Düsseldorf, Univ., Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Düsseldorf, Universiẗat, Diss., 2003.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--Darmstadt.

Abstract Two regions of the genome of the Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis bacteriophage LL-H were characterized, representing 14 % of the phage genome. The first region of 2497 bp contained genes encoding phage structural proteins and the second region of 2498 bp genes involved in lytic functions. The nucleotide sequences of the major capsid protein gene g34, a putative capsid morphogenesis gene (ORF178A), the gene mur encoding phage cell wall hydrolase (lysin), the gene hol (ORF107) encoding the cell membrane permeabilizing phage holin, and six other genes with unknown function were found. Identification of these genes was performed by amino acid sequencing of their encoded proteins (genes g34 and mur), by their physiological effect on E. coli (genes hol and mur), by sequence comparison (genes mur, hol, ORF178A), and by biochemical analysis of their encoded purified protein (gene mur). A promoter for the capsid protein encoding gene cluster was determined by primer extension method. A purification method suitable for large scale processing (cation exchange chromatography by expanded bed adsorption method) was developed for the phage LL-H lysin protein Mur. Purified Mur was biochemically determined as a N-acetylmuramidase, which was effective on cell walls of Lb. delbrueckii, Lb. helveticus, Lb. acidophilus and Pediococcus damnosus. Some biotechnological applications for the lysis genes hol and mur or the purified protein Mur are suggested. Mur digests E. coli cell walls inefficiently, but could still be used for lysis of E. coli. Coexpression of the phage LL-H lysin and holin genes yielded to lysis of the E. coli host only at low culture densities. Therefore, some chemicals were tested for their ability to trigger lysis of E. coli cells overexpressing the phage LL-H gene mur. Thymol was found to mimic the physiological effects of the phage holin in a bacterial growth state independent manner. An efficient lysis method utilizing intracellular production of Mur and triggering the lysis with thymol was developed.

In der heutigen Zeit sind ca. 4000 Verbindungen bekannt, denen die Fähigkeit nachgesagt wird, eine Kontaktallergie auslösen zu können. Die Entscheidung, ob ein Stoff hautsensibilisierende Eigenschaften besitzt, wird dabei meist auf der Grundlage von Beobachtungen am Menschen und/oder von tierexperimentellen Befunden getroffen. Bedingt durch den vermehrten Einsatz exotischer Pflanzen und neu entwickelter synthetischer Substanzen im Bereich der Kosmetikindustrie besteht der Bedarf an einer einfachen Methode zur Vorhersage des kontaktallergenen Potentials einer Verbindung. Als zentraler Schritt bei der Manifestierung einer Kontaktallergie wird die Bildung eines Hapten-Carrier-Komplexes aus dem niedermolekularen Kontaktallergen (Hapten) und Hautproteinen (Carrier) angesehen. Zur Abschätzung der Sensibilisierungsfähigkeit kann daher auch die Reaktivität der Substanz oder ihrer Metaboliten gegenüber Proteinen herangezogen werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden neben dem bedeutenden Phytoekzematogen Tulipalin A die bisher wenig untersuchten kontaktallergenen Duftstoffe Geraniol, 7-Hydroxycitronellal, Benzaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, Zimtaldehyd, a-Amyl-zimtaldehyd und Benzylcinnamat hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber peptidgebundenen Aminosäuren untersucht. Verwendet werden für diese Modellversuche Hippuryl-Derivate und Acetyl-Derivate der Aminosäuren Lysin, Histidin, Arginin bzw. Cystein sowie zusätzlich Glutathion. Die dabei gewählten Bedingungen sollen eine Adaption an physiologische Gegebenheiten erlauben. Ziel ist es, zu klären, ob die mit diesen Modellversuchen zu gewinnenden Ergebnisse mit dem bekannten kontaktallergenen Potential der eingesetzten Haptene korrelieren und somit geeignet sind, die Sensibilisierungsfähigkeit einer Substanz vorherzusagen. Über Konjugationsprodukte von Kontaktallergenen mit Peptiden oder Proteinen ist in der Literatur sehr wenig bekannt. Daher ist es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle Produkte der Reaktionen der kontaktallergenen Substanzen mit den nukleophilen Aminosäureseitenketten zu isolieren und zu charakterisieren, um so definierte Hapten-Carrier-Konjugate, die unter physiologisch relevanten Bedingungen entstehen können, zu beschreiben. Aufbauend auf den gefundenen Strukturen sollte es auch möglich sein, Hinweise auf eventuelle Reaktionsmechanismen zu erhalten.

