In mehrfaktoriellen 2 x 2 x 4 Untersuchungen im Zeitraum vom 7. - 28. Lebenstag und in Bilanzversuchen vom 15. - 20. Lebenstag mit männlichen Broilerküken (Cobb 500) wurden die Effekte der Versuchsfaktoren Zerkleinerung (Hammermühle vs. Walzenstuhl), thermische Behandlung (Konditionierung bei 70°C vs. Konditionierung/Expandierung 100°C) und Zusätze von Zink-Bacitracin bzw. Roxazym G2 (ohne Zusatz, mit Zink-Bacitracin 50 mg, mit Roxayzm G2 150 ppm und deren Zusatzkombination A+E) sowie die Interaktionen untersucht. Als Kriterien dienten die Parameter Futterverzehr, Lebendmassezunahme, Futteraufwand, Nährstoffansatz und -verwertung, ileale Verdaulichkeit von ausgewählten Aminosäuren, Proteinverwertung/Proteinqualität und Umsetzbarkeit der Energie. Die Versuchstiere erhielten ab dem 7. Lebenstag die entsprechenden Versuchsmischungen. Der Gehalt an XP und MEn aller Versuchsmischungen war einheitlich (XP 21,7% und MEn 12,3 MJ/kg Futter). Die Lysinversorgung wurde auf 90 % unter der optimalen Bedarfsdeckung in allen Futtermischungen limitiert. Die Auswirkungen der Versuchsfaktoren lassen sich wie folgt zusammenfassen: - Zerkleinerung : Die Zerkleinerungstechnologie mit dem Walzenstuhl übte einen signifikanten Einfluss auf den Futterverzehr (-3,5 %) und Futteraufwand (-2,8 %) gegenüber der Zerkleinerung mit der Hammermühle aus. Die Nährstoffverwertung (XP und Energie) zeigten durch Walzenstuhl-Zerkleinerung tendenzielle Verbesserungen. Die ileale Lysinverdaulichkeit blieb unverändert, die ileale Verdaulichkeit von Threonin und Met+Cys wurde signifikant erhöht. Die Walzenstuhl-Zerkleinerung führte zu einer besseren Futterstruktur und zu einer höheren Nährstoffdichte in den Pellets. Das wird deutlich durch die höhere N-Aufnahme bzw. N-Bilanz sowie durch gesteigerte N-Verwertungsparameter und einen erhöhten Gehalt an N-korrigierter umsetzbarer Energie (MEn). - Thermische Behandlung : Durch erhöhte Hitzeapplikation mit dem Expander konnten in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der Leistungsparameter, Nährstoffansatz und -verwertung keine Unterschiede gegenüber der Konditionierung festgestellt werden. Die Expandierung führte zu einer signifikant erhöhten ilealen Lysinverdaulichkeit, die durch die gemessene Lysinwirksamkeit im Bilanzversuch jedoch nicht widergespiegelt wurde. Auch signifikant niedrigere N-Bilanz und physiologische Proteinnutzwerte (PNu) sowie die tendenzielle Verringerung der N-Verdaulichkeit und des Gehaltes an umsetzbarer Energie deuten auf eine negative Wirkung der intensiveren thermischen Behandlung durch Expandieren hin. Hierzu sind weitere klärende Untersuchungen notwendig. - Futterzusätze: Durch die alleinige Supplementierung mit dem Antibiotikum Zink-Bacitracin oder NSP-spaltenden Enzym Roxazym G2 bzw. deren Kombination reagierten Mastleistung und Futterverwertung signifikant positiv. Während der Effekt der Enzymzulagen bei Nährstoffverwertung und ilealer Verdaulichkeit ausgewählter Aminosäure signifikant höher gegenüber der unsupplementierten Gruppe war, blieb ein Effekt von Zink-Bacitracin hinsichtlich dieser Parameter aus. Der Effekt der Zusatzkombination war bei Mastleistung, Nährstoffansatz und -verwertung und bei der ilealen Verdaulichkeit der ausgewählten Aminosäuren gegenüber der Kontrolle oder dem alleinigen Zusatz signifikant höher. Das deutet auf einen synergistischen Effekt der gleichzeitigen Applikation der beiden Additive hin. Die N-Verwertung einschließlich des Gehalts an N-korrigierter scheinbar umsetzbarer Energie lag nach alleiniger Applikation von Zink-Bacitracin unerwartet signifikant niedriger gegenüber den anderen Zusätzen bzw. tendenziell gegenüber der Kontrolle. Die Gehalte an scheinbar umsetzbarer Energie (AMEn) waren deutlich durch den Enzymzusatz allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin erhöht. -Interaktionen: Die Abhängigkeit der Versuchsfaktoren voneinander im Mastversuch war nicht stark ausgeprägt. Die Zerkleinerung in Verbindung mit anschließender thermischer Behandlung führte zur Beeinflussung der Futterverzehrsdaten. Danach verbesserten die Verfahrenskombinationen Hammermühle x Konditionierung oder Walzenstuhl x Expandierung bedingt durch einen erhöhten Futterverzehr die Lebendmassezunahme und den Nährstoffansatz signifikant. Hinsichtlich der ilealen Aminosäurenverdaulichkeit zeigten die Futterzusätze eine Abhängigkeit von der Behandlung bzw. Zerkleinerung und Behandlung. Die Enzymzulage allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin zeigte stärkere Effektivität in Verbindung mit der thermischen Behandlung durch Expandieren.

