La délimitation précise du contour des lésions pigmentées sur des images est une première étape importante pour le diagnostic assisté par ordinateur du mélanome. Cette thèse présente une nouvelle approche de la détection automatique du contour des lésions pigmentaires sur des images couleurs ou multispectrales de la peau. Nous présentons d'abord la notion de minimisation d'énergie par coupes de graphes en terme de Maxima A-Posteriori d'un champ de Markov. Après un rapide état de l'art, nous étudions l'influence des paramètres de l'algorithme sur les contours d'images couleurs. Dans ce cadre, nous proposons une fonction d'énergie basée sur des classifieurs performants (Machines à support de vecteurs et Forêts aléatoires) et sur un vecteur de caractéristiques calculé sur un voisinage local. Pour la segmentation de mélanomes, nous estimons une carte de concentration des chromophores de la peau, indices discriminants du mélanomes, à partir d'images couleurs ou multispectrales, et intégrons ces caractéristiques au vecteur. Enfin, nous détaillons le schéma global de la segmentation automatique de mélanomes, comportant une étape de sélection automatique des "graines" utiles à la coupure de graphes ainsi que la sélection des caractéristiques discriminantes. Cet outil est comparé favorablement aux méthodes classiques à base de coupure de graphes en terme de précision et de robustesse. / Accurate border delineation of pigmented skin lesion (PSL) images is a vital first step in computer-aided diagnosis (CAD) of melanoma. This thesis presents a novel approach of automatic PSL border detection on color and multispectral skin images. We first introduce the concept of energy minimization by graph cuts in terms of maximum a posteriori estimation of a Markov random field (MAP-MRF framework). After a brief state of the art in interactive graph-cut based segmentation methods, we study the influence of parameters of the segmentation algorithm on color images. Under this framework, we propose an energy function based on efficient classifiers (support vector machines and random forests) and a feature vector calculated on a local neighborhood. For the segmentation of melanoma, we estimate the concentration maps of skin chromophores, discriminating indices of melanomas from color and multispectral images, and integrate these features in a vector. Finally, we detail an global framework of automatic segmentation of melanoma, which comprises two main stages: automatic selection of "seeds" useful for graph cuts and the selection of discriminating features. This tool is compared favorably to classic graph-cut based segmentation methods in terms of accuracy and robustness.

En recherche et développement pharmaceutiques un candidat thérapeutique doit passer plusieurs barrières précliniques afin de déterminer certains paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques avant toute administration à l’homme. Malgré les efforts investis en R&D ces dernières années, l’industrie du médicament a souffert d’un ralentissement dans le développement de nouvelles molécules innovantes. Car avant sa mise sur le marché, tout candidat doit justifier de la sécurité liée à son utilisation mais aussi de sa balance bénéfice/ risque. Les modèles standards utilisés en développement en oncologie ne sont pas assez prédictifs et bien souvent non-adaptés, avec une niche tumorale inexistante. C’est pourquoi il est aujourd’hui essentiel de travailler sur des systèmes plus sensibles et mimant plus fidèlement la pathologie humaine afin d’obtenir des médicaments plus efficaces et moins toxiques pour une meilleure prise en charge. L’utilisation du modèle spontané de cancers comme approche prédictive en oncologie comparée a été rapportée par plusieurs équipes à travers le monde. En effet, les fortes similitudes au niveau histologique, moléculaire et clinique rapportées entre les tumeurs humaines et canines, font de ce modèle un allié essentiel pour l’optimisation du développement pharmaceutique chez l’homme ayant un bénéfice réciproque à la fois à la médecine humaine et vétérinaire.Chez l’homme, les mélanomes constituent l’une des formes les plus agressives des cancers cutanés. Ils représentent 4 à 11% des néoplasies cutanées et seulement 2% des cancers de l’épiderme. Ce sont des tumeurs très immunogènes et de très mauvais pronostic au stade métastatique contribuant au développement d’une réponse immunitaire anti-tumorale bien souvent responsable d’échappements et de résistances au traitement. Et malgré l’amélioration de 50 à 80% de la survie globale à 5 ans ces vingt dernières années, son incidence ne cesse d’augmenter et environ 7000 cas sont rapportés chaque année en France avec plus de 75% de décès liés à ces tumeurs.Bien que rares, ces tumeurs représentent 7% des cancers diagnostiqués chez le chien et environ 160000 cas sont recensés chaque année au niveau mondial. Sa localisation est buccale dans plus de 50% des cas. C’est aussi l’un des cancers les plus agressifs chez le chien, avec une survie globale post-opératoire de 173 jours associé à des métastases ganglionnaires et pulmonaires le plus souvent.Le