In der heutigen Zeit sind ca. 4000 Verbindungen bekannt, denen die Fähigkeit nachgesagt wird, eine Kontaktallergie auslösen zu können. Die Entscheidung, ob ein Stoff hautsensibilisierende Eigenschaften besitzt, wird dabei meist auf der Grundlage von Beobachtungen am Menschen und/oder von tierexperimentellen Befunden getroffen. Bedingt durch den vermehrten Einsatz exotischer Pflanzen und neu entwickelter synthetischer Substanzen im Bereich der Kosmetikindustrie besteht der Bedarf an einer einfachen Methode zur Vorhersage des kontaktallergenen Potentials einer Verbindung. Als zentraler Schritt bei der Manifestierung einer Kontaktallergie wird die Bildung eines Hapten-Carrier-Komplexes aus dem niedermolekularen Kontaktallergen (Hapten) und Hautproteinen (Carrier) angesehen. Zur Abschätzung der Sensibilisierungsfähigkeit kann daher auch die Reaktivität der Substanz oder ihrer Metaboliten gegenüber Proteinen herangezogen werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden neben dem bedeutenden Phytoekzematogen Tulipalin A die bisher wenig untersuchten kontaktallergenen Duftstoffe Geraniol, 7-Hydroxycitronellal, Benzaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, Zimtaldehyd, a-Amyl-zimtaldehyd und Benzylcinnamat hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber peptidgebundenen Aminosäuren untersucht. Verwendet werden für diese Modellversuche Hippuryl-Derivate und Acetyl-Derivate der Aminosäuren Lysin, Histidin, Arginin bzw. Cystein sowie zusätzlich Glutathion. Die dabei gewählten Bedingungen sollen eine Adaption an physiologische Gegebenheiten erlauben. Ziel ist es, zu klären, ob die mit diesen Modellversuchen zu gewinnenden Ergebnisse mit dem bekannten kontaktallergenen Potential der eingesetzten Haptene korrelieren und somit geeignet sind, die Sensibilisierungsfähigkeit einer Substanz vorherzusagen. Über Konjugationsprodukte von Kontaktallergenen mit Peptiden oder Proteinen ist in der Literatur sehr wenig bekannt. Daher ist es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle Produkte der Reaktionen der kontaktallergenen Substanzen mit den nukleophilen Aminosäureseitenketten zu isolieren und zu charakterisieren, um so definierte Hapten-Carrier-Konjugate, die unter physiologisch relevanten Bedingungen entstehen können, zu beschreiben. Aufbauend auf den gefundenen Strukturen sollte es auch möglich sein, Hinweise auf eventuelle Reaktionsmechanismen zu erhalten.

This thesis "Effect of concentrates feeding on slaughter weight and carcass composition in farmed fallow deer (Dama dama)" evaluates the influence of two different sorts of complementary food and a nutritive supplement to slaughter weight and structure of a fatted body. The literature summary is complemented with results of the experiment conducted on The Mnich Farm near Kardašova Řečice in association with The Institute of Animal Science. Ten-month fallow deers were divided into three groups. Each of them was kept separately, one (the control group No.1) was fed only by pasture, the group No.2 and No.3 were fed by complementary food consisting of barley and oat in a ratio of 2/3:1/3 in the amount of 0,4 kg per one head and day. The group No. 3 was extra served by the nutritive supplement containing protected lysine. The animals were weighted at the beginning of the experiment and in the process of slaughter at the age of sixteen months. Fifteen heads of cattle were randomly chosen from every group and they were slaughtered during three days - five at a day from each of group. The animals were transported to the slaughterhouse afterwards where the slaughter preparation was done according to the JUT´s (The Slaughter Preparation of meat stock classification) and the SEUROP´s (The System of Slaughter Preparation of meat stock classification) rules. The differences were statistically compared. Beyond the task the economical evaluation of profitability of complementary food and nutritive supplement admixture to the feeding ration and the slaughter processing effectivity has been made.

