Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Dresden.

L'endosymbiose racinaire entre les plantes et les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) permet aux plantes d'avoir un meilleur accès aux nutriments du sol. Pour cette raison, cette endosymbiose joue un rôle majeur dans les écosystèmes et pour l'agriculture durable. Les étapes clés de la colonisation des racines par les CMA sont: 1) la pénétration des CMA dans le système racinaire à travers les cellules de l'épiderme et du cortex externe, et 2) la formation dans les cellules du cortex interne d'une structure ramifiée appelée arbuscule, qui permet des échanges entre les cellules végétales et les hyphes fongiques. L'établissement de cette symbiose implique une communication entre les deux partenaires. Les plantes produisent des hormones, les strigolactones qui induisent chez les CMA la production de signaux symbiotiques : des lipo-chitooligosaccharides (Myc-LCO) et des chitooligosaccharides courts (Myc-COs). Les Myc-LCO et les Myc-CO induisent des réponses moléculaires et physiologiques chez les plantes qui sont capables de former des mycorhizes à arbuscules. Cependant, leur rôle exact dans l'établissement des mycorhizes à arbuscules n'est pas connu. La difficulté à cultiver et transformer le partenaire fongique de cette symbiose rend la recherche compliquée du côté fongique. Du côté des plantes, on sait que des membres de la famille des récepteurs kinases à domaines lysin (LysM-RLK) perçoivent des LCO et des CO produits par divers microorganismes et sont donc de bons candidats pour percevoir des Myc-LCO et des Myc-CO. La plupart des recherches sur les mycorhizes à arbuscules sont réalisées chez des légumineuses, espèces chez lesquelles plusieurs duplications de gènes codant les LysM-RLK ont eu lieu. J'ai donc utilisé lors de mon doctorat des Solanaceae (Solanum lycopersicum, Petunia hybrida et Nicotiana benthamiana) pour étudier le rôle de deux récepteurs putatifs de Myc- LCO, codés par les gènes LYK10 et LYK4. Ces deux gènes, physiquement proches l'un de l'autre dans les génomes de la plupart des dicotylédones, proviennent probablement d'une ancienne duplication en tandem. En utilisant une approche biochimique, nous avons montré que SlLYK10 de S. lycopersicum est capable de lier des LCO avec une haute affinité. De plus, j'ai montré que le promoteur de SlLYK10 est exprimé dans l'épiderme et le cortex externe avant la colonisation par les CMA, puis dans des cellules contenant des arbuscules au cours de la colonisation par les CMA. Enfin, des approches de génétique inverse chez la tomate et le pétunia ont permis de démontrer que LYK10 contrôle la pénétration des CMA dans les racines et la formation des arbuscules. Ces résultats suggèrent que LYK10 perçoit les LCO et active chez les plantes la machinerie nécessaire à la pénétration de CMA dans les cellules végétales et à la formation des arbuscules. / The root endosymbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) allows the plants to have a better access to soil nutrients. For this reason this endosymbiosis plays a major role in ecosystems and in sustainable agriculture. The key steps for AMF colonization are: 1) the AMF penetration in the root system through crossing epidermal/outer cortical cells, and 2) the formation of a branched inner cortex structure called arbuscules that permits exchanges between plant cells and fungal hyphae. The establishment of this symbiosis involves communication between the two partners of the symbiosis. Plants produce strigolactones, hormones that induce in AMF the production of symbiotic signals : lipo-chitooligosaccharides (Myc-LCOs) and short chitooligosaccharides (Myc-COs). Both Myc-LCOs and Myc-COs induce plant molecular and physiological responses known to be associated with the formation of arbuscular mycorrhiza (AM). However, theit exact role in AM establishment is unknown. The difficulty to grow and transform the fungal partner of this symbiosis makes the research complicated on the fungal side. On the plant side, members of the lysin motif receptor-like kinase (LysM-RLK) family are known to perceive LCOs and COs produced by various microorganisms and are thus good candidates to perceive Myc-LCOs and Myc-COs. Most of the laboratory researches on AM conducted worldwide are performed on legumes where the LysM-RLK family has encountered several gene duplications. During my PhD I used Solanaceae species (Solanum lycopersicum, Petunia hybrida and Nicotiana benthamiana) to study the role of two candidate Myc-LCO receptors encoded by the genes LYK10 and LYK4. These two genes are physically close to each other in genomes of most of the dicotyledons and likely originate from of an ancient tandem duplication. By using a biochemical approach, we showed that S. lycopersicum SlLYK10 is able to bind LCOs with high affinity. Moreover, I showed that SlLYK10 promoter is expressed in epidermis/outer cortex before AMF colonization and also in arbuscule-containing cells during colonization. Finally, reverse genetic approaches in tomato and petunia allowed demonstrating that LYK10 controls AMF penetration into the roots and arbuscule formation. Taken together, these results suggest that LYK10 perceive LCOs and induce/activate the plant machinery required for AMF penetration into plant cells. Altogether this strongly suggests that LCOs play a role in AMF perception by plant during AM establishment. By using the same approaches, we found that N. benthamiana NbLYK4, as its orthologs in legumes and other dicotyledons, also binds LCOs with high affinity and is involved in AM establishment and plant defence. NbLYK4-silenced plants showed reduced responses to defence elicitors and increased colonization by pathogens and AMF. This led to the hypothesis that LYK4 perceives LCOs and locally inhibits plant defence during AMF colonization. This strongly suggests that Myc-LCOs are able to regulate plant defence. In conclusion, at least two proteins are involved non-redundantly in LCO perception in Solanaceae, LYK10 and LYK4 and regulates complementary plant machineries required for AMF colonization.

