERα), sur la prolifération, l’apoptose et la différentiation de lymphocytes T isolés à partir de sujets sains et de patients atteints de SM. La delphinidine diminue la prolifération et l’apoptose de lymphocytes T isolés à partir de sujets sains et stimulés par différents agents mitogènes et proapoptotiques, respectivement. Par ailleurs, la delphinidine inhibe la différenciation des lymphocytes vers des profilsTh1, Th17 et Treg, sans affecter le profil Th2. Enfin, la delphinidine inhibe la prolifération, l’apoptose et la différenciation des lymphocytes T isolés à partir de patients présentant des risques cardiovasculaires associés au SM. Les mécanismes moléculaires mis en jeu ont été identifiés, avec l’implication d'ERα, d'ERK1/2, de NFAT et d'HDAC en relation avec le signal calcique. Nos résultats suggèrent que la delphinidine, en agissant sur ERα, via des cibles cellulaires multiples, pourrait représenter une nouvelle approche pour traiter les troubles métaboliques inflammatoires chez les patients présentant des facteurs de risque cardiovasculaire. / Obesity and its metabolic complications like metabolic syndrome (MetS) are becoming worldwide epidemics which share a common component of chronic low-grade inflammation. T lymphocytes play a central role in the triggering of this inflammatory process. Modulation of T lymphocytes functions by using polyphenols, as a possible approach to alleviate chronic inflammatory metabolic diseases has become the subject of many scientific investigations. Here, we analyzed the effect of delphinidin, an anthocyanin known to possess vasculoprotection properties, via an estrogen receptor alpha (ERα)-dependent mechanism, on proliferation, apoptosis and differentiation of T lymphocytes from healthy subjects and MetS patients. We found that delphinidin decreased proliferation and apoptosis of T lymphocytes from healthy subjects stimulated by different mitogen and apoptotic agents, respectively. Further, delphinidin suppressed the differentiation of hese cells toward Th1, Th17 and Treg without affecting Th2 subsets. Interestingly, delphinidin inhibited proliferation, apoptosis and differentiation of T cells taken from patients with cardiovascular risks associated with MetS. We also identified the molecular mechanism involved, with the implication of ERα, ERK1/2, NFAT and HDAC pathways in relation with calcium signaling. Together, we propose that delphinidin by acting on ERα, via multiple cellular targets, may represent a new approach in the treatment of chronic inflammatory metabolic disorders caused by excessive T lymphocyte responses, in with cardiovascular risk factors.

L’immunothérapie basée sur le transfert de lymphocytes T (LT) spécifiques de la tumeur est une approche prometteuse contre le cancer. Pour activer et amplifier de tels LT, principale étape limitante de cette approche, des cellules présentatrices d’antigène artificielles (CPAA) ont été développées au laboratoire. Ces CPAA ont été construites à partir de fibroblastes murins NIH/3T3 transduits à l’aide de vecteurs gammarétroviraux afin d’exprimer les principaux éléments nécessaires à l’activation de LT humains. Ces CPAA nous permettent d’obtenir des LT mémoires souches (TSCM : CD95+CD45RA+CD62L+CCR7+), LT très peu différenciés récemment identifiés chez l’homme. Ces TSCM ont été décrits comme étant du plus grand intérêt pour l’immunothérapie en raison de leur capacité d’auto-renouvellement et de leur faculté à se différencier en LT effecteursefficaces. Pour optimiser l’amplification de TSCM spécifiques, nous avons notamment étudié les effets sur les LT de l’expression de différentes molécules de costimulation par nos CPAA (CD80, CD70 et 4-1BBL). Les protéines MART-1 et MELOE-1, surexprimées dans les mélanomes, ont été utilisées comme antigènes modèles pour ces travaux. Les CPAA CD80+CD70+ et CD80+CD70+4-1BBL+ sont les plus prometteuses pour maintenir le phénotype des TSCM. Une étude exhaustive des CPAA CD80+CD70+ a montré que nous pouvions obtenir un plus grand nombre de TSCM fonctionnels spécifiques de MART-1 et de MELOE-1 de manière reproductible avec ces CPAA. Dans une seconde étude, nous avons pu montrer que les CPAA CD80+CD70+4-1BBL+ permettaient d’obtenir le plus grand nombre de LT spécifiques fonctionnels et très peu différenciés après purification et restimulation de LT spécifiques stimulés une première fois par les CPAA CD80+CD70+. Ces travaux devraient nous permettre, après le développement d’un modèle murin, de proposer de nouvelles stratégies d’immunothérapie basées sur l’obtention grâce à nos CPAA optimisées de LT spécifiques anti-tumoraux capables d’assurer une protection à long terme aux patients. / Immunotherapy based on the transfer of tumor-specific T lymphocytes (TLs) is a promising approach against cancer. To activate and amplify such TLs, main limiting step of this approach, artificial antigen