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RAS est une petite protéine Rho-GTPase à la tête d'un réseau de signalisation prolifératif important. Les sentiers activés par RAS incluent les Mitogen-Activated proteins Kinases (MAPK) et la voie Phosphoinositide-3-kinase (PI3K) /Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Bien que de nombreuses évidences soutiennent une forte implication de RAS dans la carcinogenèse, les mécanismes moléculaires précis liant RAS et prolifération cellulaire ne sont pas tous élucidés. En utilisant des données publiques de phosphoprotéomique, notre équipe a identifié Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) comme une nouvelle cible de RAS essentielle à la croissance et à la prolifération. ZNF768 est un facteur de transcription qui est déstabilisé au niveau post-traductionnel par les voies MAPK et mTOR/AKT. La déplétion aigue de ZNF768 induit prématurément une entrée en sénescence, un état caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, et souvent mis en place en réponse au stress. Nos études montrent que ZNF768 est dégradée durant ce phénomène ainsi que durant la sénescence réplicative. De plus, la surexpression de ZNF768 réduit l'entrée en sénescence, via un mécanisme majoritairement dépendant du facteur de transcription p53, qui joue un rôle important dans la sénescence. ZNF768 affecte négativement la phosphorylation de certains résidus clés pour l'activation de p53 et inhibe son activité transcriptionnelle. Nous avons par ailleurs démontré une interaction physique entre ces deux protéines. L'ensemble de ces résultats suggère que les voies MAPK et mTOR, toutes deux activées par RAS, déstabilisent ZNF768 afin de renforcer la sénescence prématurée. De manière intéressante, les niveaux de ZNF768 sont élevés dans certaines tumeurs humaines. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel ZNF768 puisse favoriser la carcinogenèse en réduisant la sénescence et en favorisant la prolifération. / RAS is a small Rho-GTPase protein that integrates growth factors signaling and activates several proliferating pathways including Mitogen-Activated Proteins Kinases (MAPK) and Phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Although many evidence indicate that RAS is involve in carcinogenesis, the molecular mechanisms that link RAS to cellular proliferation are not well understood. By using phosphoproteomics data, our team identified Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) as a new target of RAS signaling essential to growth and proliferation. ZNF768 is a transcription factor destabilized at the post-translational level by MAPK and mTOR/AKT. The acute depletion of ZNF768 induces senescence, a stable arrest of the cell cycle triggered by cellular stress. Our results show that ZNF768 is depleted during replicative and premature senescence. In addition, overexpression of ZNF768 bypasses senescence by a mechanism that is mainly dependent on the activity of p53, a transcription factor involved in senescence. Interestingly, ZNF768 interacts with p53 and inhibits its transcriptional activity by modulating its phosphorylation. Thus, MAPK and mTOR/AKT pathways destabilise ZNF768 to reinforce senescence. Moreover, ZNF768 levels are high in various human tumors. Altogether, these results suggest that ZNF768 promotes carcinogenesis by blocking senescence and by stimulating proliferation.