Bei der Behandlung solider Tumoren spielen systemisch verabreichte Chemotherapeutika eine wich- tige Rolle. Allerdings akkumulieren diese Therapeutika besser in normalem Gewebe als in Tumoren. Als Ursache für diesen unzureichenden Transport von Medikamenten in den Tumor wurde bisher vor allem die dysfunktionale Tumorvaskulatur diskutiert. Diese befindet sich in einem chaotischen und unreifen Zustand ohne ausreichende Bedeckung der Gefäße mit stabilisierenden Perizyten. Aus dem Zustand der Vaskulatur resultierend erreichen Medikamente den Tumor nur in geringem Ausmaß und werden dort heterogen verteilt. Als Grund für den Zustand der Vaskulatur wur- de ein großer Überschuss an pro-angiogenetischen Faktoren im Tumor ausgemacht. Durch eine anti-angiogenetische Behandlung konnte in präklinischen Modellen für einen gewissen Zeitraum die Tumorvaskulatur „normalisiert“ werden. Dies zeichnete sich vor allem durch Veränderung von zwei wichtigen Parametern für die Medikamenteneinbringung aus: zum Einen kommt es zu einer Reduktion der Gefäßdichte. Zum Anderen zu einer Reifung der Blutgefäße. In einem Teil von Pati- enten scheint dabei der Effekt der Gefäßverbesserung zu überwiegen und es kann eine verbesserte Perfusion detektiert werden. Mutmaßlich führt dies auch zu einer verbesserten Einbringung von Therapeutika in den Tumor und so zu einer erhöhten Effizienz der Therapie. In einem weiteren Teil der Patienten scheint jedoch der Effekt der Gefäßreduktion zu überwiegen und die detektierte Perfusion im Tumor wird durch die Behandlung verringert. Das in dieser Arbeit verwendete MT6-Fibrosarkom-Modell reagierte auf eine anti-angiogenetische Therapie nicht mit einer sonst in murinen Modellen beobachteten Wachstumsreduktion. Die- se ermöglichte eine so bisher nicht mögliche Untersuchung der sekundären Effekte einer anti- angiogenetischen Therapie wie die Medikamenteneinbringung in den Tumor. Die Vaskulatur in MT6-Tumoren zeigte dabei nach einer anti-angiogenetischen Vorbehandlung, die erwarteten Merk-male einer „normalisierten“ Vaskulatur wie eine Reduktion der Gefäßdichte bei gleichzeitiger Rei- fung der verbleibenden Gefäße. Dies führte jedoch nicht zu einer verbesserten Effizienz einer subsequenten Chemotherapie. Durch Vergleich mit einem weiteren Tumor-Modell, dem 4T1-Modell für ein metastasierendes Mammakarzinom, konnten signifikante Unterschiede im Gefäßbild beider Modelle ausgeschlossen werden. Durch mikroskopische Methoden konnte dabei beobachtet werden, dass die Diffusion von Medikamenten aus den Blutgefäßen des MT6-Modells im Vergleich zum 4T1-Modell verringert war. Weitere Untersuchungen deuten auf eine Differenz in der Qualität der extrazellulären Matrix der verwendeten Tumor-Modelle. Durch mRNA-Expressionsanalysen konnte die Enzymfamilie der Lysyloxidasen als mögliche Ursache für diesen Diffusionsunterschied identi- fiziert werden. Lysyloxidasen katalysieren vor allem die Quervernetzung von Proteinen der Extra- zellulärmatrix. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Quervernetzung von Matrixproteinen durch Lysyloxidasen ursächlich für die Diffusions-Inhibierung kleiner Moleküle wie das Chemo- therapeutikum Doxorubicin sein kann. Durch spezifische Inhibition der Lysyloxidasen mittels des Inhibitors βAPN konnte diese Diffusions-Inhibition sowohl in vitro als auch im MT6-Tumor-Modell nahezu vollständig verhindert werden. Die hohe Aktivität von Lysyloxidasen im MT6-Modell stell- te allerdings kein Alleinstellungsmerkmal dieses Modells dar. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Lysyloxidasen in einer Vielzahl von murinen und humanen Tumorzelllinien überexprimiert wird. Die Inhibition von Lysyloxidasen durch βAPN konnte dabei in allen unter- suchten Modellen die Einbringung von Medikamenten in den Tumor erhöhen und könnte so eine sinnvolle adjuvante Maßnahme zur Verbesserung bestehender Chemotherapien darstellen. / Systemically administered chemotherapeutics play a major role in in the treatment of so- lid tumors. However, these chemotherapeutics accumulate better in healthy tissue than in tumors. The reason for this insufficient transport of drugs into the tumor could be the dysfunctional tumor vasculature, which is in a chaotic and immature state without an adequate vessel coverage by stabilizing pericytes. As a result of this vasculature, only small amounts of drugs reach the tumor and are further just heterogeneously distributed. A great abundance of pro-angiogenic factors in the tumor was believed to cause this insufficient vasculature. In pre-clinical models, „normalization“ of the tumor vasculature could be achieved with anti-angiogenic therapy for a certain period of time. This was characterized by changes in two important parameters