but de ce travail a été la validation préclinique et clinique du modèle tumoral spontané canin dans la compréhension des mécanismes de cancérogenèse, de dormance tumorale et de développement thérapeutique. Validation préclinique, dans un premier temps via le développement et la caractérisation de modèles cellulaires et murins de mélanomes canins. Puis, dans un second temps, la validation clinique par le biais d’essais thérapeutiques chez le patient chien.A partir de prélèvements issus de deux profils cliniques distincts, deux lignées cellulaires de mélanome canin ont été développées et caractérisées sur le plan pharmacologique, génomique et fonctionnel. Une liste d’altérations génétiques a été établie sur ces deux profils en accord avec la littérature et présentant des points communs avec la pathologie humaine. De plus, il est bien établi que l’hétérogénéité tumorale est responsable de résistances au traitements conduisant aux rechutes, c’est pourquoi nous nous sommes par la suite intéressés à l’étude des populations souches tumorales au sein de notre modèle et à l’identification de marqueur permettant le ciblage de ces cellules pouvant contribuer ainsi à l’avancement de l’enrichissement de l’arsenal thérapeutique oncologique.En conclusion, le patient chien est doté d’un système immunitaire intact et d’une niche tumorale complète, constituant ainsi un système in-vivo très intéressant pour l’homme, pouvant contribuer à avancer la recherche et améliorer grandement nos connaissances sur cette pathologie. / Pharmaceutical development is a long and fastidious process. In fact, each drug candidate has to meet with a certain safety criteria list, pharmacokinetic and pharmacodynamics profiles need to be determined prior to first use in humans and market approval.For years, the pharmaceutical industry has been suffering from a lack of innovative molecules and thus despite the efforts and cost increases in R&D programs. And most novel drug candidates entering clinical trials fail to reach approval, largely because preclinical models used in development do not provide adequate information about their efficacy or toxicity. That’s why; more predictive models of efficiency in oncology, shaping more precisely the human pathology are needed.The study of novel drug candidates in dogs with naturally occurring tumors allows drug assessment in neoplasms sharing many fundamental features with its human counterparts, and thus provides an opportunity to answer questions guiding the cancer drug development path in ways not possible in more conventional models. Moreover, the strong homologies in clinical presentation, morphology, and overall biology between dogs and their human counterparts make companion animals a good model to investigate tumor process from ætiology to tailored treatments.The aim of this project was to validate the canine spontaneous tumor model, by combining preclinical and clinical approaches, in the comprehension of the underlying mechanisms of cancer from carcinogenesis to drug resistance and tumor dormancy and also the discovery of new tools essential for the prediction, diagnosis clinical follow-up and treatment.Metastatic melanoma is one of the most aggressive forms of cutaneous tumors in humans. It constitutes 4 to 11% of skin malignancies and only 2% of the cancers of the epidermis. These highly immunogenic tumors hold a severe prognosis when metastasized and contribute to an immune anti-tumor reaction which could potentially lead to immune escape and resistance to most standard treatment protocols. And even if the 5-year survival has been improved to 50 – 80% over the past decades, its incidence is still in the rise with 7000 cases and 75% related deaths reported every year in France.In dogs, melanomas are one of the most frequently diagnosed malignancies of the oral cavity. These cancers account for 7% of all malignant tumors in dogs and 160000 reported every year worldwide. It also constitutes one of the most aggressive metastasizing tumors with a median post-surgery survival rate of 173 days.We developed and characterized immunucytochemically, pharmacologically and genomically two canine melanoma cell lines from naturally occurring dog tumors with distinct clinical profiles. A list of genetic alterations of these two profiles has also been established and is in accordance with the published literature, presenting same features as human tumors. And because tumor heterogeneity is responsible of resistance to treatment and relapse, we isolated and investigated cancer stem cell populations in our cell line models in order to identify the linked biomarkers which may constitute future potential targets for the expansion of the oncological therapeutic panel.In conclusion, due to its intact immune system, tumor niche and also because it shares the same environment as we do, the canine patient represent a promising opportunity in the advancement of cancer research, the acceleration of translation process and the setting up of more effective and less toxic molecules with dual benefits for the human and veterinary medicine toward better patient care.