The study deals with interactions of polyelectrolytes polystyrene sulfonate and hyaluronic acid with nitrogenic amphiphilic substances, represented by lysine and albumine. To study the interactions pH-metry, conductance, viscositic and turbidity measurement, DLS and reometry were used. All mixtures of different concentrations were measured and the data were compered with data obtained from measurement of samples with amphiphilic sumstances without polyelectrolytes. Observed interactions occured in the aminoacid concentrations between 0 to 20 mmoldm-3, then the PSS interaction groups were fully bonded by lysine and no more interactions were recognized. The same behaviour were observed in albumine solutions with concentration under 2 gdm-3.

Die zentromerischen Regionen eukaryotischer Chromosomen sind notwendig für die Segregation der Schwesternchromatiden während der Zellteilung. In den Nukleosomen in diesen Regionen ist das kanonische Histon H3 durch die zentromerische Histon H3 Variante CENP-A ersetzt. Diese wird in Saccharomyces cerevisiae Cse4 genannt. Indem CENP-A die geordnete Assemblierung einzelner Untereinheiten des Kinetochors vermittelt, spezifiziert es die zentromerische Chromosomenregion und ist damit essentiell für die korrekte Segregation der Chromosomen während der Zellteilung. Kürzlich wurde gezeigt, dass Cse4 posttranslational modifiziert wird. Von Bedeutung für diese Arbeit sind die in der essentiellen Domäne des N-terminus liegenden Methylierung von Arginin 37 und die Acetylierung von Lysin 49, die durch phänotypische Suppression eine genetische Interaktion und eine antagonistische Funktion bei der epigenetischen Regulation in der korrekten Assemblierung der Kinetochoruntereinheiten zeigen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Acetylierung an Cse4K49 von der Histonacetyltransferase Gcn5 abhängt, und dass dieses Enzym Komponenten des SAGA-Komplexes, aber nicht des ADA-Komplexes benötigt. Außerdem konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Acetylierung von K49 in der frühen S-Phase ansteigt und zum Ende der S-Phase abnimmt. Es konnte weiterhin eine biochemische Interaktion der N-terminalen Domäne von Cse4 mit der COMA-Untereinheit Ctf19, der zentralen Region des Kinetochors, nachgewiesen werden, möglicherweise mit einer Präferenz zu einer nicht acetylierten Form von Cse4K49. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Transkriptions-Co-Aktivator Komplex SAGA eine Funktion an der zentromerischen Region in S. cerevisiae aufweist. Des Weiteren ist die Acetylierung an Cse4K49 in die Rekrutierung der Kinetochoruntereinheit Ctf19 involviert, und gibt damit einen Hinweis auf einen epigenetischen Regulationsmechanismus während der Chromosomensegregation. / The centromeric regions of eukaryotic chromosomes are essential for proper chromosome segregation. The nucleosomal composition in these regions differs from that of canonical nucleosomes in that histone H3 is replaced by the H3 variant CENP-A, which is termed Cse4 in Saccharomyces cerevisiae. CENP-A is the most important epigenetic mark on centromeres and essential for accurate kinetochore establishment at centromeric sites, which in turn are necessary to connect the centromeric sites to the microtubules. Whereas the histone fold domain of Cse4 shares a sequence homology with canonical histone H3, the N-terminal domain is rather long as compared to canonical histone tails and the centromeric histone variants of higher eukaryotes. One part of this flexible, positively charged histone tail has been shown to represent an essential N-terminal domain (END). Lysine 49 was defined as an acetylation site in this region, but the modification remains to be characterized in detail. In this study, we found that the Cse4K49 acetylation is dependent on the histone acetyltransferase Gcn5, and that the enzyme in this context acts within the SAGA/SLIK complex, whereas an involvement of the smaller ADA complex was not observed. Furthermore, we addressed the cell-cycle dependence of the K49 acetylation and found an increase in early S-phase and a decrease in late S-phase, whereas the R37 methylation persisted throughout S-phase. Ctf19 was found to bind acetylated and unacetylated Cse4K49 with a preference for unacetylated Cse4. The findings presented here show that the transcriptional co-activator complex SAGA functions at centromeric regions in S. cerevisiae, and that the Cse4K49 acetylation has an influence on the recruitment of the kinetochore subunit Ctf19. This suggests an epigenetic regulatory mechanism involving a specific acetylation on the N-terminus of Cse4 in chromosome segregation.