for drug administration: on the one hand reduction of vessel density, on the other hand maturation of blood vessels. In one part of patients, the effect of vessel normalization seems to be predominant leading to improved perfusion. Presumably, this leads to improved administration of chemotherapeu- tics into the tumor and therefore to a more efficient therapy. In another part of patients, the effect of vessel reduction seems to be predominant and the detectable perfusion in the tumor is decreased. The MT6 fibrosarcoma model, which was used in this work, did not respond to the anti-angiogenic therapy with an inhibition of tumor growth as usually observed in murine models. This observation enabled a so far not possible investigation of the secondary effects of an anti-angiogenic therapy, such as drug transport into the tumor. After the anti-angiogenic pre-treatment, the vasculature of MT6 tumors indicated the expected characteristics of a „normalized“ vasculature, such as reduction of vessel density and simultaneous maturation of remaining vessels. However, this did not lead to improved efficacy of subsequently administered chemotherapy. Comparison with another tumor model, the 4T1 model for metastasizing mamma carcinoma, did not reveal signifi- cant differences in the vessel pattern. Observation with microscopic methods indicated a reduced diffusion of drugs from the blood vessels of the MT6 model compared to those of the 4T1 model. Further investigations showed differences in the quality of the extracel- lular matrix of both used tumor models. mRNA expression analyses revealed the family of lysyl oxidases as a putative cause for the differences in diffusion. Lysyloxidases catalyze primarily the cross-linking of proteins of the extracellular matrix. Moreover, it was shown that the cross-linking of matrix proteins by lysyl oxidases is causative for the inhibition of diffusion of small molecules such as the chemotherapeutic doxorubicin. A specific inhibi- tion of lysyl oxidases with the inhibitor βAPN could almost entirely prevent the inhibition of diffusion in vitro and in the MT6 model. However, the high activity of lysyl oxidases in the MT6 model is not a unique feature of this model. Further investigations showed, that lysyl oxidases are over expressed in many human and murine tumor cell lines. In all investigated models, inhibition of lysyl oxidases with βAPN improved drug transport into the tumor and βAPN could therefore be a reasonable adjuvant therapy to improve the efficacy of already existing chemotherapeutics.

Der Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer Binding Protein beta (C/EBPbeta) reguliert die Genexpression, Proliferation und Differenzierung in verschiedenen Zelltypen. Die Funktion von C/EBPbeta wird durch Interaktionen mit einer Reihe von Kofaktoren moduliert, die Bestandteile von Chromatin-verŠndernden oder Transkriptions-regulierenden makromolekularen Maschinen sind. Die Identifikation und funktionelle Charakterisierung dieser Kofaktoren trŠgt ma§geblich zum VerstŠndnis der Biologie von C/EBPbeta bei. C/EBPbeta wird zudem in vielfŠltiger Weise posttranslational reguliert. Beispielsweise kann C/EBPbeta phosphoryliert, SUMOyliert, acetyliert und an mehreren Positionen an Arginin- und Lysinresten methyliert werden. Die SUMOylierung von C/EBPbeta gilt als SchlŸsselmodifikation, die nachfolgende Modifikationen steuert und zu einer VerŠnderung der genregulatorischen Eigenschaften von C/EBPbeta fŸhrt. C/EBPbeta bindet an zwei Enzyme der SUMOylierungsmaschinerie, Ubc9 und PIAS3. Es konnte gezeigt werden, dass PIAS3 nicht nur als E3-Ligase bei der SUMOylierungsreaktion dient, sondern auch mit SUMO-modifiziertem C/EBPbeta interagieren und als transkriptioneller Repressor wirken kann. Um weitere Interaktionspartner von C/EBPbeta zu identifizieren wurde ein System zur Proteom-weiten Identifikation von Bindungspartnern etabliert. Dazu wurden radioaktiv markierbare Proteinsonden hergestellt, welche die Identifikation von Bindungspartnern auf Protein-Macroarrays ermšglichten. Neben der transaktivierenden DomŠne (TAD) wurde die regulatorische Region in ihrer SUMOylierten und nicht-modifizierten Form in Screening-Experimenten eingesetzt. Eine Vielzahl von neuen C/EBPbeta-Bindungspartnern konnte identifiziert werden, wobei die konstitutive SUMOylierung C/EBPbeta-Interaktionen verŠndern kann. Bei den identifizierten Proteinen handelt es sich um Mitglieder der Polycomb Gruppe, Chromatin-modifizierende Enzyme, SignaltransduktionsmolekŸle und transkriptionelle Koregulatoren. Wissenschaftlich besonders interessant war die Identifikation der Lysin-Methyltransferase H3-K9-HMTase 3 (G9a) als Bindungspartner der transaktivierenden Region von