Furosin entsteht bei der Salzsäurehydrolyse aus den Amadori-Produkten des Lysins und wird als Marker für den Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion, zur Beurteilung von lebensmitteltechnologischen Prozessen sowie zur Berechnung des verfügbaren und des nicht verfügbaren Lysins in Lebensmitteln verwendet. Für die Nutzung von Furosin als Qualitätsparameter ist die reproduzierbare und konstante Bildung während der Salzsäurehydrolyse entscheidend. Dies wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit galt es deshalb, die molaren Ausbeuten an Furosin und den weiteren Hydrolyseprodukten Lysin, Pyridosin und N[epsilon]-Carboxymethyl-lysin zu bestimmen und damit eine sichere Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Dazu wurden peptid-gebundene Amadori-Produkte des N[alpha]-Hippuryl-lysins in chromatographisch reiner Form dargestellt. Weiterhin wurden N[alpha]-Hippuryl-N[epsilon]-carboxymethyl-lysin und Pyridosin als Standard gewonnen. Bei den Hydrolyseexperimenten zeigten die Fructosyl-Amadori-Produkte ein ähnliches Verhalten. Nach Hydrolyse mit 6M Salzsäure wurden molare Ausbeuten an Furosin von 32% für Fructosyl-lysin und jeweils 34% für Lactulosyl- und Maltulosyl-lysin bestimmt. Signifikant höhere Ausbeuten an Furosin waren nach Hydrolyse mit 8M Salzsäure festzustellen, 46% für Fructosyl-lysin, 50% für Lactulosyl-lysin und 51% für Maltulosyl-lysin. Im Gegensatz zu den Fructosyl-Derivaten war die molare Ausbeute an Furosin bei Tagatosyl-lysin unabhängig von der verwendeten Salzsäurekonzentration (6 bis 8M) und wurde zu 42% bestimmt. Anhand der auf Basis der molaren Ausbeuten ermittelten Überführungsfaktoren kann nun erstmals die Lysin-Derivatisierung mittels der Analytik von Furosin sicher bestimmt werden. Das ermöglicht exakte Aussagen zum Fortschritt nichtenzymatischer Glykierungsreaktionen sowohl in Lebensmittel als auch in vivo. Aufgrund der Relevanz für biologische Systeme und für Lebensmittel wurden weiterhin Reaktionen von alpha-Dicarbonylverbindungen mit kurzkettigen Peptiden und dem Protein Insulin unter physiologischen Bedingungen (pH=7,4 und 37°C) untersucht. Bei der Reaktion von Glyoxal mit ausgewählten Tripeptiden wurde eine sehr schnelle Derivatisierung der Peptide und jeweils die gleichzeitige Bildung eines definierten Produktes festgestellt. Mittels nuklearmagnetischer Resonanzspektroskopie und massenspektroskopischer Analyse konnten die Produkte zweifelsfrei, jeweils als die am N-Terminus durch einen 2(1H)-Pyrazinon-Ring modifizierten Peptide, aufgeklärt werden. Das Hauptprodukt der Reaktion von Methylglyoxal mit dem Peptid Gly-Ala-Phe wurde ebenfalls als 2(1H)-Pyrazinon-Peptid aufgeklärt. Nach Inkubation von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen in verdünnter Lösung konnte weiterhin gezeigt werden, dass die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung ebenfalls an einem Protein erfolgt. Die identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinone weisen charakteristische UV-Absorptions- sowie Fluoreszenz-Spektren auf. Um die Reaktivität des N-Terminus und damit die Bedeutung der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung beurteilen zu können, wurden vergleichende Studien mit dem als Hauptreaktionspartner für alpha-Dicarbonylverbindungen angesehenen Arginin durchgeführt. Bei diesen Experimenten zeigte der N-Terminus und peptidgebundenes Arginin eine nahezu identische Reaktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse ist fest davon auszugehen, dass es sich bei den identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen um eine neue Klasse von sogenannten Advanced Glycation Endproducts (AGEs) mit Bedeutung in physiologischen Systemen und in Lebensmitteln handelt.