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Einleitung: Die Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (GFE 2014) schlägt ein neues Proteinbewertungssystem für Pferdefutter vor, welches eine ausschließlich praecaecale Absorption von Aminosäuren beim Pferd unterstellt. Es nutzt eine futtermittelkundlich-chemische Fraktionierung des Rohproteins (XP). Die Fraktion des fasergebundenen Proteins (NDIXP = Neutral-Detergenzien-unlösliches Rohprotein) repräsentiert den postileal abbaubaren Proteinanteil. Das praecaecal verdauliche Protein (pcvXP) wird aus dem nicht faserassoziierten Protein (NDLXP = Neutral-Detergenzien-lösliches Rohprotein) geschätzt. Das System ermöglicht auf gleiche Weise die Schätzung der praecaecal verdaulichen Aminosäuren. Das neue System basiert auf der Auswertung von Literaturdaten, weshalb eine In-vivo-Validierung bislang ausstehend ist. Ziele der Untersuchungen: Die Arbeit gibt im ersten Teil einen Überblick über die Gehalte von pcvXP in Futtermitteln der täglichen Fütterungspraxis aus den Gruppen Raufutter, Getreide, Leguminosen und fettreiche Samen, sowie Ergänzungsfuttermitteln für Pferde. Die futtermittelkundliche Betrachtung soll die Frage beantworten, ob der Anteil an pcvXP in Abhängigkeit von Protein- und/oder Fasergehalt der Futtermittel zu erwarten ist. Für die In-vivo-Fütterungsstudie im zweiten Teil der Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Unterschiede in der Proteinbewertung von Futtermitteln nach GFE (2014) im Plasma anhand von Unterschieden im postprandialen (ppr) Verlauf der Aminosäure Lysin nachvollzogen werden können, um die futtermittelkundlich-chemische Bewertung in vivo validieren zu können. Tiere, Material und Methoden: Im ersten Teil der Arbeit wurden 71 Futtermittel mittels Weender-Analyse und Faserfraktionierung nach van Soest analysiert und nach dem neuen Proteinbewertungssystem bewertet. Im zweiten Teil der Arbeit wurden 4 der analysierten Futtermittel (LUC = Luzerne, KF = Ergänzungsfutter für Sportpferde, SES = Sojaextraktions-schrot, sAS = kommerzieller Aminosäurenergänzer mit synthetischen Aminosäuren) in einer Fütterungsstudie (Tierversuch TVV 18/15) auf die ppr Veränderungen von Lysin im Plasma von Pferden hin untersucht. Dazu wurde 8 genüchterten, adulten Wallachen randomisiert eine von drei auf Lysin standardisierten Rationen (LUC, KF + SES, KF + sAS) und eine Kontrollration (KF) gefüttert. Bei gleichem Lysin-Gehalt unterschieden sich die Rationen in der Menge an NDIXP. Lysin wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie im Plasma der Pferde zu den Zeitpunkten 0 und 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 und 480 min ppr, sowie in den Fraktionen NDIXP und NDLXP untersucht. Zur statistischen Auswertung kamen nur Werte von Pferden, welche die komplette Ration gefressen hatten. Alle Daten wurden auf Normalverteilung überprüft (Shapiro-Wilks-Test). Futtermittelkundliche Daten wurden auf lineare Regressionen getestet. Das mittlere pcvXP der Gruppen wurde mittels einfacher ANOVA und Bonferroni Korrektur ausgewertet. Die Plasma Lysin-Werte wurden auf die Einflussfaktoren Zeit und Behandlung (ANOVA und Least Significant Difference Test) getestet und die Flächen unter der Kurve verglichen. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Die pcvXP-Gehalte der 71 Futtermitteln korrelierten mit den Gehalten an XP (r = 0,967; p < 0,01), NDLXP-Gehalten (r = 0,701; p < 0,01) und der Faserfraktion der aschefreien Neutral-Detergenzien-Fasern (aNDFom, r = – 0,573; p < 0,01). Im Fütterungsversuch kam es teilweise zur Verweigerung von Testrationen. In vivo konnte ein alimentärer Effekt auf Lysin im Plasma für KF + sAS und KF + SES im Vergleich zur Kontrolle KF gezeigt werden. Der mittlere Anstieg (± SD) vom Nüchternwert (LysX0) zum Maximalwert für Lysin im Plasma (LysMax) fiel für die Fütterung der Kontrollration KF geringer aus (14,4 ± 13,5 %) als für die 3 anderen Testrationen. Der höchste mittlere Anstieg (± SD) von LysX0 zu LysMax war nach der Fütterung von KF + sAS (110 ± 37,6 %) und KF + SES (92,3 ± 47,7 %) zu verzeichnen. LUC führte mit 75,1 ± 33,6 % ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg, der