C/EBPbeta. Diese Interaktion wurde durch GST-Bindungs- und KoimmunoprŠzipitationsstudien bestŠtigt. Durch massenspektrometrische Analysen konnte Monomethylierung der AminosŠuren K39 und K168 in C/EBPbeta nachgewiesen werden. Dadurch ergab sich die Vermutung, dass G9a nicht nur die Methylierung von Histon H3 katalysiert, sondern auch fŸr die Methylierung und Regulation von C/EBPbeta verantwortlich ist. Rekombinantes C/EBPbeta konnte durch G9a in vitro methyliert werden. Koexpression von C/EBPbeta und G9a fŸhrte zu einer Reduktion der transaktivierenden Eigenschaften von C/EBPbeta in AbhŠngigkeit von der katalytischen SET-DomŠne von G9a. Dieser Reduktion konnte durch Mutation der AminosŠuren K39 und K168 in Alanin entgegengewirkt werden. Als Bindungspartner der C/EBPbeta TAD konnte au§erdem die intrazellulŠre DomŠne von Notch1 (Notch1-ICD) identifiziert werden. Der Notch-Signalweg ist ein evolutionŠr konservierter Genschalter, der an vielen Entscheidungen in der Entwicklung sowie bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im adulten Organismus, wie z. B. akuter lymphatischer T-Zell LeukŠmie (T-ALL), beteiligt ist. Die Interaktion zwischen Notch1-ICD und C/EBPbeta konnte in GST-Bindungsexperimenten und KoimmunoprŠzipitationsstudien verifiziert werden. In Reportergenstudien wurde eine Stimulation der C/EBPbeta-abhŠngigen Transkription durch Notch1-ICD beobachtet. C/EBPbeta ist demnach ein ZielmolekŸl des Notch1-Signalweges. / The transcription factor CCAAT/Enhancer Binding Protein beta (C/EBPbeta) regulates gene expression, proliferation and differentiation of various cell types. The function of C/EBPbeta is modulated by a number of co-factors which are components of macromolecular machines that alter the state of chromatin or that regulate gene transcription. Identification and functional characterisation of these co-factors is crucial for understanding the biology of C/EBPbeta. C/EBPbeta is regulated by a number of posttranslational modifications and can be found in phosphorylated, SUMOylated, acetylated and arginine- or lysine-methylated forms. SUMOylation of C/EBPbeta is considered a key modification which controls subsequent modifications. These modifications alter the gene regulatory functions of C/EBPbeta. C/EBPbeta binds two enzymes of the SUMOylation machinery, Ubc9 and PIAS3. This study shows that PIAS3 not only has E3-ligase activity during the SUMOylation of C/EBPbeta, but also interacts with SUMO-modified C/EBPbeta leading to repression of transcription. A proteome-wide screening procedure was established to identify novel interaction partners of C/EBPbeta. It was based on radioactively labelled proteins that can be utilized as probes to identify binding partners on solid phase protein-macroarrays. The C/EBPbeta transactivation domain (TAD) and its regulatory region in SUMOylated and non-SUMOylated form were used in different screening approaches. Using this procedure a number of novel C/EBPbeta interaction partners were identified, that depended in part on the SUMOylation status of C/EBPbeta. The major part of the C/EBPbeta-interacting proteins are members of the Polycomb group, chromatin-modifying enzymes, signal transduction molecules and transcriptional co-regulators. Interestingly, the lysine-methyltransferase H3-K9-HMTase 3 (G9a) was among the binding partners of C/EBPbeta that interacted with the TAD. This interaction was verified by GST-pulldown and co-immunoprecipitation studies. Mass spectrometrical analysis identified the amino acids K39 and K168 of C/EBPbeta to be mono-methylated. Therefore it was speculated that G9a not only catalyzes the methylation of Histone H3 but may also methylate and regulate C/EBPbeta. Indeed, recombinant C/EBPbeta could be methylated by G9a in vitro. Co-expression of C/EBPbeta and G9a resulted in a reduction of the transactivating potential of C/EBPbeta, which depended on the catalytical SET domain of G9a. This reduction could be counteracted by mutating the amino acids K39 and K168 to alanine. In addition to G9a, the Notch1 intracellular domain (Notch1-ICD) could also be identified as a novel binding partner of the C/EBPbeta TAD. Notch is a component of an evolutionary conserved pathway that acts on numerous physiological and pathophysiological processes during development and in the adult, e.g. T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). The interaction between Notch1-ICD and C/EBPbeta could be verified in GST-pulldown studies and by co-immunoprecipitation. Reporter gene studies showed a stimulation of C/EBPbeta-dependent transcription through Notch1-ICD. C/EBPbeta is therefore a novel target molecule of the Notch1 signaling pathway.

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