Le resvératrol, stilbène produit naturellement dans les grappes de raisin, possède un pouvoir anti-tumoral caractérisé par ses effets pléïotropiques. La molécule s’est ainsi montrée capable d’inhiber la cancérogenèse en agissant à de multiples niveaux. Son incidence sur la croissance tumorale in vitro est généralement associée à une perturbation dans le cycle cellulaire et à une induction d’apoptose. De nombreuses molécules dérivées du resvératrol se sont montrées également efficaces pour moduler la croissance tumorale. Nous avons entrepris au cours de ces travaux de thèse d’étudier les activités biologiques de stilbènes issus d’une production de culture cellulaire de vigne. Les résultats de cette étude mettent en évidence une réduction de la croissance tumorale, dans un modèle d’étude in vitro de mélanome humain, pour le resvératrol et quatre oligomères de resvératrol bioproduits. L’étude plus approfondie de trois oligomères de resvératrol a permis de révéler des différences notables par rapport entre les effets du resvératrol et ses dérivés. En effet, bien que l’inhibition de la viabilité cellulaire des lignées cancéreuses s’accompagne d’une perturbation du cycle cellulaire pour le resvératrol et ses dérivés, elle se traduit différemment selon les composés. L’action du resvératrol sur le cycle cellulaire conduit à une nette augmentation des cellules en phase S, tandis que les oligomères de resvératrol n’induisent pas d’accumulation cellulaire franche dans une phase du cycle. De plus les oligomères de resvératrol présentent des capacités anti-invasives et anti-migratoires qui ne sont pas retrouvées chez le resvératrol. Enfin l’étude sur des fibroblastes normaux d’adultes (FNA) souligne que les dérivés du resvératrol diminuent la viabilité de cellules normales et cancéreuses à des concentrations similaires contrairement au resvératrol dont l’action est nettement inférieure sur les cellules saines. Cependant le pouvoir cytotoxique du resvératrol et de ses dérivés reste beaucoup plus faible chez les cellules normales. / Resveratrol, a natural stilbene found in the grapevine, exhibits pleiotropic antitumor activities. This molecule has been shown to inhibit the cancerogenesis processes at different levels. Its impact in tumor growth, in vitro, is generally associate with a disruption in cell cycle and an apoptosis induction. Various resveratrol derivatives appear also efficient to modulate tumor growth. We have studied, during this work, biological activities of stilbenes produced by grapevine cell cutures. Our results show a decrease in melanoma human growth, in vitro, for bioproduced resveratrol oligomers as well as resveratrol itself. Our experiments underline distinct effects between resveratrol and its derivatives. Indeed, all compounds disrupt cell cycle, but resveratrol induces S-phase arrest while resveratrol oligomers failed to induce a clearly phase arrest. Moreover, only resveratrol oligomers only have the ability to counteract invasive and migratory properties of melanoma cells. Finally, experiments performed in normal human fibroblasts study show that resveratrol oligomers present a similar potential to reduce viability of cancer as well as normal cells contrary to resveratrol which is less efficient in normal cells. However the cytotoxicity of resveratrol and its derivatives is significantly reduced on normal cells.

Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

MITF (MIcrophthalmia-associated Transcription Factor) contrôle de multiples aspects de la physiopathologie du lignage mélanocytaire. Par des techniques de génomique haut débit (ChIP-seq, RNA-seq), nous avons montré que MITF active un ensemble de gènes impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN ainsi que la mitose pour stimuler la prolifération des cellules de mélanome, et réprime des gènes contrôlant leur caractère invasif. Pour étudier le mécanisme d’action de MITF, son interactome a été déterminé par spectrométrie de masse mettant en évidence de nombreux partenaires à activité co-activateur ou co-répresseur (bcaténine, complexes de remodelage de la chromatine BRG1 et NURF) ainsi que des facteurs intervenant dans le cycle de l’ubiquitination et de déubuquitination (HERC2 et USP11). Une caractérisation fonctionnelle de HERC2 et USP11 suggère qu’ils agissent comme des cofacteurs transcriptionnels de MITF essentiels pour la prolifération des cellules de mélanome. / MITF (MIcrophthalmia-associated Transcription Factor) controls multiple aspects of the physiopathology of the melanocyte lineage. Using high throughput genomics techniques (ChIP-seq, RNA-seq), we show that MITF activates a set of genes involved in DNA replication and repair as well as mitosis to promote melanoma cell proliferation, while repressing genes involved in promoting their invasion. To better understand how MITF acts both as a transcriptional activator and repressor, we characterized the MITF interactome by tandem immuno-affinity purification and mass-spectrometry. A complex set of partners with coactivatoror co-repressor properties were identified (b-catenin, the BRG1 and NURF chromatin remodeling complexes) as well as novel factors with ubiquitin E3 ligase (HERC2) and ubiquitin-specific protease (USP11) activities. Functional characterization of HERC2 and USP11 suggests that they act as transcriptional cofactors for MITF essential for melanoma cell proliferation.

