Les travaux présentés dans cette thèse ont été entrepris dans le but de mieux caractériser des événements influençant la signalisation du récepteur de surface des lymphocytes T (TCR) au cours de la sélection thymique, étape importante dans la maturation des lymphocytes T. Le premier aspect étudié a été la modulation de l'activation de la MAPK (mitogen-activated protein kinase) ERK par le TCR, puisqu'il semble que l'intensité et la durée de l'activation de cette protéine contrôle l'issue de la sélection thymique soit la survie ou la mort de la cellule activée. Nous avons mis en évidence une interrelation entre l'activation de ERK et celle d'une autre protéine de la famille des MAPKs, p38. En utilisant un inhibiteur spécifique de l'activité p38 et également par la transduction d'une protéine dominante négative de p38 fusionnée au peptide TAT, permettant au complexe TAT-p38 d'entrer rapidement dans les cellules, nous avons observé que l'activation maximale de ERK par le TCR est dépendante de celle de p38. En deuxième lieu nous avons observé que l'adénosine inhibe l'activation du TCR en interagissant avec ses récepteurs de surface. Nous avons tenté d'identifier le ou les récepteurs d'adénosine responsable(s) du phénomène. Notre étude a déterminé que l'activation de ERK par le TCR était diminuée en présence d'adénosine et d'inhibiteur d'adénosine déaminase (de façon à empêcher la dégradation d'adénosine dans le milieu). L'utilisation d'agonistes et d'antagonistes des différents récepteurs d'adénosine connus (A1, A2A, A2B et A3) chez des souris normales ou déficientes pour le récepteur A2A a permis d'impliquer le récepteur A2A et de suggérer l'implication du récepteur A2B dans l'inhibition de la signalisation du TCR par l'adénosine. En conclusion, nos travaux ont apportés une meilleure connaissance des processus de régulation de l'activation de ERK par le TCR, une protéine déterminante dans le résultat final de la sélection thymique. De plus, il a été démontré que l'inhibition de la signalisation du TCR par l'adénosine est attribuable, du moins en partie, au récepteur A2A.

La voie ERK/MAPK est impliquée dans plusieurs processus biologiques dont la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose et la migration. Les protéines kinases MEK1 et MEK2 sont les seuls activateurs connus d'ERKl et ERK2. Les mutations inactivant les gènes Mekl et Mek2 ont été développées chez la souris pour étudier les fonctions des ces deux activateurs lors du développement embryonnaire. L'analyse phénotypique des mutants Mekl" montre une diminution de la prolifération et une augmentation de l'apoptose des populations trophoblastiques. Les embryons Mekïf~ meurent à mi-gestation d'une sous-vascularisation du labyrinthe placentaire qui normalement permet les échanges gazeux et nutritiormels foeto-maternels. Des analyses histologiques suggèrent également un problème de migration lors des processus d'invagination du réseau vasculaire. Ces résultats montrent que MEK1 est impliqué spécifiquement dans certaines fonctions des trophoblastes et que son absence induit une dysmorphogénèse létale du placenta murin. Pour étudier l'implication spécifique de MEK1 dans ces populations trophoblastiques, des modèles cellulaires ont été établis.

Les Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERKs) appartenant à la famille des MitogenActivated Protein Kinases (MAPKs) sont des protéines impliquées dans les voies de transduction cellulaires. Récemment, des équipes de recherche ont démontré la présence des ERKs chez les spermatozoïdes humains et une implication possible lors de la capacitation et de la réaction acrosomiale. Cependant, étant donné l'enchevêtrement des diverses voies de signalisation chez le spermatozoïde, la voie des ERKs demeure un sujet d'études complexe et controversé. De plus, les effecteurs ainsi que les substrats de cette voie ne sont pas encore identifiés. Nous avons démontré la présence des ERKs chez les spermatozoïdes porcins. Notre hypothèse est que les ERKs sont impliquées lors de la capacitation et la réaction acrosomiale chez les spermatozoïdes porcins. Nos résultats démontrent que bien que les ERKs soient sous leur forme active lors de la capacitation, elles n'auraient pas de rôle essentiel lors de la capacitation et la réaction acrosomiale chez les spermatozoïdes porcins.