Protein Methyltransferasen sind oftmals fehlreguliert in Tumorzellen und stellen potenzielle Ziele in der Krebstherapie dar. Das SET und MYND Domain enthaltene Protein 2 (SMYD2) wurde als potenzielles Onkogen beschrieben und eine Überexpression korreliert mit einer schlechten Prognose. Für SMYD2 wurden verschiedene Substrate beschrieben u.a. Histon H3 und der Tumorsuppressor p53, allerdings ist die Biologie dieses Enzymes kaum verstanden. Durch die Entwicklung einer Testsubstanz zur spezifischen Hemmung von SMYD2 könnte ein möglicher therapeutischer Nutzen besser untersucht werden. Hierfür wurde ein zellulärer mechanistischer Test zur Messung der SMYD2 Aktivität mittels eines methylierungs-spezifischen Antikörpers etabliert. Mit Hilfe dieses Tests wurde BAY-598 als selektiver und potenter zellulärer Hemmer für SMYD2 identifiziert. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden mittels eines Proteomansatzes nach SMYD2 Überexpression hunderte neue zelluläre Lysinmethylierungen identifiziert. Hierbei wurde das AHNAK Protein als neues SMYD2-Substrat identifiziert und validiert. Die AHNAK Methylierung konnte in verschiedenen Zelllinien und im Muskelgewebe von Mäusen nachgewiesen werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde die spezifische Testsubstanz BAY-598 genutzt, um verschiedene in der Literatur aufgekommene Hypothesen zur SMYD2 Funktion zu testen. Die vorliegende Arbeit hat dazu beigetragen die potente und selektive SMYD2 Testsubstanz BAY-598 zu entwickeln. Außerdem wurde mit AHNAK ein neues SMYD2 Substrat identifiziert und validiert. Die Relevanz des SMYD2 Enzymes und der AHNAK Methylierung erfordert weitere Forschungsarbeit, die durch die Bereitstellung der spezifischen Testsubstanz BAY-598 deutlich verbessert werden sollte. / Protein methyltransferases are often misregulated in tumor cells and display a potential target for cancer therapy. The SET and MYND domain containing protein 2 (SMYD2) was described as a potential oncogene and overexpression correlated with a worse prognosis. Several substrates for SMYD2 had been described among them histone H3 and p53. However, the biology of SMYD2 is poorly understood. By developing a small molecule inhibitor of SMYD2 its therapeutic role could be better evaluated. Therefore, a cellular mechanistic assay was developed using a methylation specific antibody. With that assay BAY-598 was identified as a potent and selective cellular inhibitor of SMYD2. In the following a proteomic approach revealed hundreds of novel cellular lysine methylation sites in SMYD2 overexpression cells. Among these AHNAK protein was validated as a novel SMYD2 substrate, which was present in several cell lines as well as in muscle of mice. Finally, BAY-598 was used to test several hypothesized functions of SMYD2 in different cell line models. Taken together, the current work strongly supported the development of the probe inhibitor BAY-598 and the discovery of AHNAK as a novel SMYD2 methylation substrate. The relevance of SMYD2 and AHNAK methylation needs further investigation, which should be supported by BAY-598.