jedoch geringer ausfiel als für KF + sAS und KF + SES. Der LysMax dieser beiden Rationen wurde 60 min ppr detektiert. Für LUC wurde das LysMax jeweils 120 min ppr ermittelt werden. Die mittlere Fläche unter der Kurve (AUC) (± SD) war am geringsten für KF (n = 7; 22.944 ± 9940 µmol × min/l). Die höchste AUC wurde für KF + sAS gemessen (n = 4; 46.262 ± 18.858 µmol × min/l), welche signifikant höher war als für KF (p = 0,042). KF + SES (n = 8; 40.768 ± 15.399 µmol × min/l) ergab eine signifikant höhere mittlere AUC als KF (p < 0,01). Die AUC für LUC (n = 2, 41.809 ± 11.871 µmol × min/l) war der von KF + SES vergleichbar. Schlussfolgerungen: Bekannte „Proteinträger“ wie z.B. Sojaprodukte, werden auch nach dem neuen System als hochwertige Proteinlieferanten bewertet. Die In-vivo-Ergebnisse zweier Pferde nach Fütterung von Luzerne zeigen hohe ppr Lysin-Anstiege im Blut an. Dies lässt auf eine gute Verfügbarkeit des Lysins aus der Luzerne schließen. Das Proteinbewertungssystem stuft jedoch die Luzerne deutlich schlechter ein, als die In-vivo-Ergebnisse vermuten lassen. In vivo gilt ein Einfluss von Kauprozess und Mikrobiota auf die Lysin-Verfügbarkeit aus der Luzerne als wahrscheinlich. Die Erarbeitung von Korrekturfaktoren für Raufutter wie Luzerne im neuen Proteinbewertungssystem (GFE 2014) erscheint sinnvoll.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Grundlagen der Proteinverdauung beim Pferd 2 2.1.1 Magen 2 2.1.2 Dünndarm 3 2.1.3 Dickdarm 4 2.2 Proteinbewertung von Futtermitteln für Pferde 6 2.2.1 Stickstoffquellen in Pflanzen 6 2.2.2 Analytische Verfahren zur Proteinbewertung 7 2.2.2.1 Rohprotein 7 2.2.2.2 Bewertung des verdaulichen Rohproteins 7 2.2.2.3 Das Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) des Wiederkäuers 7 2.2.2.4 Bewertung des praecaecal verdaulichen Rohproteins 8 2.2.3 In-vivo-Verfahren zur Proteinbewertung 11 2.2.3.1 Verdauungsversuche 11 2.2.3.2 Postprandiale Messung von Aminosäuren im venösen Blut 15 3 Material und Methoden 20 3.1 Versuchsziel 20 3.2 Analytische Proteinbewertung 20 3.2.1 Probenumfang und Probenahme 20 3.2.2 Trockensubstanz und Rohnährstoffe 21 3.2.3 Faserfraktionen nach van Soest 22 3.2.4 Neutral-Detergenzien-unlösliches Protein (NDIXP) und Proteinbewertung nach GFE (2014) 23 3.2.5 Aminosäuren in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP 25 3.3 In-vivo-Proteinbewertung durch Messung postprandial freien Lysins im Plasma 28 3.3.1 Versuchstiere und allgemeine Haltungsbedingungen 28 3.3.2 Versuchsdesign 28 3.3.3 Adaptation und Grundration 29 3.3.4 Testfuttermittel 30 3.3.5 Versuchsrationen 31 3.3.6 Blutentnahmetage 32 3.3.7 Analyse von Totalprotein und freiem Lysin im Plasma 33 3.4 Statistische Methoden 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Futtermittelkundliche Untersuchungsergebnisse 36 4.1.1 Rohnährstoffe der Futtermittelgruppen 36 4.1.2 Proteinbewertung der Futtermittelgruppen 39 4.1.3 Korrelationen ausgewählter Parameter 42 4.1.4 Protein- und Lysin-Bewertung der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 44 4.1.5 Lysin-Gehalte in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 45 4.1.6 Protein- und Lysin-Bewertung der Versuchsrationen 46 4.2 In-vivo-Untersuchungsergebnisse 48 4.2.1 Allgemeine Beobachtungen 48 4.2.1.1 Gesundheitszustand der Pferde 48 4.2.1.2 Gewichtsentwicklung 48 4.2.2 Futteraufnahme der Testrationen 48 4.2.2.1 Futteraufnahmezeit 49 4.2.2.2 Lysin-Aufnahme 49 4.2.3 Lysin-Konzentrationen im Plasma 52 4.2.3.1 Nüchternwerte X0 von Lysin im Plasma 52 4.2.3.2 Postprandiale Lysin-Gehalte im Plasma der Pferde nach vollständiger Aufnahme der Testmahlzeiten 53 4.2.3.3 Gehalte im Plasma in Abhängigkeit der Lysin-Aufnahme 56 4.2.3.4 Lysin-Konzentration im Plasma von Pferd 8 58 5 Diskussion 60 5.1 Kritik der Methoden 60 5.1.1 Auswahl der Futtermittel 60 5.1.2 Versuchsaufbau und Untersuchungsmethoden 61 5.1.3 Futteraufnahme 64 5.2 Diskussion der Ergebnisse 64 5.2.1 Analytische Proteinbewertung 64 5.2.2 In-vivo-Untersuchungen 68 5.3 Schlussfolgerungen 73 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 91 9.1 TABELLENVERZEICHNIS 91 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 9.3 TABELLENANHANG 