La dysfonction musculaire est une des manifestations importantes de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Cette dysfonction musculaire amène plusieurs anomalies musculaires tant au niveau clinique, structural, métabolique que biochimique. Ces anomalies contribuent à l’intolérance à l’effort, la perte de masse maigre et de force musculaire, ainsi qu’à la diminution de la qualité de vie des patients atteints de la MPOC. Cette thèse a pour objectif général l’étude de la dysfonction musculaire périphérique dans la MPOC, plus précisément 1) l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans l’atrophie musculaire 2) l’étude du métabolisme musculaire à la suite d’un exercice en endurance et 3) l’étude de la réponse cellulaire suite à un exercice en résistance. Tout d’abord, nous avons démontré que la voie de signalisation des MAPK, plus précisément les protéines p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK, pourrait jouer un rôle important dans le développement de l’atrophie musculaire chez les patients atteints de la MPOC. Par la suite, nous avons démontré que le SAA1 pourrait être impliqué dans la dysfonction des muscles périphériques chez les patients atteints de la MPOC. Le SAA1 est augmenté de façon significative tant au niveau de l’expression du gène que le niveau d’ARNm chez les patients présentant une MPOC. En second lieu, nous avons démontré une plus grande dépendance du système énergétique à la glycolyse a été observée lors d’un exercice en endurance chez les patients MPOC, ce qui pourrait contribuer à l’intolérance à l’exercice chez la MPOC. Finalement, nous avons déterminé qu’il existe une réponse cellulaire différente pour les protéines associées au maintien de la masse maigre suite à une session d’exercice en résistance chez les patients MPOC en comparaison à des sujets sains appariés pour l’âge. Cette thèse jette donc la lumière sur la contribution des voies de signalisation et des facteurs inflammatoires impliqués dans la dysfonction musculaire chez les patients présentant une MPOC et de la réponse à l’exercice tant en endurance qu’en résistance dans la MPOC. Ces résultats ajouteront aux connaissances moléculaires et cellulaires qui contribuent à la dysfonction musculaire périphérique et à l’intolérance à l’effort chez les patients atteints de la MPOC. / Peripheral muscle dysfunction is one of the most important systemic manifestations of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). This dysfunction brings many muscle abnormalities at the clinical, structural, metabolic and biochemical levels. These abnormalities contribute to the exercise intolerance, loss of muscle mass and force as well as diminishing quality of life of patients with COPD. This thesis as for general objective the investigation of peripheral muscle dysfunction in COPD, more precisely 1) the study of signalling pathways involved in muscle atrophy 2) the study of muscle metabolism in response to endurance exercise involved in exercise intolerance and 3) the study of muscle cellular adaptations to resistance exercise involved in the less than optimal response following resistance training in patients with COPD. First, we showed the possible contribution of the MAPKs, more precisely p38 MAPK, ERK1/2 and JNK, to the peripheral muscle dysfunction in COPD. The phosphorylation levels as well as the mRNA expression of these key proteins are elevated in patients with COPD compared to age-matched healthy controls. We also demonstrated that SAA1 could have a possible role in the peripheral muscle dysfunction in COPD. Secondly, we observed that patients with COPD have a greater reliance on the muscle glycolytic metabolism during an endurance exercise done until exhaustion, therefore possibly contributing to the exercise intolerance seen in patients with COPD. Lastly, we demonstrated that the cellular adaptation in response to resistance exercise training is different for proteins involved in muscle mass regulation in patients with COPD compared to age-matched healthy controls, thus possibly contributing to the less-than-optimal response to resistance exercise training in patients with COPD. This thesis puts at the forefront the signalling pathways and inflammatory markers contributing to the inherent peripheral muscle dysfunction in patients with COPD, as well as the investigation of exercise response in patients with COPD. These results will add to the scientific knowledge of the metabolic and cellular aspects of peripheral muscle dysfunction in COPD.