Β-caténine, protéine multifonctionnelle et pivot de la voie de signalisation Wnt est impliquée dans de nombreux processus physiologiques, notamment le développement normal du lignage mélanocytaire. Les régulateurs négatifs directs de β-caténine sont peu nombreux et un nombre réduit d’études leur a été consacré. La protéine ICAT est l’un de ces régulateurs négatifs. En effet, elle se fixe au niveau des répétitions ARM 5 à 12 de β-caténine via un domaine N-terminal en hélices α et un domaine C-terminal semblable à un feuillet β, empêchant son interaction avec les facteurs de transcription TCF/LEF et donc la transcription des différents gènes cibles de β-caténine. L’invalidation complète de ICAT chez la souris entraîne des anomalies développementales des dérivés des crêtes neurales responsables, dans certains cas, de la mort des animaux. Afin de déterminer la fonction de ICAT durant le développement des mélanocytes, qui sont également des dérivés des crêtes neurales, nous avons généré des embryons totalement invalidés pour le gène ICAT et exprimant le transgène Dct::LacZ. Cette invalidation n’affecte ni le nombre, ni la localisation des mélanoblastes. Ces résultats suggèrent que la prolifération et la migration de ces cellules aux stades étudiés (E13.5, E15.5 et E18.5) est normale en absence de ICAT. La voie de signalisation Wnt étant dérégulée dans 30% des mélanomes, il nous a paru essentiel d’examiner le rôle de ICAT dans la formation et la progression des mélanomes. L’étude d’un panel de lignées cellulaires de mélanome humain nous a permis de corréler une forte expression de ICAT à la formation de métastases chez des souris immunodéficientes. De plus chez l’Homme, une forte expression d’ARNm de ICAT dans certains mélanomes est associée à un temps de survie plus faible. La surexpression de ICAT dans différentes lignées humaines de mélanome conduit à une augmentation de la vitesse de migration des cellules en 2D et de leurs capacités invasives en 3D, sans affecter leur prolifération. L’ensemble de ces effets dépend entièrement de l’interaction de ICAT avec β-caténine. Au niveau cellulaire, une expression ectopique de ICAT induit une modification de la morphologie des cellules métastatiques, qui passent d’une forme allongée/mésenchymateuse à une forme arrondie/amiboïde, alors qu’elle n’affecte pas la morphologie allongée des cellules non métastatiques. Cette modification de morphologie cellulaire s’accompagne d’une diminution de l’expression de la protéine NEDD9, une cible de β-caténine, impliquée dans la voie de signalisation Rac communément associée à la migration mésenchymateuse. L’ensemble de ces résultats nous a permis de montrer pour la première fois que ICAT est un nouveau régulateur de la motilité et de l’invasion des cellules de mélanome. L’étude de la structure tridimensionnelle du complexe ICAT/β-caténine nous a permis de comprendre le mécanisme de compétition entre ICAT et les facteurs TCF/LEF pour la liaison à β-caténine. Par mutagenèse, nous avons mis en évidence que les résidus D66, F71 et E75 (domaine C-terminal de ICAT) sont impliqués dans la compétition avec LEF1 mais n’empêchent pas la formation d’un complexe stable ICAT/β-caténine alors que les résidus Y15, K19, V22 du domaine N-terminal sont essentiels à la formation de ce complexe. / Β-catenin is the central protein of the Wnt signaling pathway, which is involved in many physiological processes including normal melanocyte development. Few direct negative regulators of β-catenin have been described so far and their physiological role is still unclear. One of them, ICAT (inhibitor of β-catenin and TCF-4) has been identified in a yeast two-hybrid screen by using the Armadillo (ARM) region of β-catenin as bait. This small protein of 81 amino-acids, encoded by the highly conserved CTNNBIP1 gene, binds to β-catenin through ARM repeats 5 to 12, preventing its interaction with TCF4 and thus, repressing TCF/LEF-β-catenin transcriptional activity in vitro. Total invalidation of ICAT in mouse leads to premature death and cranio-facial anomalies, suggesting an important role in neural-crest cell differentiation. In order to determine the possible role of ICAT in melanoblasts development, ICAT -/- embryos, on a Dct::LacZ background were obtained. We observed that the total invalidation of the ICAT gene does not affect the number of melanoblasts and their localization at embryonic stages E13.5, E15.5 and E18.5, indicating that ICAT alone does not play a significant role in the proliferation and migration of melanoblasts during mouse development. The Wnt signaling pathway is deregulated in 30% of melanomas, so we found it essential to study the role of ICAT in the formation and progression of melanoma. We observed that high ICAT levels in a panel of human melanoma cell lines correlated with their capacity to form metastases in nude mice and was associated, in some melanoma patients, with reduced distant metastasis-free survival. Ectopic expression of ICAT in various melanoma cell lines had no effect on their proliferation but increased their in vitro motility in 2D and matrigel invasion in 3D. These in vitro effects required stable protein interaction between ICAT and β-catenin. At the cellular level, ICAT promoted switching of metastatic melanoma cells from an elongated/mesenchymal towards a round/amoeboid phenotype but did not affect the elongated morphology of non-metastatic melanoma cells. Transition from a mesenchymal to an amoeboid movement was associated with decreased production of the scaffold protein NEDD9 and decreased levels of Rac1-GTP, a positive regulator of mesenchymal movement. In vivo, ectopic ICAT expression increased lung colonization by melanoma cells in nude mice. Our results indicate that ICAT-induced down-regulation of Rac signaling can increase motility and invasiveness of metastatic cells by promoting morphological variability allowing tumor cells to adapt to their microenvironment. We show, for the first time, that ICAT is a new potential modulator of melanoma cells invasion. Based on a three-dimensional study of ICAT in complex with β-catenin we understood how ICAT competes with members of the TCF/LEF family at the nuclear level. By site directed mutagenesis, we demonstrated that D66, F71 and E75 residues (C-terminal domain of ICAT) are involved in the competition with LEF1 but are not essential in the formation of a stable ICAT/β-catenin complex, while Y15, K19, V22 residues (N-terminal domain) are essential for the formation of this complex.