Reversible Phosphorylierung ist die bekannteste posttranslationale Modifikation (PTM) und die O-Phosphomonoester von Serin, Threonin und Tyrosin galten lange als die einzigen relevanten Vertreter. Vor kurzem wurden erste Erkenntnisse über die biologische Relevanz von labilen Phosphorylierungen veröffentlicht, z.B. die Phosphorylierung von Histidin, Arginin und Cystein sowie die Pyrophosphorylierung von Serin und Threonin. Auch die Aufklärung von Phospho-Lysin (pLys) wurde mit der Etablierung einer chemoselektiven Synthese zur Darstellung ortsselektiv phosphorylierter Lysinpeptide und der Entwicklung massenspektrometrischer Protokolle zur eindeutigen pLys-Identifizierung in Angriff genommen. Dennoch wurde bisher kein endogenes pLys beschrieben oder eingehende Untersuchungen mit interagierenden Enzymen durchgeführt. In dieser Arbeit werden mehrere Ansätze zur Erweiterung des Wissens über pLys vorgestellt. Dazu gehören das Design einer alternativen Syntheseroute zu pLys-Peptiden und die Entwicklung sowie Evaluierung von zwei stabilen Analoga als Bausteine für die Peptidsynthese. Weiterhin wurde die Protonierung des Phosphoramidatstickstoffs untersucht. In systematischen Enzymaktivitätsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) und verschiedenen Phospho-Substraten untersucht. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Selektivität für pLys, eine hohe Sequenzabhängigkeit der LHPP-Aktivität und ein klares Bindungsmotiv. Darüber hinaus wurden proteomische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für pLys-Peptide evaluiert. Im Laufe dieser Untersuchung wurden mehrere pLys-Immunogene für die Generierung von monoklonalen anti-pLys-Antikörpern und ein Workflow für die Histontrennung und -analyse entwickelt. Des Weiteren wurde die chelationsverstärkte Fluoreszenz von markierten Phospho-Peptiden als Werkzeug zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades in Enzymaktivitäts- oder Stabilitätsassays untersucht. / Reversible phosphorylation is the most prominent post-translational modification (PTM) and the O-phosphomonoesters of serine, threonine and tyrosine have been considered as the only notable forms for long time. Recent developments have paved the way to insights into the biological relevance of labile phosphorylations, e.g. phosphorylation of histidine, arginine and cysteine as well as pyrophosphorylation of serine and threonine. Also, the elucidation of phospho-lysine (pLys) was tackled with the establishment of a chemoselective synthesis to obtain site-selectively phosphorylated lysine peptides and the development of mass spectrometric protocols to unambiguously identify modification sites. Nonetheless, no endogenous pLys site has been described or in-depth investigations of interacting enzymes have been conducted. In this thesis, several approaches to enhance the knowledge about pLys are introduced. These include the design of an alternative synthesis route to pLys peptides and the development as well as evaluation of two stable analogues as building blocks for peptide synthesis. Furthermore, the protonation of the phosphoramidate-nitrogen was investigated. In systematic phosphoramidate hydrolase and phosphatase activity assays, the interactions between phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and various phospho-substrates were examined. Thereby, distinct selectivity for pLys, high sequence dependence of LHPP activity and a distinct binding motif were revealed. In addition to that, proteomic methods were evaluated regarding their suitability for pLys peptides. Over the course of this investigation, several pLys immunogens for the generation of monoclonal anti-pLys antibodies and a workflow for histone separation and analysis were developed. Furthermore, chelation-enhanced fluorescence of labeled phospho-peptides was studied as a tool for determining the degree of phosphorylation in enzyme activity or stability assays.