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus de type 2 induit un mécanisme de mort cellulaire alternatif indépendant des caspases et qui résiste à l'oncogène Bcl-2. E4orf4 constitue donc un outil moléculaire puissant pour étudier de nouveaux effecteurs impliqués dans la mort cellulaire. À mon arrivée dans le laboratoire, il avait été démontré qu'E4orf4 usurpait l'activité des tyrosine kinases de la famille Src afin de réorganiser le cytosquelette d'actine et que ce processus était corrélé avec son activité cytotoxique. Par contre, la nature des modifications de la dynamique de l'actine ainsi que le mécanisme moléculaire impliqué étaient inconnus. L'hypothèse à la base de mes travaux est qu'E4orf4 désorganise le réseau d'actine en manipulant l'activité des Rho GTPases et que le débalancement de la dynamique de l'actine qui en résulte engage la cellule dans un programme de mort cellulaire alternatif. Mes travaux indiquent qu'E4orf4 active le sentier Src-RhoA-ROCK, ce qui stimule la contractilité cellulaire en activant la myosine II. L'activité de cette dernière est essentielle, car son inhibition bloque le programme de mort cellulaire induit par E4orf4. Par conséquent, mes travaux ont contribué à établir un lien fonctionnel entre la dynamique de l'actine et la mort cellulaire. De plus, mes résultats indiquent que la stimulation du sentier Src-RhoA -ROCK par E4orf4 contribue à activer la MAP kinase JNK qui est nécessaire pour phosphoryler la sérine 178 de paxilline. Mes résultats montrent que la phosphorylation de cette sérine de paxilline diminue sa mobilité, contribuant ainsi à stabiliser les plaques d'adhérence en aval d'E4orf4. En outre, la phosphorylation de la sérine 178 de paxilline est essentielle à l'activité cytotoxique d'E4orf4, car son iphibition interfère avec la réorganisaton du cytosquelette d'actine et la condensation nucléaire induites par E4orf4. Ainsi, mes travaux suggèrent que JNK coopère avec la myosine II pour perturber la dynamique de l'adhérence et de l'actine en aval d'E4orf4. En conséquence, je propose qu'E4orf4 induit l'axe de signalisation Src-RhoA-ROCK pour générer un stress mécanique via la coordination des dynamiques de l'adhérence et de l'actine qui culmine par la mort programmée de la cellule.

L’hypoxie est un processus physiopathologique impliqué dans l’embryogenèse et le développement de maladies cardiovasculaires, mais également dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Au niveau cellulaire, la réponse hypoxique est médiée par une activité transcriptionnelle adaptative hautement régulée via le facteur de transcription induit en hypoxie, HIF-1(Hypoxia inducible factor-1). L’activité de ce facteur de transcription est dépendante de la stabilisation de sa sous-unité HIF-1α en fonction des niveaux d’oxygène. Dans des travaux récents, nous avons identifié un nouveau répresseur de l’expression de HIF-1α, soit la protéine arginine méthyltransférase 1 (PRMT1). En inhibant l’activité des facteurs de transcription Sp1 et Sp3 (Sp1/3) au promoteur de HIF-1α, PRMT1 module la disponibilité de la sous-unité HIF-1α et l’activité du facteur de transcription HIF-1. Dans ces mêmes travaux, nous avons montré que PRMT1 inhibe l’activité de Sp1/3 en empêchant leur phosphorylation via la répression de la voie de signalisation mitogénique MAPK (mitogen-activated protein kinases) composée entre autres des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases) et de la kinase MEK (MAPK/ERK kinase) qui peut elle-même être activée par la kinase PAK1 (p21-activated kinase). Nous avons également identifié le facteur d’échange de nucléotides guanyliques DOCK6 comme partenaire de PRMT1 et comme intermédiaire dans la régulation de la voie MAPK. Le but de cette étude est donc de mieux caractériser le rôle de DOCK6 dans le contrôle de l’expression de HIF-1α et dans la régulation de la voie MAPK modulés par PRMT1. Nos résultats montrent que la méthylation de DOCK6 par PRMT1 inhibe son activité GEF(guanine exchange factor) ce qui résulte en l’inactivation de la signalisation PAK1/MEK/ERK1/2 en aval. De manière intéressante, nos résultats montrent également que l’expression protéique de DOCK6 est modulée en hypoxie de manière HIF-1 dépendante. Enfin, nous montrons queHIF-1α est nécessaire pour l’activation de la voie MAPK en hypoxie. Ces travaux permettent de mieux comprendre le mécanisme de rétrocontrôle régulant les protéines HIF-1, PRMT1, DOCK6 et la voie MAPK. Ce projet souligne ainsi l’importance et la complexité de la régulation du facteur de transcription HIF-1 lors de contextes cellulaires hypoxiques particuliers. / Conditions of low oxygen, or hypoxia, are involved in various pathophysiological situations including cancer and cardiovascular diseases. Hypoxic responses are mediated through a highly regulated transcriptional response in which hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) plays an important role. HIF-1transcriptional activity relies on hypoxia-dependent stabilization of HIF-1α, an essential HIF-1 subunit. In previous work, we identified protein-arginine methyltransferase 1 (PRMT1) as a novel repressor of HIF-1αexpression. By inhibiting the activity of specificity proteins 1 and 3 (Sp1, Sp3; Sp1/3) transcription factors, PRMT1 regulates HIF-1α subunit availability and HIF-1 activity. PRMT1 blocks Sp1/3 activity by preventing phosphorylation through the inhibition of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway. MAPK pathway iscomposed of ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases) and MEK (MAPK/ERK kinase), which can itself be activated by PAK1 (p21-activated kinases). In addition, we identified the guanine nucleotide exchange factor (GEF) DOCK6 as a novel PRMT1 binding partner and as an intermediate for the regulation of MAPK pathway. Therefore, the aim of this study is to better characterize the role of DOCK6 in HIF-1α expression and MAPK regulation. Our results show that DOCK6 is directly methylated by PRMT1. PRMT1 methylation of DOCK6 alters its GEF activity and results in the inactivation of downstream PAK1/MEK/ERK1/2signaling. Interestingly, our results indicate that DOCK6 levels are increased by hypoxia in a HIF-1 dependent manner. Finally, we show that HIF-1αis required for MAPK pathway activation in hypoxic conditions. These studies demonstrate the intricate feedback mechanism that can regulate HIF-1, highlight the complexity of HIF-1 regulation under hypoxic conditions and identify novel targets for potential intervention.

Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothéliale, notamment au cours d’exposition aux rayonnements ionisants. L’altération de l’endothélium induite par le stress oxydant est impliquée dans la toxicité radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothéliales est donc un enjeu important des traitements radiothérapeutiques actuels. Cet objectif nécessite une meilleure caractérisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothéliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la réponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractérisée. Par une approche protéomique, nous avons identifié la nucléophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothéliales. La phosphatase PP2a est aussi associée à ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500μM) régule la déphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la présence de NPM déphosphorylée au noyau altère la réponse des cellules aux dommages à l’ADN induits par le stress oxydant. Le céramide sphingolipide membranaire est également un facteur important des voies de stress, particulièrement dans les cellules endothéliales. Notre étude aborde donc l’implication de ce sphingolipide dans la régulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractérisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra d’identifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothéliales et leurs conséquences délétères sur les tissus environnants. / The microvascular compartment is a significant target of oxidative stress that is a major factor in endothelial dysfunction, especially during exposure to ionizing radiation. The alteration of endothelium induced by oxidative stress is involved in radiation-induced toxicity of normal tissues. Limiting endothelial dysfunction is therefore an important issue of current radiotherapeutic treatments. This objective requires a better characterization of oxidative stress signaling in endothelial cells. p38 MAPK pathway is essential in oxidative stress response but still insufficiently characterized. By using a proteomic approach, we identified nucleophosmin (NPM) as a new partner of p38 in the cytoplasm of endothelial cells. PP2a phosphatase is also associated with the NPM/p38 complex. Our work shows that oxidative stress (H2O2, 500μM) regulates the NPM dephosphorylation via PP2a, causes a rapid dissociation of the complex, and promotes its translocation to the nucleus. In addition, we show that the presence of NPM dephosphorylated at T199 in the nucleus alters the cellular response to DNA damage induced by oxidative stress. The membrane sphingolipid ceramide is also an important factor in stress pathways, particularly in endothelial cells. Our study describes the involvement of this sphingolipid in the regulation of NPM/p38 pathway. A better characterization of the p38 pathway and its actors provided by our study will identify potential targets in order to limit endothelial dysfunction and its deleterious effect on surrounding tissues.

La migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF est une étape cruciale du processus angiogénique. La liaison du VEGF sur son récepteur, le VEGFR2, conduit à l’autophosphorylation sur la tyrosine 1214 de ce dernier ce qui induit l’activation de la voie p38 MAP-kinase, le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration cellulaire. Les microARNs sont de courts ARN non-codant qui régulent de façon post-transcriptionnelle l’expression des gènes. Nous avons identifié deux microARNs, miR-20a et miR-196a, dont les niveaux d’expression sont respectivement augmentés et diminués en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces deux microARNs modulent le remodelage du cytosquelette d’actine, la migration et l’angiogenèse. Aussi, nous avons décrit leurs implications dans la régulation de la voie p38. Tout d’abord, miR-20a agit en amont de p38, et réprime l’expression de MKK3 en se liant de façon spécifique à sa région 3’UTR. MKK3 étant un activateur direct de p38 en réponse au VEGF, la surexpression de miR-20a empêche l’activation de p38, de son substrat la MAPKAP kinase-2 et la phosphorylation subséquente de HSP27. En conséquence, miR-20a inhibe la formation des fibres de tension, la migration endothéliale et l’angiogenèse. Ces résultats nous ont permis de conclure que miR-20a agit dans une boucle de régulation négative afin de moduler la migration dépendante de la voie p38 activée par VEGF. Ensuite, le niveau d’expression de miR-196a est diminué en réponse au VEGF et nous avons démontré sa liaison spécifique à la région 3’UTR de l’ANXA1. En accord avec nos précédents travaux démontrant que l’ANXA1 est importante pour la migration endothéliale dépendante de l’activation de p38 par le VEGF, la surexpression de miR-196a empêche la formation des lamellipodes, réduit les capacités migratoires des cellules endothéliales et inhibe ainsi l’angiogenèse in vitro et in vivo. En conclusion, une réduction de l’expression de miR-196a agit en synergie avec le VEGF, pour faciliter la migration endothéliale, en maintenant un niveau d’expression élevé de l’ANXA1 pro-migratoire. Nos résultats, en impliquant miR-20a et miR-196a dans la modulation de l’angiogenèse, apportent des concepts nouveaux sur la régulation de la voie p38 pro-migratoire en réponse au VEGF. Ces travaux ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à régulariser l’angiogenèse pathologique. / Endothelial cell migration in response to VEGF is a crucial step of angiogenesis. VEGF binding to its receptor VEGFR2 results in the autophosphorylation of the receptor at tyrosine 1214, which induces the downstream activation of the p38 MAP-kinase pathway leading to actin cytoskeleton remodeling and cell migration. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate post-transcriptionally gene expression. We identified two microRNAs, miR-20a and miR-196a, whose levels of expression were increased and decreased respectively in response to VEGF in endothelial cells. Both microRNAs modulate VEGF dependent-endothelial cell cytoskeleton remodeling, migration and angiogenesis. Also, we described that they are involved in regulating the p38 pathway. First, miR-20a acts upstream of p38, and negatively regulates MKK3 by specifically binding on MKK3 3’UTR. As MKK3 is a direct activator of p38 in response to VEGF, overexpression of miR-20a impairs p38 activation, the downstream activation of MAPKAPK2 and the phosphorylation of HSP27. Consequently, miR-20a reduces stress fibers formation, and subsequent endothelial cell migration and angiogenesis. We conclude that miR-20a may act in a feedback loop to regulate the p38 pathway-mediated VEGF-induced endothelial cell migration. Then, miR-196a is decreased in response to VEGF and we demonstrate its specific binding on ANXA1 3’UTR. In accordance with our previous work demonstrating that ANXA1 is important for VEGF-induced endothelial migration downstream of p38 pathway, overexpression of miR-196a impairs lamellipodia and endothelial cell migratory capacities upon VEGF treatment, leading to angiogenic defects. We conclude that miR-196a acts in a synergetic mechanism with VEGF to facilitate endothelial cell migration, by maintaining high level of the pro-migratory protein ANXA1. Finally, our results implicate miR-20a and miR-196a in the angiogenic process and give new insights in p38 pathway-dependent endothelial cell migration regulation in response to VEGF. The present work opens new avenues for strategies and future development of therapeutics in line with the treatment of angiogenic pathologies.