94 10 Danksagung 108 / Introduction: The Society of Nutrition Physiology (GFE 2014) proposed a new protein evaluation system for horsefeeds, assuming solely a preceacal absorption of amino acids in horses. Therefore, the crude protein (CP) is divided into two different chemical fractions. The fraction of the fibre-bound protein (NDICP = Neutral detergent insoluble crude protein) represents the postileal degradable protein fraction. The precaecal digestible protein (pcdCP) is estimated from the non-fibre-bound protein (NDSCP = Neutral detergent soluble crude protein). Similarly, the system allows the estimation of the precaecal digestible amino acids from chemical analysis. Since in vivo validation is still lacking, the new system is still based on the evaluation of literature data. Aim of the study: In the present study, typical feedstuffs such as roughage, grains, legumes and high-fat seeds, as well as complementary feeds for horses were analyzed for the pcdCP content. The aim of the chemical analysis was to answer the question whether the content of pcdCP depended on the protein and/or fibre content of the feeds. In the second part, an in vivo trial should verify the hypothesis, that the differences in the protein evaluation of feeds according to GFE (2014) are reflected in differences in the postprandial (ppr) kinetics of plasma lysine, in order to validate the prediction of pcdCP based on chemical analysis. Animals, material and methods: The 71 feeds were analysed by Weende analysis and fibre analysis according to van Soest. The feeds were evaluated according to the new protein evaluation system. In the second part of the study 4 selected feeds (LUC = lucerne, CF = complementary feed for sport horses, SES = soybean meal solvent extracted, sAS = supplement with synthetic amino acids) were examined in a feeding trial (animal experiment TVV 18/15) for ppr changes of plasma lysine in horses. After an overnight fasting period, 8 adult geldings were randomly fed one of three rations that were standardized according to the lysine content (LUC, SES, sAS) or a control ration (CF). The meals differed in the amounts of NDICP. Before feeding the test meals and 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 and 480 min ppr plasma was analysed for lysine by high performance liquid chromatography, as well the NDICP and NDSCP fractions of the components of the test meals were analyzed for lysine. All data were statistically assessed by a commercial software package (Statistica®). Data were assessed for normal distribution (Shapiro-Wilks test). The nutrient values of the feedstuffs were tested for linear regression to NDICP, NDSCP and pcdCP. Feedstuffs groups were evaluated by one-way ANOVA with Bonferroni correction. Plasma lysine values were analyzed for variance factoring in the effects of diet and postprandial time (ANOVA). Only data from horses who finished the complete test meals were included in the statistical assessment. The Least Significant Difference test was used for post hoc comparison. The areas under the curve (AUC) were calculated and compared (Mann-Whitney-U test). Level of significance was set at p < 0.05. Results: The pcdCP content correlated with the content of CP (N = 71, r = 0.96712; p < 0.001), NDSCP (r = 0.701; p < 0.001) and the fraction of neutral detergent fibres (aNDFom, r = – 0.5733; p < 0.001). In the feeding trial, some test meals were refused by the horses due to a low palatability. In vivo, a feeding effect on plasma lysine could be shown for sAS and SES compared to the control group. The mean increase (± SD) from the basal value LysX0 to the maximum level for plasma lysine LysMax was lower (14.4 ± 13.5 %) after feeding the control diet CF compared to the other 3 diets. The highest increase (mean ± SD) from LysX0 to LysMax was observed after feeding sAS (110 ± 37.6 %) and SES (92.3 ± 47.7 %). LUC also led to a notable increase (75.1 ± 33.6 %) from LysX0 to LysMax, although, less than for sAS and SES. The LysMax of these two diets were detected 60 min ppr. For LUC the LysMax was determined 120 min ppr. The AUC (mean ± SD) was lowest for CF (n = 7; 22,944 ± 9,940 µmol × min/L). The