Proteinmethylierung spielt eine immer größere Rolle in der Regulierung zellulärer Prozesse. Die Entwicklung effizienter proteomweiter Methoden zur Detektion von Methylierung auf Proteinen ist limitiert und technisch schwierig. In dieser Arbeit haben wir einen neuen Hefe-Zwei-Hybrid-Ansatz (Y2H) entwickelt, der Proteine, die miteinander wechselwirken, mit Hilfe von Sequenzierungen der zweiten Generation identifiziert (Y2H-Seq). Der neue Y2H-Seq-Ansatz wurde systematisch mit dem Y2H-Seq-Ansatz verglichen. Dafür wurde ein Bait-Set von 8 Protein-Arginin-Methyltransferasen, 17 Protein-Lysin-Methyltransferasen und 10 Demethylasen gegen 14,268 Prey-Proteine getestet. Der Y2H-Seq-Ansatz ist weniger arbeitsintensiv, hat eine höhere Sensitivität als der Standard Y2H-Matrix-Ansatz und ist deshalb besonders geeignet, um schwache Interaktionen zwischen Substraten und Protein-Methyltransferasen zu detektieren. Insgesamt wurden 523 Wechselwirkungen zwischen 22 Bait-Proteinen und 324 Prey-Pr oteinen etabliert, darunter 11 bekannte Methyltransferasen-Substrate. Netzwerkanalysen zeigen, dass Methyltransferasen bevorzugt mit Transkriptionsregulatoren, DNA- und RNA-Bindeproteinen wechselwirken. Diese Daten repräsentieren das erste proteomweite Wechselwirkungsnetzwerk über Protein-Methyltransferasen und dienen als Ressource für neue potentielle Methylierungssubstrate. In einem in vitro Methylierungsassay wurden exemplarisch mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen die methylierten Aminosäurereste einiger Kandidatenproteine bestimmt. Von neun getesteten Proteinen waren sieben methyliert, zu denen gehören SPIN2B, DNAJA3, QKI, SAMD3, OFCC1, SYNCRIP und WDR42A. Wahrscheinlich sind viele Methylierungssubstrate im Netzwerk vorhanden. Das vorgestellte Protein-Protein-Wechselwirkungsnetzwerk zeigt, dass Proteinmethylierung sehr unterschiedliche zelluläre Prozesse beeinflusst und ermöglicht die Aufstellung neuer Hypothesen über die Regulierung Molekularer Mechanismen durch Methylierung. / Protein methylation on arginine and lysine residues is a largely unexplored posttranslational modification which regulates diverse cellular processes. The development of efficient proteome-wide approaches for detecting protein methylation is limited and technically challenging. We developed a novel workload reduced yeast-two hybrid (Y2H) approach to detect protein-protein interactions utilizing second generation sequencing. The novel Y2H-seq approach was systematically evaluated against our state of the art Y2H-matrix screening approach and used to screen 8 protein arginine methyltransferases, 17 protein lysine methyltransferases and 10 demethylases against a set of 14,268 proteins. Comparison of the two approaches revealed a higher sensitivity of the new Y2H-seq approach. The increased sampling rate of the Y2H-seq approach is advantageous when assaying transient interactions between substrates and methyltransferases. Overall 523 interactions between 22 bait proteins and 324 prey proteins were identified including 11 proteins known to be methylated. Network analysis revealed enrichment of transcription regulator activity, DNA- and RNA-binding function of proteins interacting with protein methyltransferases. The dataset represents the first proteome-wide interaction network of enzymes involved in methylation and provides a comprehensively annotated resource of potential new methylation substrates. An in vitro methylation assay coupled to mass spectrometry revealed amino acid methylation of candidate proteins. Seven of nine proteins tested were methylated including SPIN2B, DNAJA3, QKI, SAMD3, OFCC1, SYNCRIP and WDR42A indicating that the interaction network is likely to contain many putative methyltransferase substrate pairs. The presented protein-protein interaction network demonstrates that protein methylation is involved in diverse cellular processes and can inform hypothesis driven investigation into molecular mechanisms regulated through methylation.