Le psoriasis est une maladie cutanée inflammatoire multifactorielle chronique qui affecte 2 à 3 % de la population mondiale. Le mécanisme d'entrée en jeu de la pathologie est encore inconnu. De même, aucun traitement curatif n'existe sur le marché pharmaceutique menant à un rétablissement complet du phénotype des lésions psoriasiques. Certaines voies signalétiques ont été montrées comme étant dérégulées au niveau des kératinocytes de l'épiderme suite à l'infiltration de cellules immunitaires et de cytokines, mais certaines sont encore peu étudiées. L'objectif de ce projet a été d'étudier les trois principales voies de la famille des MAPKS dans la pathologie du psoriasis, soit ERK1/2, JNK et p38, en les inhibant, afin d'en observer les effets soit sur le modèle de peaux psoriasiques 3D reconstruites par génie tissulaire ou sur un modèle de monocouche. Il a été intéressant d'étudier le mécanisme d'action des inhibiteurs aux niveaux cytosolique et nucléaire, au regard du niveau d'expression de différentes protéines et de différents facteurs de transcription. Celles-ci ont été identifiées comme étant surexprimées chez les patients psoriasiques. Des substituts cutanés sains et psoriasiques ont été préparés selon la méthode d'auto-assemblage en présence de cytokines et de différents traitements visant les voies signalétiques ERK 1/2, JNK et p38. Des monocouches ont été préparées dans le but d'obtenir des extraits nucléaires permettant de déterminer le niveau d'activation de certains facteurs de transcription par retard sur gel (EMSA). Des analyses histologiques et protéiques ont été effectuées sur des substituts lésionnels et sains. Les résultats démontrent que le traitement des substituts avec les différents inhibiteurs tend vers un rétablissement partiel du phénotype des lésions psoriasiques vers un phénotype sain suite à une diminution de l'épaisseur de l'épiderme chez les substituts cutanés psoriasiques. La régulation de l'expression de différents marqueurs de prolifération et de différenciation est également observée. Les inhibiteurs introduits en monocouche montrent un rétablissement de l'expression de certains facteurs de transcription potentiellement impliqués dans le psoriasis. En conclusion, une meilleure compréhension des voies signalétiques affectées dans le psoriasis permettra le développement efficace et plus ciblé des traitements envisagés pour soigner cette pathologie. / Psoriasis is a chronic multifactorial inflammatory skin disease that affects 2-3% of the world's population. The mechanism of the onset of the disease is still unknown. Also, no curative treatment exists on the pharmaceutical market that leads to a complete recovery of the psoriatic lesion phenotype. Some signaling pathways have been shown to be deregulated in epidermal keratinocytes following infiltration of immune cells and cytokines, but many are still poorly studied. The objective of this project was to study the three main pathways of the MAPKS family in psoriasis pathology, ERK1/2, JNK and p38, by inhibiting them, to observe their effects on the 3D psoriatic skin model reconstructed by tissue engineering and on a monolayer model. It was interesting to study the mechanism of action of the inhibitors at the cytosolic and nuclear levels, with regard to the expression level of different proteins and transcription factors. These pathways were identified as being overexpressed in psoriatic patients. Healthy and psoriatic skin substitutes were prepared using the self-assembly method in the presence of cytokines and different treatments targeting the s6 ribosomal kinase (RSK) of the ERK 1/2 pathway kinase, JNK and p38. Monolayers were prepared to obtain nuclear extracts to determine the level of activation of certain transcription factors by gel electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Histologic and protein analyses were performed for the study of lesional and healthy substitutes. The results show that treatment of the substitutes with the different inhibitors leads to a tendency of partial recovery of the psoriatic lesion phenotype towards a healthy phenotype following a decrease in epidermal thickness in psoriatic skin substitutes. Variations in the expression of different proliferation and differentiation markers were also observed. Inhibitors introduced in monolayers show a restoration of the expression of some transcription factors potentially involved in psoriasis. In conclusion, a better understanding of the signaling pathways affected in psoriasis will allow for the efficient and more targeted development of treatments envisaged to treat this pathology.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The role of endogenous molecules in facilitating stem cell differentiation into cardiomyocytes is yet to be fully understood. SPC and S1P, common biolipids, promote cardiac differentiation of mesenchymal stem cells and cardiac progenitor cells, however, the same potential of closely related lysophosphatidic acid (LPA) has only recently become evident. The initial cardio-protection offered by elevated LPA levels in response to acute myocardial infarction and the ability of this biolipid to mediate other cellular fates served as a rationale to investigate the ability of LPA to mediate the cardiac differentiation of the murine P19 teratocarcinoma cell line and further examine the role of signalling molecules critical to lineage commitment. All experiments were carried out using P19 stem cells, cultured in supplemented alpha-minimal essential medium. Cells were aggregated into embryoid bodies in the presence of 5µM LPA in non-tissue grade Petri dishes over the course of 4 days to commence the differentiation process. Inhibitors were added 60 minutes before LPA while control cells were cultured in medium only. Embryoid bodies were transferred to 6-well tissue culture grade plates and cultured for a further 6 days. Cardiac differentiation was assessed by examining the expression of ventricular myosin light chain (MLC1v) by western blot and the role of LPA receptors 1-4, PKC, PI3K, MAPKs, and NF-κB were determined by examining the changes in this expression in the presence of selective inhibitors. The induction and regulation of GATA4, MEF2C, ATF-2, JNK, and YAP was also determined by western blotting. The activity and regulation of transcription factors, AP-1 and NF-κB, and the MAPKs was determined using ELISA kits. LPA induced the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes most effectively when used at a concentration of 5µM as evidenced by the expression of MLC1v on day 10 of the differentiation process. Inhibition of LPA receptor 4 (0.1mg/mL Suramin), LPA receptors 1/3 (20µM Ki16425), LPA receptor 2 (7.5nM H2L5186303), PKC (10µM BIM-1), PI3K (20µM LY294002), ERK (20µM PD98059), JNK (10µM SP600125), and NF-κB (0.01nM CAY10470) blocked LPA induced expression of MLC1v. GATA4, MEF2C, pcJun, pJunD, and pATF2 expression increased in a time-dependent manner peaking at day 10 in LPA treated cells. GATA4 and pcJun expression was suppressed by all the inhibitors whereas MEF2C expression was unaffected by CAY10470, pJunD expression was unaffected by H2L5186303, pATF2 and NF-κB expression was unaffected by LY294002, but the latter was enhanced by Suramin. JNK was transiently phosphorylated in all cells whereas YAP was dephosphorylated 24-48 hours after EB formation in LPA treated cells and were both affected by Ki16425 and partially by H2L5186303 treatment. In conclusion, the studies carried out in this thesis have shown that LPA mediates the cardiac differentiation of P19 cells through LPA receptor 2, partially through receptors 1/3, and possibly through receptor 4. Conceivably downstream of these receptors, PKC, PI3K, MAPK, and NF-κB signalling pathways converge on the regulation of cardiac-specific transcription factors GATA4 and MEF2C along with ubiquitous transcription factor AP-1. JNK signalling is initiated through LPA receptors 1/3 and partially through receptor 2 to commence the cardiac program however the role of JNK and YAP in the proliferation of aggregating EBs is yet to be entirely established.