highest AUC was determined for aAS (n = 4; 46,262 ± 18,858 µmol × min/L), which was significantly higher than for CF (p = 0.042). Also, SES (n = 8; 40,768 ± 15,399 µmol × min/L) led to a significantly higher AUC than CF (p < 0.01). The AUC for LUC (n = 2; 41,809 ± 11,871 µmol × min/L) was comparable to SES. Conclusion: Feeds for horses, well-known as 'protein-rich feeds' such as soybean byproducts, have been confirmed as high-quality protein suppliers under the new evaluation system. Since the in vivo results of two horses fed LUC showed a marked increase in ppr plasma lysine in blood, a high availability of lysine from LUC can be assumed. However, the new protein evaluation system estimates the availability of lysine from LUC considerably lower than suggested by the in vivo results. Most likely, the influence of the chewing process and microbiota on lysine availability from LUC needs to be considered in horses. In conclusion, correction factors for roughages such as LUC with respect to the new protein evaluation system for horsefeeds (GFE 2014) seem to be necessary.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Grundlagen der Proteinverdauung beim Pferd 2 2.1.1 Magen 2 2.1.2 Dünndarm 3 2.1.3 Dickdarm 4 2.2 Proteinbewertung von Futtermitteln für Pferde 6 2.2.1 Stickstoffquellen in Pflanzen 6 2.2.2 Analytische Verfahren zur Proteinbewertung 7 2.2.2.1 Rohprotein 7 2.2.2.2 Bewertung des verdaulichen Rohproteins 7 2.2.2.3 Das Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) des Wiederkäuers 7 2.2.2.4 Bewertung des praecaecal verdaulichen Rohproteins 8 2.2.3 In-vivo-Verfahren zur Proteinbewertung 11 2.2.3.1 Verdauungsversuche 11 2.2.3.2 Postprandiale Messung von Aminosäuren im venösen Blut 15 3 Material und Methoden 20 3.1 Versuchsziel 20 3.2 Analytische Proteinbewertung 20 3.2.1 Probenumfang und Probenahme 20 3.2.2 Trockensubstanz und Rohnährstoffe 21 3.2.3 Faserfraktionen nach van Soest 22 3.2.4 Neutral-Detergenzien-unlösliches Protein (NDIXP) und Proteinbewertung nach GFE (2014) 23 3.2.5 Aminosäuren in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP 25 3.3 In-vivo-Proteinbewertung durch Messung postprandial freien Lysins im Plasma 28 3.3.1 Versuchstiere und allgemeine Haltungsbedingungen 28 3.3.2 Versuchsdesign 28 3.3.3 Adaptation und Grundration 29 3.3.4 Testfuttermittel 30 3.3.5 Versuchsrationen 31 3.3.6 Blutentnahmetage 32 3.3.7 Analyse von Totalprotein und freiem Lysin im Plasma 33 3.4 Statistische Methoden 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Futtermittelkundliche Untersuchungsergebnisse 36 4.1.1 Rohnährstoffe der Futtermittelgruppen 36 4.1.2 Proteinbewertung der Futtermittelgruppen 39 4.1.3 Korrelationen ausgewählter Parameter 42 4.1.4 Protein- und Lysin-Bewertung der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 44 4.1.5 Lysin-Gehalte in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 45 4.1.6 Protein- und Lysin-Bewertung der Versuchsrationen 46 4.2 In-vivo-Untersuchungsergebnisse 48 4.2.1 Allgemeine Beobachtungen 48 4.2.1.1 Gesundheitszustand der Pferde 48 4.2.1.2 Gewichtsentwicklung 48 4.2.2 Futteraufnahme der Testrationen 48 4.2.2.1 Futteraufnahmezeit 49 4.2.2.2 Lysin-Aufnahme 49 4.2.3 Lysin-Konzentrationen im Plasma 52 4.2.3.1 Nüchternwerte X0 von Lysin im Plasma 52 4.2.3.2 Postprandiale Lysin-Gehalte im Plasma der Pferde nach vollständiger Aufnahme der Testmahlzeiten 53 4.2.3.3 Gehalte im Plasma in Abhängigkeit der Lysin-Aufnahme 56 4.2.3.4 Lysin-Konzentration im Plasma von Pferd 8 58 5 Diskussion 60 5.1 Kritik der Methoden 60 5.1.1 Auswahl der Futtermittel 60 5.1.2 Versuchsaufbau und Untersuchungsmethoden 61 5.1.3 Futteraufnahme 64 5.2 Diskussion der Ergebnisse 64 5.2.1 Analytische Proteinbewertung 64 5.2.2 In-vivo-Untersuchungen 68 5.3 Schlussfolgerungen 73 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 91 9.1 TABELLENVERZEICHNIS 91 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 9.3 TABELLENANHANG 94 10 Danksagung 108