presenting cells (AAPCs) have been developed in the laboratory. These AAPCs have been constructed from NIH/3T3 murine fibroblasts transduced with gammaretroviral vectors to express the principal elements required to activate human TLs. With these AAPCs, we can obtain anti-tumor stem cell memory TLs (TSCM: CD95+CD45RA+CD62L+CCR7+), which are very limitedly differentiated TLs recently identified in humans. These TLs have been recently described as cells of great interest for immunotherapy because of their self-renewal capacity and their ability to differentiate into effective effector TLs. To improve the amplification of specific TSCM, we notably studied the effects on TLs of the expression of different co-stimulatory molecules by our AAPCs (CD80, CD70 and 4-1BBL). MART-1 and MELOE-1, proteins that are overexpressed in melanoma, were used as model antigens in this work. CD80+CD70+ and CD80+CD70+4-1BBL+ AAPCs appear to be the most promising ones for maintaining a TSCM phenotype. An exhaustive study of CD80+CD70+ AAPCs showed that we could reproducibly get greater numbers of MART-1- and MELOE-1-specific functional TSCM with these AAPCs. In another study, we have shown that CD80+CD70+4-1BBL+ AAPCs enabled us to get the greatest number of functional and very limitedly differentiated specific TLs after purification and restimulation of specific TLs stimulated first with CD80+CD70+ AAPCs. This work should allow us, after the development of a murine model, to propose new immunotherapy strategies based on the possibility of obtaining with our optimized AAPCs anti-tumor specific TLs capable of ensuring patient long term protection.

Antigen presented to CD4+ T cells by major histocompatibility complex class II molecules (MHCII) plays a key role in adaptive immunity. Antigen presentation is initiated by the proteolytic cleavage of pathogenic or self proteins and loading of resultant peptides to MHCII. The loading and exchange of peptides to MHCII is catalyzed by a nonclassical MHCII molecule, HLA-DM (DM). It is well established that DM promotes peptide exchange in vitro and in vivo. However, the mechanism of DM-catalyzed peptide association and dissociation, and how this would affect epitope selection in human responses to infectious disease remain unclear. The work presented in this thesis was directed towards the understanding of mechanism of DM-mediated peptide exchange and its role in epitope selection. In Chapter II, I measured the binding affinity, intrinsic dissociation half-life and DM-mediated dissociation half-life for a large set of peptides derived from vaccinia virus and compared these properties to the peptide-specific CD4+ T cell responses. These data indicated that DM shapes the peptide repertoire during epitope selection by favoring the presentation of peptides with greater DM-mediated kinetic stability, and DM-susceptibility is a strong and independent factor governing peptide immunogenicity. In Chapter III, I computationally simulated peptide binding competition reactions and found that DM influences the IC50 (50% inhibition concentration) of peptides based on their susceptibility to DM, which was confirmed by experimental data. Therefore, I developed a novel fluorescence polarization-based method to measure DM-susceptibility, reported as a IC50 (change in IC50 in the absence and presence of DM). Traditional assays to measure DM-susceptibility based on differential peptide dissociation rates are cumbersome because each test peptide has to be individually labeled and multiple time point samples have to be collected. However, in this method developed here only single probe peptide has to be labeled and only single reading have to be done, which allows for fast and high throughput measure of DM-susceptibility for a large set of peptides. In Chapter IV, we generated a series of peptide and MHCII mutants, and investigated their interactions with DM. We found that peptides with non-optimal P1 pocket residues exhibit low MHCII affinity, low kinetic stability and high DM-susceptibility. These changes were accompanied with conformational alterations detected by surface plasmon resonance, gel filtration, dynamic light scattering, small-angle X-ray light scattering, antibody-binding, and nuclear magnetic resonance assays. Surprisingly, all these kinetic and conformational changes could be reversed by reconstitution with a more optimal P9 pocket residue. Taken together, our data demonstrated that conformation of MHCII-peptide complex constrained by interactions throughout the peptide binding groove is a key determinant of DM-susceptibility. B cells recognizing cognate antigen on the virion can internalize and process the whole virion for antigen presentation to CD4+ T cells specific for an epitope from any of the virion proteins. In turn, the epitope-specific CD4+ T cells provide intermolecular (also known as noncognate