Les gènes Mekl et Mekl codent pour les activateurs des MAPK ERK1 et ERK2. Afin de déterminer la fonction de ces deux activateurs dans la voie ERK/MAPK lors du développement embryonnaire, les gènes Mekl et Mek2 ont été inactivés chez la souris. Les embryons Mekl ''' meurent à mi-gestation d'une malformation du placenta caractérisée par une sous-vascularisation du labyrinthe, région du placenta impliquée dans les échanges nutritionnels et gazeux foeto-maternels. Les souris Mek2 ~'~ sont viables et fertiles et ne présentent aucun phénotype. Afin d'évaluer le rôle possible du gène Mekl lors du développement embryonnaire, les deux mutations ont été introduites chez les mêmes individus. De façon inattendue, les souris Mekl +/" : Mek2 +/ ~ présentent une diminution du taux de survie de 90%. Les souris Mekl +/ ~ : Mekl +/ ~ meurent durant la gestation à partir du jour 14.5. L'analyse phénotypique montre un problème au niveau de la prolifération, responsable de la diminution de la taille du placenta. Un problème au niveau de la vascularisation du placenta est également observé. L'analyse des génotypes montre que la mort des embryons est causée par un problème qui se situe au niveau des structures extra-embryonnaires. Ces résultats suggèrent que la perte de deux allèles du gène Mekl a moins d'impact sur le développement embryonnaire que la perte d'un allèle de chaque gène Mek, suggérant un rôle important de Mekl lors du développement. Des analyses montrent également que le phénotype au niveau du placenta s'aggrave avec l'augmentation du nombre d'allèles mutés Mek. Ce phénomène pourrait s'expliquer par un effet de dosage des gènes Mek. Un allèle Mekl hypomorphe a été généré ainsi qu'un allèle conditionnel. Ces nouveaux allèles ont servis à tester cette hypothèse. Les phénotypes des différents mutants ont été caractérisés et sont présentés. / MEKl and MEK2 are dual-specificity kinases that activate the extracellular signal - regulated kinase (ERK) mitogen-activated protein (MAP) kinases upon agonist binding to receptors. To determine the function of Mekl and Mek2 during embryonic development, we inactivated each Mek gene in the mouse. Mekl'1 ' embryos died at 10.5 days of gestation. Histopathological analyses revealed a reduction in vascularization of the placenta that is due to a marked decrease of vascular endothelial cells in the labyrinthine region. Mekl''' mice are viable and fertile, and they do not present flagrant morphological alteration. To determine the role of each Mek gene during embryonic development, we introduced both mutations in the same mouse. Surprisily, 90% of the Mekl+/ ~ : Mekl+/ ~ mice died before birth. Histopathological analyses suggest a problem with the vascularization of the placenta and the proliferation of the trophoblasts in the labyrinth. Genotyping analyses revealed that embryos die due to a problem with the extra-embryonic structures. The results show that the loss of two alleles of Mekl gene is less important for the embryo development than the loss of one allele of each Mek gene suggesting an important role of Mekl in embryo development. Our data also indicate that the expressivity of the placental phenotype increases with the number of mutated Mek alleles. This can be explained by a gene dosage effect of the Mek genes. We have also generated an Mekl hypomorph allele and a conditional allele. Those alleles will be used to test this hypothesis. The characterization of the phenotype for each mutant will be presented.