In der Lebensmittelindustrie steht die Entwicklung neuer innovativer Produkte im Vordergrund. Insbesondere die Modifizierung von Proteinen durch den Einsatz des Enzyms mikrobielle Transglutaminase (mTG) bietet hier neue Ansatzpunkte. Das Enzym verknüpft die γ-Carboxamidgruppe proteingebundenen Glutamins mit der ε-Aminogruppe von Lysin unter Bildung sogenannter Isopeptidbindungen. Durch diese Reaktion erreicht man eine gezielte Veränderung funktioneller Eigenschaften der Proteine wie z.B. Gelbildung, Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgier- und Schäumungsverhalten. Im Rahmen der Arbeit wurden grundlegende Forschungen zur Aufklärung des Mechanismus der mTG-katalysierten Proteinquervernetzungsreaktion im Hinblick auf das Lebensmittel Milch durchgeführt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Ablauf der mTG-katalysierten Reaktion innerhalb der Caseinmicellen und dessen Effekt auf die Micellstruktur. Es zeigte sich, dass durch mTG die Caseine in der micellaren Struktur fixiert werden und der extramicellare Caseinanteil abnimmt. Hierbei wird β-Casein stärker vernetzt als αs-Casein. Infolge dieser intramicellaren Caseinquervernetzung wird die Stabilität der micellaren Struktur sowohl gegenüber destabilisierenden Reagenzien (EDTA, Ethanol, GDL), mechanischen Parametern (Hochdruck) sowie einer enzymatischen Proteolyse (Chymotrypsin, Pepsin) signifikant verbessert. Vermutlich werden die Isopeptide hierfür netzartig vorwiegend zwischen den β-Caseinen in der äußeren Micellschicht ausgebildet. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Identifizierung der Reaktionsorte, d.h. die an der enzymatischen Vernetzung beteiligten Gln- und Lys-Reste, im Vordergrund, um den Einfluss der Proteinstruktur auf die Spezifität der mTG zu erfassen. Bei der Bestimmung der Reaktionsorte für β-Casein konnten 5 der 21 Gln-Reste und 3 der 11 Lys-Reste als zugänglich für mTG eingestuft werden. Für β-Lactoglobulin konnten unter Normaldruck 3 der 15 Lys-Reste aber keine Gln-Reste durch das Enzym markiert werden. Unter Hochdruck bei 400 MPa wurden 4 der 9 Gln-Reste sowie zwei weitere Lys-Reste als mTG-reaktiv nachgewiesen. Die Lage dieser Reaktionsorte im Protein zeigte, dass Gln-Reste bevorzugt durch mTG modifiziert werden, welche in hydrophoben Proteinabschnitten lokalisiert sind und große hydrophobe Aminosäuren N-seitig sowie positiv geladene Aminosäuren C-seitig aufweisen. Die Lys-Reste werden nur durch mTG angegriffen, wenn diese neben Aminosäuren mit ungeladenen bzw. positiv geladenen Seitenketten lokalisiert sind, während die Nachbarschaft zu negativ geladenen Aminosäuren sowie zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren (hydrophilen) Seitenketten die Angreifbarkeit verhindert. Weiterhin zeigte eine Bestimmung der reaktiven Gln- und Lys-Reste im β-Casein innerhalb der Caseinmicelle, dass die Zugänglichkeit für mTG durch die Micellstruktur deutlich vermindert ist. Es wird vermutet, dass in der Caseinmicelle eine Art Vorstrukturierung der β-Caseine existiert. Abschließend wurden die Ergebnisse für einen Vorschlag eines Micellmodells herangezogen. Das im Rahmen der Arbeit vorgeschlagene Micellmodell beruht auf dem Internal Structure Modell, im speziellen auf dem „dual bonding model“ nach Horne, welches weiter charakterisiert werden konnte. So wird vermutet, dass β-Casein hauptsächlich im äußeren Micellbereich lokalisiert ist, während sich die αs-Caseine eher im Micellinneren befinden. β-Casein ist hierbei in laminaren Schichten angeordnet, wobei die hydrophilen Köpfe den größtmöglichen Abstand zueinander haben und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Schwänzen ausgebildet werden können. Wird die Micelle nun mit mTG behandelt, so kann ausgehend von diesem Modell die quervernetzte Caseinmicelle als „GiOTTO® -Modell“ dargestellt werden. Dieses ist aus einem „festen äußeren Mantel“ aus quervernetzten β-Caseinen (Isopeptidnetzwerk) und einem „weichen Kern“ aus nur gering vernetzten αs-Caseinen zusammengesetzt.