Les imidazoquinoxalines (imiqualines), molécules bioactives originales analogues chimiques de l’imiquimod et présentant un important potentiel anticancéreux, ont été explorées afin d’élucider leurs mécanismes d'action. Les molécules EAPB0203 et EAPB0503, identifiées lors d’études antérieures comme étant les « têtes de séries », ont montré un effet cytotoxique puissant in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines de mélanome et de lymphomes T. Nous avons étudié l’effet cytotoxique de 13 imiqualines nouvellement synthétisées sur une lignée cellulaire de mélanome humain (A375). Tous les composés ont montré un effet cytotoxique important. L’effet cytotoxique a été démontré sur d’autres lignées cellulaires cancéreuses humaines (côlon, sein et lymphome T de l’adulte).Un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M a été mis en évidence par cytométrie en flux sur des cellules A375 traitées par EAPB0203 et EAPB0503. Cet arrêt du cycle cellulaire semble être en relation avec un effet inhibiteur de la polymérisation de la tubuline. En effet, nos résultats ont montré que l’EAPB0503 et 3 autres imiqualines inhibent la polymérisation de la tubuline. L’étude de modélisation moléculaire de la liaison à de la tubuline a montré que ces composés se fixent sur le site de la colchicine.Une analyse transcriptomique sur EAPB0503 a été effectuée pour élucider le mécanisme d'action des imiqualines. Cette étude a été faite sur la lignée A375 en comparaison avec 13 anticancéreux de référence. L’étude transcriptomique a montré que EAPB0503 a une composante antitubuline tout en révélant un mécanisme d’action original. Deux hypothèses mécanistiques pour EAPB0503 ont ainsi été identifiées : 1/ altération de la voie de signalisation liée aux intégrines, 2/ altération de la voie de signalisation du récepteur TNFR et de FasL.Des analyses fonctionnelles in vitro nous ont permis d’explorer ces hypothèses. Ainsi, une altération uniquement des voies de signalisation PI3K/AKT et RAS/MAPK, toutes deux liées aux intégrines, a été observée. La première hypothèse semble donc validée. De plus, ce résultat a été confirmé par l’étude de l’expression et de la phosphorylation de ERK.Finalement, nous avons développé une formulation injectable par voie intraveineuse de EAPB0503 à base de nanocapsules. Cette formulation a d’abord été testée in vitro et in vivo sur un modèle de lymphome. Ces études ont pu mettre en évidence l’absence de toxicité des nanoparticules vides et le maintien de l’activité cytotoxique de EAPB0503 encapsulé in vitro, avec un effet immunomodulateur in vivo qui demande à être exploré. / The imidazoquinoxalines (imiqualines), original bioactive molecules and chemical analogues of imiquimod and with significant anti-cancer potential, were explored in order to elucidate their mechanisms of action. The molecules EAPB0203 and EAPB0503 identified in previous studies as leader, showed potent in vitro cytotoxic effect on human cancer cell lines of melanoma and T lymphoma. We studied the cytotoxic effect 13 newly synthesized imiqualines on a cell line of human melanoma (A375). All compounds showed a significant cytotoxic effect. The cytotoxic effect was shown on other human cancer cell lines (colon, breast and adult T lymphoma).A cell cycle block in G2 / M phase was demonstrated by flow cytometry on A375 cells treated with EAPB0203 and EAPB0503. This cell cycle arrest seems to be related with an inhibitory effect on the polymerization of tubulin. Indeed, our results showed that EAPB0503 and three other imiqualines inhibit tubulin polymerization. The molecular modeling study of binding to tubulin showed that these compounds bind at the colchicine site.A transcriptomic analysis on EAPB0503 was performed to elucidate the mechanism of action of imiqualines. This study was made on the A375 line compared with 13 approuved anticancer molecules. This transcriptomic study showed that EAPB0503 has an antitubulin effect while revealing a novel mechanism of action. Two mechanistic hypotheses for EAPB0503 were identified: 1/ alteration of the signaling pathway linked to integrin, 2/ alteration of the signaling pathway TNFR receptor and FasL.In vitro functional analyses have allowed us to explore these hypotheses. Thus, alteration only PI3K / AKT and RAS / MAPK signaling pathways, both related to integrins, was observed. The first hypothesis seems confirmed. Moreover, this result was confirmed by the study of the expression and phosphorylation of ERK.Finally, we developed an intravenously injectable formulation of EAPB0503 based on nanocapsules. This formulation was first tested in vitro and in vivo on lymphoma model. These studies could highlight the lack of toxicity of empty nanoparticles and retention of the cytotoxic activity of encapsulated EAPB0503 in vitro, with an in vivo immunomodulatory effect which needs to be explored.