Dans le laboratoire du Dr. Charron, le gène Mekl a été inactivé par mutagenèse d'insertion et il a été démontré que les embryons Mekl'' mouraient à la mi-gestation à cause d'une vascularisation déficiente du placenta (Giroux et al., 1999). Chez les placentas Mekl'' la structure du labyrinthe (impliqué dans les échanges nutritifs et gazeux entre le fœtus et la mère) est réduite voire quasi-inexistante. Les objectifs de la présente thèse étaient (i) d'étudier en détails le phénotype placentaire Mekl'", (ii) d'étudier la signalisation de la voie ERK/MAPK in vitro dans un modèle cellulaire participant au développement du placenta, et (iii) de générer un allèle conditionnel de Mekl afin de faire le 'rescue' du placenta Mekï'~. Par marquage immunohistochimique, il a été montré qu'il y a plus de cellules apoptotiques et moins de cellules prolifératives dans la région chorion-allantois du placenta Mekt' en comparaison avec les placentas Mekt/+ . Des analyses westerns sur des extraits totaux de placentas ont montré que la voie ERK/MAPK est beaucoup moins activée chez les spécimens Mekl~'~. Chez les placentas Mekl*'*, il a été montré que MEK1/2 sont activés de façon ubiquitaire dans la région du labyrinthe alors que, ERK1/2 sont principalement activés au niveau des syncytiotrophoblastes (SCT). Chez les placentas Mekl'', bien que MEK2 soit fortement activé au niveau de la jonction chorion-allantois, aucune activation de ERK n'est détectée à la jonction chorion-allantois. Par hybridation in situ, en utilisant le gène Gcml comme un marqueur des précurseurs de SCT, il a été montré que chez les placentas Mekl"', les SCT sont déterminés au bon moment, semblent se différencier normalement, mais sont incapables d'envahir le chorion pour guider la formation du réseau vasculaire du labyrinthe. Ces résultats suggèrent l'implication de Mekl dans la migration et/ou la différenciation des SCT. Par ailleurs, nous avons aussi montré que chez les spécimens Mekl1 ''", la p38/MAPK est phosphorylée au niveau des cellules endothéliales entourant les vaisseaux sanguins fœtaux du labyrinthe. Ce résultat concorde avec les données publiées dans la littérature indiquant que la voie p38 /MAPK est impliquée dans l'angiogenèse. L'activation de p38/MAPK chez les placentas Mekl'1 ' semble normale. Nos résultats suggèrent donc que la voie ERK/MAPK serait essentielle pour la morphogenèse de la barrière formée par les SCT alors que la p38/MAPK serait plutôt impliquée dans l'angiogenèse des cellules épithéliales des vaisseaux sanguins du labyrinthe. D'autre part, plusieurs lignées de trophoblastes souches (TS : cellules souches participant activement dans la morphogenèse du placenta) Mekl+/+ et une lignée de TS Mek2'y ' ont pu être dérivés. Cependant, aucun TS Mekl' ' n'a pu être établi et deux des quatre lignées Mekl''' établies dans les conditions de culture de cellules TS, se sont avérées être des cellules embryonnaires souches (ES). Cette observation soulève plusieurs questions intéressantes en rapport au rôle de Mekl dans la prolifération et la différenciation des TS et/ou des cellules ES in vitro. Des travaux sont actuellement en cours dans notre laboratoire pour approfondir ces rôles. Un autre volet du présent projet était d'étudier le rôle de Mekl dans le développement de l'embryon proprement dit, il a été montré que lorsque les cellules ES Mekl'' sont agrégées avec des embryons tétraploïdes on arrive à générer des embryons et des placentas qui se développent normalement jusqu'au stade E13.5. Cependant, cette sauvegarde est incomplète, car l'embryon à E13.5 présente une morphologie légèrement anormale. Pour confirmer ce résultat, un allèle conditionnel chez lequel l'exon 3 de Mekl est flanqué par deux sites loxP (Mekl*10™) a été généré. L'excision de l'exon 3 génère un allèle nul de Mekl (MeklA ). En utilisant une lignée de souris transgénique exprimant la Crerecombinase spécifiquement dans l'épiblaste (Sox2Cre), des embryons MeklA/Aayant un placenta de type sauvage ont été généré. De plus, les souris MeklA/A sont viables et fertiles en l'absence de MEK1. En conclusion, les résultats décrits dans cette thèse suggèrent fortement que Mekl est requis principalement pour le développement des structures extra-embryonnaires du placenta murin. / Previously, it has been shown