In der Lebensmittelindustrie steht die Entwicklung neuer innovativer Produkte im Vordergrund. Insbesondere die Modifizierung von Proteinen durch den Einsatz des Enzyms mikrobielle Transglutaminase (mTG) bietet hier neue Ansatzpunkte. Das Enzym verknüpft die γ-Carboxamidgruppe proteingebundenen Glutamins mit der ε-Aminogruppe von Lysin unter Bildung sogenannter Isopeptidbindungen. Durch diese Reaktion erreicht man eine gezielte Veränderung funktioneller Eigenschaften der Proteine wie z.B. Gelbildung, Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgier- und Schäumungsverhalten. Im Rahmen der Arbeit wurden grundlegende Forschungen zur Aufklärung des Mechanismus der mTG-katalysierten Proteinquervernetzungsreaktion im Hinblick auf das Lebensmittel Milch durchgeführt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Ablauf der mTG-katalysierten Reaktion innerhalb der Caseinmicellen und dessen Effekt auf die Micellstruktur. Es zeigte sich, dass durch mTG die Caseine in der micellaren Struktur fixiert werden und der extramicellare Caseinanteil abnimmt. Hierbei wird β-Casein stärker vernetzt als αs-Casein. Infolge dieser intramicellaren Caseinquervernetzung wird die Stabilität der micellaren Struktur sowohl gegenüber destabilisierenden Reagenzien (EDTA, Ethanol, GDL), mechanischen Parametern (Hochdruck) sowie einer enzymatischen Proteolyse (Chymotrypsin, Pepsin) signifikant verbessert. Vermutlich werden die Isopeptide hierfür netzartig vorwiegend zwischen den β-Caseinen in der äußeren Micellschicht ausgebildet. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Identifizierung der Reaktionsorte, d.h. die an der enzymatischen Vernetzung beteiligten Gln- und Lys-Reste, im Vordergrund, um den Einfluss der Proteinstruktur auf die Spezifität der mTG zu erfassen. Bei der Bestimmung der Reaktionsorte für β-Casein konnten 5 der 21 Gln-Reste und 3 der 11 Lys-Reste als zugänglich für mTG eingestuft werden. Für β-Lactoglobulin konnten unter Normaldruck 3 der 15 Lys-Reste aber keine Gln-Reste durch das Enzym markiert werden. Unter Hochdruck bei 400 MPa wurden 4 der 9 Gln-Reste sowie zwei weitere Lys-Reste als mTG-reaktiv nachgewiesen. Die Lage dieser Reaktionsorte im Protein zeigte, dass Gln-Reste bevorzugt durch mTG modifiziert werden, welche in hydrophoben Proteinabschnitten lokalisiert sind und große hydrophobe Aminosäuren N-seitig sowie positiv geladene Aminosäuren C-seitig aufweisen. Die Lys-Reste werden nur durch mTG angegriffen, wenn diese neben Aminosäuren mit ungeladenen bzw. positiv geladenen Seitenketten lokalisiert sind, während die Nachbarschaft zu negativ geladenen Aminosäuren sowie zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren (hydrophilen) Seitenketten die Angreifbarkeit verhindert. Weiterhin zeigte eine Bestimmung der reaktiven Gln- und Lys-Reste im β-Casein innerhalb der Caseinmicelle, dass die Zugänglichkeit für mTG durch die Micellstruktur deutlich vermindert ist. Es wird vermutet, dass in der Caseinmicelle eine Art Vorstrukturierung der β-Caseine existiert. Abschließend wurden die Ergebnisse für einen Vorschlag eines Micellmodells herangezogen. Das im Rahmen der Arbeit vorgeschlagene Micellmodell beruht auf dem Internal Structure Modell, im speziellen auf dem „dual bonding model“ nach Horne, welches weiter charakterisiert werden konnte. So wird vermutet, dass β-Casein hauptsächlich im äußeren Micellbereich lokalisiert ist, während sich die αs-Caseine eher im Micellinneren befinden. β-Casein ist hierbei in laminaren Schichten angeordnet, wobei die hydrophilen Köpfe den größtmöglichen Abstand zueinander haben und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Schwänzen ausgebildet werden können. Wird die Micelle nun mit mTG behandelt, so kann ausgehend von diesem Modell die quervernetzte Caseinmicelle als „GiOTTO® -Modell“ dargestellt werden. Dieses ist aus einem „festen äußeren Mantel“ aus quervernetzten β-Caseinen (Isopeptidnetzwerk) und einem „weichen Kern“ aus nur gering vernetzten αs-Caseinen zusammengesetzt.