Le mélanome malin (MM) métastatique, un des cancers les plus intrinsèquement résistants aux agents anti-cancéreux et présentant une forte capacité à développer des résistances acquises, constitue un défi thérapeutique. La meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette chimiorésistance permettrait d'identifier des cibles thérapeutiques ou de guider le choix du traitement pour une meilleure efficacité. Les travaux réalisés durant cette thèse se sont focalisés sur l'identification de nouveaux déterminants moléculaires de la résistance acquise du MM vis-à-vis (i) des vinca-alcaloïdes (VAs, chimiothérapie classique), (ii) des inhibiteurs de MAP kinases (iMAPK, thérapie ciblée). Pour la première étude, un modèle de lignées cellulaires de MM résistantes aux VAs (CAL1R-VAs) a été établi (exposition continue, 12 mois, de la lignée parentale CAL1-wt à la VCR, la VDS ou la VRB : CAL1R-VCR, CAL1R-VDS et CAL1R-VRB respectivement). La comparaison des profils d'expression a permis de distinguer deux groupes de lignées cellulaires (CAL1R-VCR et CAL1R-VDS ; CAL1R-VRB et CAL1-wt), suggérant une résistance différentielle du MM aux VAs : d'une part à la VCR et à la VDS, d'autre part à la VRB. L'analyse des données transcriptomiques par une démarche associant successivement trois méthodes - RMA (Robust Multi-array Average), RDAM (Rank Difference Analysis of Microarrays) et MGSA (model-based gene set analysis) – a permis d'identifier des fonctions cellulaires altérées lors de la sélection des lignées CAL1R-VAs, et donc potentiellement à l'origine de la résistance de ces lignées. Des analyses fonctionnelles in vitro ont permis de confirmer l'implication des lysosomes et de la réponse au stress du réticulum endoplasmique (RE) dans la résistance différentielle des cellules CAL1 aux VAs. Ainsi, une sous-expression des cathepsines B et L (bioinformatique) et une réduction du volume du compartiment acide (in vitro) ont été observées spécifiquement dans le premier groupe de lignées (CAL1R-VCR et CAL1R-VDS), suggérant une sensibilité réduite de ces lignées à la voie lysosomale de l'apoptose. Par ailleurs, l'inhibition de la voie de réponse au stress du RE par l'acide tauroursodésoxycholique (TUDCA) a induit une sensibilisation différentielle de l'ensemble des lignées CAL1 aux VAs, suggérant l'implication de cette voie dans la résistance différentielle primaire et acquise aux VAs. De plus, l'inhibition de la réponse au stress du RE a induit une sensibilisation d'une autre lignée cellulaire de MM, MDA-MB-435, à la VCR et à la VDS mais pas à la VRB. Ainsi, la voie de réponse au stress du RE semble impliquée dans la résistance différentielle du MM aux VAs. Ce mécanisme pourrait mettre en jeu l'autophagie, dont le flux était significativement augmenté dans le premier groupe de lignées. La même démarche d'analyse transcriptomique a été appliquée pour l'étude des mécanismes moléculaires de résistance acquise du MM aux iMAPK. Des lignées cellulaires de MM résistantes aux trois iMAPK majeurs ont été établies par exposition continue de la lignée parentale A375-wt, portant la mutation activatrice BRAF V600E, au vémurafenib (VMF, inhibiteur de BRAF), dabrafenib (DBF, inhibiteur de BRAF), et trametinib (TMT, inhibiteur de MEK): A375R-VMF, A375R-DBF et A375R-TMT respectivement. La comparaison des profils transcriptomiques n'a pas permis de regrouper les lignées résistantes entre elles, suggérant que les mécanismes de résistance au VMF, au DBF ou au TMT sont différents. Ces mécanismes ne seraient donc communs ni à la voie ciblée (MAPK), ni à la cible moléculaire (BRAF ou MEK). L'identification des fonctions cellulaires altérées procurera un rationnel pour l'étude mécanistique de nouveaux déterminants de la résistance du MM aux iMAPK. / Malignant melanoma (MM), one of the most intrinsically resistant cancers to anticancer agents and presenting a strong ability to develop acquired resistance, remains a therapeutic challenge. A better understanding of the mechanisms involved in MM chemoresistance should provide therapeutic targets or guide therapeutic choice for improved efficiency. This thesis has focused on the identification of new molecular determinants of MM acquired resistance to (i) vinca alkaloids (VAs, conventional chemotherapy), and to (ii) MAP kinases inhibitors (MAPKi, targeted therapy). In the first study, MM cell lines resistant to VAs (CAL1R-VAs) were established (continuous exposure, 12 months, of CAL.1-wt parental line to the VCR, VDS or VRB: CAL1R-VCR, CAL1R- VDS and CAL1R-VRB respectively). Comparison of expression patterns led to distinguish two groups of cell lines (CAL1R-VCR and CAL1R-VDS; CAL1R-VRB and CAL.1-wt), suggesting a differential resistance of MM to VAs: one the one hand to VCR and VDS, on the other hand to VRB only. The analysis of transcriptome data by a process involving successively three methods - RMA (Robust Multi-array Average), RDAM (Rank Difference Analysis of Microarrays) and MGSA (model-based gene set analysis) – allowed the identification of functions altered during the resistant cell line selection, and therefore potentially involved in resistance mechanisms of these cell lines. In