that Mekï' embryos die between E9.5-10.5 without any major embryonic malformations, while the placenta presented marked reduction in labyrinthine vascularisation (Giroux et al., 1999). By western analyses we showed that the ERK/MAPK pathway is much less activated in the Mekï ' placentas compared to wild type specimens. Our immunohistochemical analyses revealed that in Mekl+/+ placentas, MEKl/2 are ubiquitous and highly activated in the labyrinth (where gaseous and nutrient exchange take place between the fetus and the mother). ERK1/2 are activated mostly in syncytiotrophoblasts (SCT: ultimate barrier separating fetal and maternai blood flows in the labyrinth). In Mekï" placentas, MEK2 is mostly activated in the chorio-allantoic junction while ERK1/2 are activated exclusively in the allantois and not in the chorio-allantoic junction. Mekï'' placentas presented abnormal morphogenesis of the SCT barrier. Indeed, in Mekï'" placentas, we showed that SCT precursors (Gcm/-positive cells) are determined at the right moment (around E8.5), seemed to be able to differentiate but did not seem to be able to invade the chorion. We also showed that in Mekl*'+ specimens, the p38/MAPK pathway is phosphorylated in endothelial cells surrounding the labyrinthine fetal blood vessels. This observation is in accord with data published in literature assigning an important role of the p38/MAPK pathway in angiogenesis. Activation of the p38/MAPK pathway in Mekï' embryos seemed normal. Our results suggest that signaling through Mekl might be essential for SCT barrier morphogenesis. Furthermore, Giroux et al., (1999) showed that Mekï'" mouse embryonic fibroblasts failed to migrate in response to a fibronectin matrix. Hence we were interested to verify the migration and differentiation potentials of a cell type participating actively in placental development, i.e. trophoblast stem cells (TS). We managed to isolate several wild type and one Mekl'' TS cell lines while we did not obtain any Mekï'' TS. Interestingly, the cells obtained from Mekï'' blastocysts were mainly embryonic stem cells (ES). Hence these findings posed new questions concerning the implication of Mekl in the growth and maintenance of TS cells in vitro. Experiments are being carried out in our laboratory to pour light on these interrogations. Furthermore, we wanted to investigate the role of Mekl in the development of the embryo after E10.5. Using the tetraploid aggregation strategy, we were able to generate live E13.5 Mekl' ' embryos, hence suggesting that the Mekl phenotype is probably extra-embryonic and cell-autonomous. We confirmed thèse results by generating a conditional Mekl allele, in which the exon 3 of Mekl is flanked by two loxP sites (Mekla ° xed). By crossing this mouse with transgenic Cre mouse line (Sox2cre) expressing Cre recombinase specifically in the epiblast, we showed that the Mekl null {MeklA/A) mouse is viable and fertile. Our results demonstrate that Mekl is primordial for extraembryonic development in mouse.

Yes / Interferon lambda (IFNλ) is important for epidermal defence against viruses. It is produced by, and acts on, keratinocytes, whereas fibroblasts were previously considered to be unresponsive to this type III IFN. Herein we report findings revealing cell type-specific differences in IFNλ signalling and function in skin resident cells. In dermal fibroblasts, IFNλ induced the expression of MxA, a potent antiviral factor, but not other IFN signature genes as it does in primary keratinocytes. In contrast to its effect on keratinocytes, IFNλ did not phosphorylate STAT1 in fibroblasts, but instead activated MAPKs. Accordingly, inhibition of MAPK activation (p38 and p42/44) blocked the expression of MxA protein in fibroblasts but not in keratinocytes. Functionally, IFNλ inhibited proliferation in keratinocytes but not in fibroblasts. Moreover, IFNλ upregulated the expression of TGFβ1-induced collagens in fibroblasts. Taken together, our findings identify primary human dermal fibroblasts as responder cells to IFNλ. Our study shows cutaneous cell type-specific IFN signalling and suggests that IFNλ, whilst important for epidermal anti-viral competence, may also have a regulatory role in the dermal compartment balancing type I IFN-induced inhibition of tissue repair processes.