or heterotypic) help to B cells to generate antibody responses against any protein from the whole virion. This viral intermolecular help model in which CD4+ T cells provide help to B cells with different protein specificities was established in small size influenza virus, hepatitis B virus and viral particle systems. For large and complex pathogens such as vaccinia virus and bacteria, the CD4+ T cell-B cell interaction model may be complicated because B cells might not be able to internalize the large whole pathogen. Recently, a study in mice observed that CD4+ T cell help is preferentially provided to B cells with the same protein specificity to generate antibody responses against vaccinia virus. However, for larger pathogens such as vaccinia virus and bacteria the CD4+ T cell-B cell interaction model has yet to be tested in humans. In Chapter V, I measured in 90 recently vaccinated and 7 long-term vaccinia-immunized human donors the CD4+ T cell responses and antibody responses against four vaccinia viral proteins (A27L, A33R, B5R and L1R) known to be strongly targeted by cellular and humoral responses. We found that there is no direct linkage between antibody and CD4+ T cell responses against each protein. However, the presence of immune responses against these four proteins is linked together within donors. Taken together, our data indicated that individual viral proteins are not the primary recognition unit and CD4+ T cells provide intermolecular help to B cells to generate robust antibody responses against large and complicated vaccinia virus in humans.

Les particules fines atmosphériques (PF) sont capables de pénétrer dans les poumons où certains composés transportés peuvent interagir avec les cellules pulmonaires et atteindre la circulation sanguine. L'exposition aux PF affecte particulièrement les populations sensibles telles que les personnes agées. Cette thèse s'inscrit dans une démarche d'identification des effets des PF sur les lymphocytes T humains (LT) tout en visant à déterminer des biomarqueurs liés à l'exposition et à évaluer la variation de la réponse cellulaire en fonction de l'âge. Des LT ont été isolés de prélèvements sanguins de 91 volontaires appartenant à trois classes d'age (20-30, 45-55, 70-85 ans) puis exposés ex vivo pendant 72h à 45 µg/µl de PF collectées à Dunkerque. Les étapes d'isolement, purification et activation des LT ont d'abord été optimisées. Suite à la caractérisation de la population échantillonnée, une population d'étude homogène a été sélectionnée ( 10 sujets / classe d'âge). Nous avons mis en évidence une induction génique d'enzymes impliquées dans l'activation métabolique des HAP identifiés dans l'échantillon de PF. La caractérisation du profil des Lt a permis de proposer un profil mixte Th1/Th2 causé par l'exposition. L'étude transcriptomique des miARN a mis en évidence une surexpression de miR-124-3p impliqué dans la régulation de plusieurs fonctions au niveau du système immunitaire et de miR-1290 impliqué dans plusieurs types de cancer. Quant à l'influence de l'âge, une surexpression des gènes codant pour les enzymes antioxydantes (NQO1 et HMOX1), une augmentation de la concentration des cytokines (IL-4 et IL-13) ainsi qu'une modification du profil d'expression de certains miARN ont été notées chez les sujets les plus âgés. / Atmospheric fine particulate matter (FP) are able to enter the lungs where some compounds can interact with lung cells and reach the bloodstream . Exposure to FP affects in particular susceptible populations such as the elderly. This thesis is part of a project aiming to identify the effects of FP on human T lymphocytes (LT) while attempting to determine biomarkers related to exposure and to evaluate the variation of the cellular response as a function of age. LT were isolated from blood samples of 91 volunteers belonging to three age groups (20-30, 45-55, 70-85 years) then exposed ex vivo for 72h to 45 µg/µl of FP collected in Dunkirk. The steps of isolation, purification and activation of LT were first optimized. Following the characterization of the sampled population, a homogeneous study population was selected (10 subjects/age class). We have demonstrated an induction of the genes coding for the enzymes involved in the metabolic activation of PAH identified in the PF sample. Characterization of the LT profile made it possible to propose a mixed th1/th2 profile cause by the exposure. Teh transcriptomic study of miRNAs revealed an overexpression of miR-124-3p involved in the regulation of several functions in the immune system and miR-1290 involved in several types of cancer. As for the influence of age, overexpression of the genes coding for the antioxidant enzymes (NQO1 and HMOX1), an increase in the concentration of cytokines (IL-4 and IL-13) as well as a modification of the expression profile of some miRNAs were noted on the elderly.