vitro functional analyzes confirmed the involvement of the lysosomes and of the response to endoplasmic reticulum (ER) stress (unfolded protein response, UPR) in the differential resistance of CAL1 cells to VAs. Thus, an under-expression of cathepsins B and L (bioinformatics), and a reduction of the acidic compartment volume (in vitro) were specifically observed in the first cell group (CAL1R-VCR and CAL1R-VDS), suggesting a reduced sensitivity of these lines to the lysosomal pathway of apoptosis. Furthermore, UPR inhibition using tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) induced a differential sensitization of all the CAL1 lines to VAs, suggesting the involvement of this pathway in the primary and acquired differential resistance to VAs. Moreover, TUDCA-inhibition of UPR induced sensitization another MM cell line, MDA-MB-435, to VCR and VDS but not to VRB. Thus, a UPR up-regulation could to be a significant mechanism of differential resistance of MM to VAs. This mechanism could involve autophagy, whose flow was significantly increased in the first group of lines. The same transcriptome analysis strategy was applied to study (ii) the molecular mechanisms of MM acquired resistance to MAPKi. MM cell lines resistant to the three major MAPKi were established by continuous exposure of the parental A375-wt line, carrying the activating mutation BRAF V600E, to vemurafenib (VMF, BRAF inhibitor), dabrafenib (DBF, BRAF inhibitor), or trametinib (TMT, MEK inhibitor): A375R-VMF, A375R-DBF and A375R-TMT, respectively. Comparison of transcriptomic profiles showed separate expression profiles, suggesting that the molecular mechanisms responsible for resistance to VMF, DBF or TMT were different. These mechanisms cannot therefore be common to the targeted pathway (MAPK) or to the molecular target (BRAF or MEK). The identification of the altered cellular functions will provide a rationale for mechanistic studies of new determinants of MM resistance to MAPKi.

Les microparticules (MPs) sont des vésicules dérivées de la membrane plasmique lors de la vésiculation par les cellules stimulées. Les MPs interviennent dans l'inflammation, les communications intercellulaires et la coagulation. Tout d'abord, nous avons standardisé une méthode pour caractériser et quantifier des MPs par cytométrie en flux dans le plasma.L'implication des MPE est suggérée dans le psoriasis notamment par le rôle central du TNF-a qui est un puissant inducteur de vésiculation. Nous avons comparé les valeurs de MPs chez des patients psoriasiques à celles de donneurs sains. Les MPE étaient plus élevées chez les patients notamment les MPs de petite taille. Les MPs diminuaient sous traitements anti-TNF-a.Les MPs agissent sur la progression tumorale des cancers. Les MPs tumorales ou des cellules de l'hôte peuvent modifier les propriétés invasives de la tumeur par des propriétés transférées. Les MPs peuvent aussi interagir avec les cellules du système immunitaire. Dans le mélanome, le risque de thrombose est accru. Or, la libération de MPs conduit à un état d'hypercoagulabilité. Les MPP et les MPE étaient augmentés dans chaque stade de la maladie par rapport à une population témoin. De plus, les MPs des patients atteints de mélanome possédaient des propriétés procoagulantes. L'étude des MPs en Dermatologie permet d'appréhender de nouveaux angles de la physiopathologie des maladies inflammatoires ou en carcinogenèse. Le dosage des MPs pourrait devenir un outil intéressant de monitoring des biothérapies dans le psoriasis. Dans le mélanome, des études complémentaires permettront de déterminer si les taux de MPs constituent un facteur pronostique intéressant / Microparticles (MPs) are vesicles derived from the plasma membrane during vesiculation by the stimulated cells. MPsare involved in inflammation, intercellular communications and coagulation. First, we standardised a method tocharacterise and quantify MPs in plasma by flow cytometry.The implication of endothelial microparticles (EMPs) is suggested in psoriasis, in particular by the central role of TNF-a which is a powerful inducer of vesiculation. We compared the values of MPs in psoriatic patients to the values inhealthy donors. EMPs were higher in the patients, especially MPs of small size. MPs were reduced under anti-TNF-atreatments.MPs have an action on the tumoral development of cancers. Tumoral MPs or the host's cells can modify the invasiveproperties of the tumour through transferred properties. MPs can also interact with the cells of the immune System. Inmelanoma, the risk of thrombosis is increased, but the release of MPs leads to a state of hypercoagulability. Plateletsmicroparticles (PMPs) and EMPs were increased at each stage of the disease compared to a control population. Inaddition, MPs of patients with melanoma had procoagulant properties.The study of MPs in Dermatology allows to apprehend new approaches of the physiopathology of inflammatorydiseases or in carcinogenesis. The dosage of MPs could become an interesting tool in the monitoring of biotherapies inpsoriasis. In melanoma, additional studies will show if MPs rates are an interesting prognostic factor.