Skeletal muscle has an integral role in many activities. Although mechanical stretch and active force generation are known to be required for the maintenance of healthy muscle function, the mechanism by which those signals mediate muscle growth is unknown. This project was based on the hypothesis that stretch and force generation activate the Calcineurin/NFAT pathway and induce Cox-2 expression and initiate muscle hypertrophy. The specific aims of this study were to 1) develop a minimally invasive system capable of initiating hypertrophic signaling in mice, 2) characterize the effects of isometric activation, passive lengthening, and active lengthening on signaling cascades, and 3) determine the involvement of the Calcineurin/NFAT pathway and activation of COX-2 gene expression. We propose a pathway in which stimuli increase intracellular calcium, which activates the phosphatase calcineurin. Calcineurin dephosphorylates NFAT, which is translocated into the nucleus and initiates transcription of the COX-2 gene. COX-2 mediated synthesis of PGG2 is the rate-limiting step in bioactive prostaglandin synthesis. Prostaglandins then stimulate known hypertrophic signals including the PI-3 Kinase and MAP Kinase signaling cascades.

G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest family of transmembrane receptors. The beta-arrestins, adaptor proteins involved in GPCR desensitization, may also act as scaffolds for signaling pathways such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade. The MAPK family, which includes the extracellular-signal regulated kinases (ERK) 1 and 2, promotes cellular differentiation and proliferation. Herein, the activation of ERK1/2 upon stimulation of the GPCR bradykinin type 2 receptor (B2R) with bradykinin was examined. Various B2R mutants with modified C-termini were employed to examine the temporal kinetics of ERK1/2. One of these receptor mutants displayed a loss of beta-arrestin binding as well as greatly enhanced ERK1/2 activation, compared to the wild-type receptor, when a cluster of serine/threonine residues important for B2R internalization was mutated. The other receptor mutants exhibited a correlation between their affinity for beta-arrestin and the intensity of ERK1/2 activation. Data from a mouse embryonic fibroblast cell line null for beta-arrestin suggested that beta-arrestin is involved in late-phase ERK1/2 activation by the B2R. These data point to the involvement of beta-arrestin in the activation of the ERK1/2 MAPKs through the B2R.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [232-250]. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.