Le système immunitaire humain est majoritairement commandé par les cellules dendritiques et les lymphocytes T auxiliaires. Lorsque les cellules dendritiques détectent un pathogène, elles vont instruire les lymphocytes T auxiliaires afin qu’ils adoptent le phénotype approprié à la menace rencontrée. Les lymphocytes T auxiliaires peuvent être divisés en plusieurs sous-populations, caractérisées par la production de cytokines spécifiques. Chaque sous-population de lymphocyte T auxiliaire possède des fonctions propres et est impliquée dans l’élimination de pathogènes distincts. Si les réponses des lymphocytes T auxiliaires ne sont pas finement régulées, ils peuvent devenir pathogéniques, et dans ce cas, considérés comme cibles potentielles pour des thérapies. Dans ce contexte, j’ai concentré mon travail de doctorat sur l’étude de la diversité des sous- populations de lymphocytes T auxiliaires et de leur régulation. Premièrement, j’ai démontré que les cellules dendritiques activées par la TSLP sont capables d’induire la polarisation de lymphocytes T folliculaires. Ensuite, j’ai participé à la construction d’un modèle mathématique capable de prédire la réponse lymphocytaire T auxiliaire en fonction de signaux dérivés des cellules dendritiques. Ce modèle nous a permis d’identifier un rôle spécifique pour l’IL-12p70, dépendant du contexte IL-1, dans l’induction d’IL-17F sans IL-17A. Enfin, j’ai monitoré huit populations de lymphocytes T auxiliaires et folliculaires dans le sang périphérique de patients atteints de dermatite atopique traités par Dupilumab, une immunothérapie ciblant la sous-unité alpha du récepteur de l’IL-4 et j’ai pu montré que la diminution du pourcentage de lymphocytes Th17 correlait avec l’amélioration du score clinique EASI. Globalement, mon travail sur la diversité de phénotypes Th apporte une ressource mécanistique importante, avec une potentielle application en immunothérapie. / Human immunity is essentially driven by dendritic cells and T helper cells. When dendritic cells detect a pathogen, they will instruct T helper cells to adopt the adapted phenotype for the specific threat encountered. T helper cells are subdivided in multiple subsets, characterized by particular sets of cytokines. Each T helper subset has specific functions and is involved in the clearance of distinct pathogens. If T helper responses are not precisely regulated, they can become pathogenic, in this case T helper pathways can be considered as potential targets for therapy. In this context, I focused my PhD work on studying T helper cell subset diversity and regulation. First, I demonstrated the ability of TSLP-activated dendritic cell to induce T follicular helper cell polarization. Then I participated in building a mathematical model capable of predicting T helper cell response to dendritic-cell derived signals. This model allowed us to identify the specific role of IL-12p70, in an IL-1 context, to induce IL-17F without IL-17A. Finally, I monitered eight T helper and T follicular helper cell populations in peripheral blood from atopic dermatitis patients treated with Dupilumab, an immunotherapy targeting the IL-4 receptor alpha subunit, and was able to show a correlation between decrease of Th17 cell percentage and improvement of EASI clinical score. Overall, my work on Th phenotype diversity provides key mechanistic insight with potential application in immunotherapy.