Le mélanome métastatique reste à l’heure actuelle une pathologie dramatique avec une survie moyenne de 13 mois après diagnostic, démontrant l’échec des chimiothérapies. Ces travaux de thèse ont pour but de développer une stratégie alternative utilisant les siRNA (petits ARN interférents) encapsulés au sein de nanocapsules lipidiques (LNC) pour une injection intraveineuse. Les premiers travaux ont porté sur le développement et l’amélioration du procédé de formulation des LNC chargées en siRNA. Les résultats ont permis une encapsulation à hauteur de 35%, une stabilité prolongée supérieure à 3 mois et une efficacité d’extinction du gène cible dans les cellules de mélanome. La deuxième partie de la thèse s’est orientée sur les stratégies de ciblage du mélanome après administration systémique. Différentes modifications de surface des LNC à l’aide de polyéthylène glycol (PEG) et d’Affitins (peptide d’affinité) ont été mises au point. La biodistribution sur des animaux « sains » ou des animaux greffés en sous-cutanés (mélanome humain) a révélé des comportements distincts en fonction des recouvrements utilisés. Les formes pegylées ont montré une accumulation préférentielle au site tumoral en comparaison avec les formes non modifiées ou modifiées avec les Affitins. Dans une troisième partie, des études d’efficacité anti-tumorale ont été réalisées avec un siRNA ciblant la protéine Bcl-2 ou la sous unité alpha 1 de la pompe Na/K ATPase. Une réduction du volume tumoral de 25% est observée avec les LNC siRNA Bcl-2. Par ailleurs, l’association de nouvelles chimiothérapies, les ferrocifènes, et des siRNA Bcl-2, montrent grâce à leur co-encapsulation au sein des LNC, des effets prometteurs. Ces travaux démontrent ainsi la capacité des LNC à délivrer des siRNA par voie intraveineuse dans de nouvelles stratégies de ciblage du mélanome. / Metastatic melanoma represents the most aggressive form of skin cancer with a median survival around 13 months. The low efficacy of actual chemotherapy is explained by important resistance phenomenon. The objective of this work consists in developing a new alternative strategy based on siRNA (small interfering RNA) encapsulated into lipid nanocapsules (LNCs) for intravenous injection. Firstly, the experiments were focused on development and optimization of formulation process for the encapsulation of siRNA into LNCs. The result demonstrated an encapsulation efficiency evaluated at 35% by spectrophotometer analysis, an important stability at 4°C (for at less 3 month) and an efficient gene inhibition in melanoma cells. The second part of this work studied the melanoma targeting potential of surface modified LNCs after systemic injection. In this way, pegylation with different polymers and Affitin grafting (affinity peptide) was performed on siRNA LNCs. The biodistribution on healthy animals and subcutaneous melanoma tumor bearing mice revealed the distinct behavior of various modified LNCs. All pegylated LNCs showed a preferential accumulation in tumor site in comparison with non-modified or Affitins LNCs. In a third part, the anti-cancer efficacy was tested with siRNA targeting Bcl-2, an anti-apoptotic member, or Alpha 1 subunit of Na/K ATPase. A reduction of tumoral volume evaluated at 25% was observed for Bcl-2 siRNA LNC. Moreover, the association with new promising anticancerous drug, ferrocifens, and Bcl-2 siRNA co-encapsulated into LNCs evidenced promising effects. This work demonstrated the capacity of LNC to deliver siRNA into melanoma cells and tumor after systemic administration thank to new targeting strategies in melanoma