The master´s thesis deals with the study of the interaction between the polysaccharide hyaluronan of diffrerent molecular weights with the amino acids arginine, lysine, arginine hydrochloride and 6-aminocaproic acid. They are expected interaction between carboxyl groups of hyaluronan and amino groups of amino acids. These interactions were investigated by using ultrasonic spectroscopy, DLS, measuring pH and conductivity. Obtained results were compared with sodium polystyrene sulfonate. With ultrasonic spectroscopy was observed a change of concentration inkrement for titration of amino acid to water or polymers solutions especially for high molecular weight hyaluronan and for NaPSS in combination with 6AKK in concentration range of added amino acid 0–30 mM. The size of this change could mean a degree of interaction between polymers and amino acids. This theory has not been confirmed by other methods. By pH and conductivity measurements interations between arginine and low molecular weight hyaluronan and NaPSS were only confirmed. There was no possibility to make unequivocal conclusions from determination of particle size and zeta potential by DLS. Overall, the issue of the interaction of amino acids with polyanions was proved above expectations complex and will be appropriate to further expand the observations made in this thesis.

Die Arbeit Synthese dendritischer Redoxverbindungen und deren Einsatz in der Bioanalytik beschreibt die Synthese von Dendrimeren und Dendronen mit benzylisch N-quarternisierten 4,4 -Bipyridinium-Verbindungen (Viologenen) im dendritischen Gerüst. Weiterhin werden Synthesen neuer Nitrilotriessigsäure (NTA)-Verbindungen synthetisiert, die eine disulfidische Gruppe oder einen Pyrrolrest besitzen.Sensorik: Es gelang, in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Wieczorek, mittels eines massenspezifischen Sensorsystems (QCM) die Analyse zweier Proteine (G-Aktin und C-Untereinheit) bezüglich ihrer Interaktion und Stöchometrie nachzuweisen.NTA modifizierte Elektroden: Es wurden verschiedene NTA-Verbindungen auf Goldelektroden immobilisiert und mittels elektrochemischen Methoden und XPS beschrieben. Darüber hinaus gelang eine NTA Modifizierung einer GC-Elektrode. Eine Polypyrrolfilm-Elektrode, welche aktivierte Propansäureesterseitenkette besitzt, wurde mit Aminobutyl-NTA (AB-NTA) verknüpft. Diese modifizierte Elektrode zeigt reversible Nickelionen Aufnahme bzw. Abgabe.Im Bereich der Multielektronen- bzw. hoch geladenen Labels für Proteine wurden kegelförmige, dendritische Viologenderivaten mit funktionalisierten Fokalpunkt hergestellt und diese mit Proteinen derivatisiert (u.a. Cytochrome C). Der Nachweis der nunmehr pH-unabhängigen Oberflächenladungen des Proteins wurde nachgewiesen. (P. Schön et. al., JACS 2005, 127, 11486).

The presented dissertation focuses on non-covalent interactions of hyaluronan of different molecular weights (9–1540 kDa) with basic (oligo)-amino acids (especially arginine) and the antimicrobial peptide cecropin B. High-resolution ultrasonic spectroscopy (HR-US), isothermal titration calorimetry (ITC) and potentiometric titration techniques were chosen to investigate the interactions. The thesis focuses on the characterization of interactions, especially with respect to the used molecular weight of interacting polymers and the ionic strength of the environment. Whether interactions occur or not was determined primarily by the length of the arginine oligomer chain. For monomeric amino acids, the interactions were investigated mainly by potentiometric titrations. Interactions were observable from arginine oligomers with eight monomer units. The molecular weight of hyaluronan mainly affected the intensity of the interactions. The transition between the individual conformations of hyaluronan (rod and random coil) was especially significant. Investigation of interactions was performed in water, in solutions with different concentrations of sodium chloride and in PBS. The sufficiently high ionic strength of the solution was able to suppress the interactions in water between the oligomers of arginine and hyaluronan. The basic antimicrobial peptide cecropin B has been shown to interact with hyaluronan in water but not in PBS. Based on these results, it was possible to conclude that the hyaluronan-cecropin B system would be particularly suitable for topical applications.