Soybean oil (SBO), menhaden fish oil (FO), chicken fat (CF) or hydrogenated soybean oil (HSBO) were incorporated at 5% of the total diet to study changes in the immunological status of both Japanese quail (JAP) and Bobwhite quail (BOB). The SBO diet, in which 66% of the total fatty acids were polyunsaturated fatty acids (PUFA), was rich in linoleic acid (LA 18:2 n-6), alpha-linolenic acid (ALA 18:3 n-3) and low in saturated fatty acid (SFA). The FO diet which contained about 50% PUFA, had only 40% n-6 fatty acids and 8% n-3 PUFA. The trans fatty acid isomers and other monounsaturated fatty acids (MUFA) were high in the HSBO diet. The diet containing CF provided a relatively balanced fatty acid composition with 18% SFA, 31% MUFA and 50% PUFA. Plasma fatty acid and hepatic fatty acid profiles consistently reflected their respective dietary lipid treatments. There were no differences in the fatty acid profile between blood and liver within respective dietary treatments in the two species. Dietary fatty acids had no effect on antibody titers against sheep red blood cells (SRBC) at 1, 2 and 8 months following the start of dietary lipid treatment in JAP. However, female JAP fed FO had a significantly (p< 0.05) higher antibody production compared to the other dietary lipid treatments at 4 months following the start of fatty acids supplementation. BOB fed either FO or SBO diets had a higher immunoglobulin G production compared to birds fed the CF diet. The total antibody titer was significantly higher in BOB fed SBO compared to CF. Dietary fatty acids had a significant effect on cell-mediated immunity (CMI) as accessed by toe web thickness 24 hours post intradermal injection of phytohemagglutinin-P (PHA) in both JAP and BOB. In general, birds fed a FO diet had a significantly higher CMI response than those fed HSBO. A diet high in n-3 PUFA increased the index of cutaneous basophil hypersensitivity (CBH), while the high trans fatty acid isomers suppressed the CBH response. By observing a CBH response over a 72-hour period in JAP, it was concluded that quail fed CF or SBO had a different peak response time (12 hours post PHA challenge) and amplitude compared with those fed FO or HSBO (24 hours post PHA challenge). Phagocytic ability was not affected by dietary lipid treatments in BOB while the quail fed FO diet had a faster carbon clearance rate. The FO fed JAP had a significantly higher response (p< 0.05) to concanavalin A ensiformis (CONA) compared to HSBO fed birds. There was no difference in B lymphocyte proliferation stimulated by lipopolysacchride (LPS) in female JAP, whereas it was significantly higher in male JAP fed SBO compared to those fed FO and HSBO. Phorbol 12-myristate 13-acetate/ionomycin calcium salt (PMA/ION) was used to nonspecifically stimulate cell proliferation by increasing chromosome mitosis. Dietary FO or HSBO suppressed cell proliferation stimulated by PMA/ION. However, JAP fed SBO or CF had a significantly higher PMA/ION stimulated lymphocyte proliferation compared those fed FO or HSBO. In male BOB, the FO fed birds had the highest response to all mitogens. In contrast, female BOB did not show any dietary effects by lymphocyte proliferation. Consistent with JAP, BOB fed HSBO had depressed lymphocytes proliferation in response to various mitogens stimulation. In general, female birds had a higher plasma total protein (PTP) and lower pack cell volume (PCV) compared to their males counterparts in both BOB and JAP. In summary, in in vivo experiments, feeding a diet high in menhaden fish oil that is rich in n-3 PUFA enhanced the CMI. There was a minimal effect on antibody production caused by feeding n-3 PUFA in JAP since a significant treatment effect was only found at one sampling period, while BOB were more sensitive to dietary lipid manipulation and had a higher antibody production with SBO or FO treatments. Dietary lipids exerted different effects in the two species in in vitro experiments. While both BOB and JAP fed FO had higher lymphocyte proliferation to CON A mitogen compared to those fed HSBO, only male BOB showed a higher proliferation to LPS. Feeding HSBO that contained a higher content of trans fatty acid isomers, MUFA, but lower PUFA content resulted in the lowest lymphocyte proliferation to various mitogens in both BOB and JAP. / Ph. D.