Furosin entsteht bei der Salzsäurehydrolyse aus den Amadori-Produkten des Lysins und wird als Marker für den Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion, zur Beurteilung von lebensmitteltechnologischen Prozessen sowie zur Berechnung des verfügbaren und des nicht verfügbaren Lysins in Lebensmitteln verwendet. Für die Nutzung von Furosin als Qualitätsparameter ist die reproduzierbare und konstante Bildung während der Salzsäurehydrolyse entscheidend. Dies wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit galt es deshalb, die molaren Ausbeuten an Furosin und den weiteren Hydrolyseprodukten Lysin, Pyridosin und N[epsilon]-Carboxymethyl-lysin zu bestimmen und damit eine sichere Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Dazu wurden peptid-gebundene Amadori-Produkte des N[alpha]-Hippuryl-lysins in chromatographisch reiner Form dargestellt. Weiterhin wurden N[alpha]-Hippuryl-N[epsilon]-carboxymethyl-lysin und Pyridosin als Standard gewonnen. Bei den Hydrolyseexperimenten zeigten die Fructosyl-Amadori-Produkte ein ähnliches Verhalten. Nach Hydrolyse mit 6M Salzsäure wurden molare Ausbeuten an Furosin von 32% für Fructosyl-lysin und jeweils 34% für Lactulosyl- und Maltulosyl-lysin bestimmt. Signifikant höhere Ausbeuten an Furosin waren nach Hydrolyse mit 8M Salzsäure festzustellen, 46% für Fructosyl-lysin, 50% für Lactulosyl-lysin und 51% für Maltulosyl-lysin. Im Gegensatz zu den Fructosyl-Derivaten war die molare Ausbeute an Furosin bei Tagatosyl-lysin unabhängig von der verwendeten Salzsäurekonzentration (6 bis 8M) und wurde zu 42% bestimmt. Anhand der auf Basis der molaren Ausbeuten ermittelten Überführungsfaktoren kann nun erstmals die Lysin-Derivatisierung mittels der Analytik von Furosin sicher bestimmt werden. Das ermöglicht exakte Aussagen zum Fortschritt nichtenzymatischer Glykierungsreaktionen sowohl in Lebensmittel als auch in vivo. Aufgrund der Relevanz für biologische Systeme und für Lebensmittel wurden weiterhin Reaktionen von alpha-Dicarbonylverbindungen mit kurzkettigen Peptiden und dem Protein Insulin unter physiologischen Bedingungen (pH=7,4 und 37°C) untersucht. Bei der Reaktion von Glyoxal mit ausgewählten Tripeptiden wurde eine sehr schnelle Derivatisierung der Peptide und jeweils die gleichzeitige Bildung eines definierten Produktes festgestellt. Mittels nuklearmagnetischer Resonanzspektroskopie und massenspektroskopischer Analyse konnten die Produkte zweifelsfrei, jeweils als die am N-Terminus durch einen 2(1H)-Pyrazinon-Ring modifizierten Peptide, aufgeklärt werden. Das Hauptprodukt der Reaktion von Methylglyoxal mit dem Peptid Gly-Ala-Phe wurde ebenfalls als 2(1H)-Pyrazinon-Peptid aufgeklärt. Nach Inkubation von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen in verdünnter Lösung konnte weiterhin gezeigt werden, dass die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung ebenfalls an einem Protein erfolgt. Die identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinone weisen charakteristische UV-Absorptions- sowie Fluoreszenz-Spektren auf. Um die Reaktivität des N-Terminus und damit die Bedeutung der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung beurteilen zu können, wurden vergleichende Studien mit dem als Hauptreaktionspartner für alpha-Dicarbonylverbindungen angesehenen Arginin durchgeführt. Bei diesen Experimenten zeigte der N-Terminus und peptidgebundenes Arginin eine nahezu identische Reaktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse ist fest davon auszugehen, dass es sich bei den identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen um eine neue Klasse von sogenannten Advanced Glycation Endproducts (AGEs) mit Bedeutung in physiologischen Systemen und in Lebensmitteln handelt.