München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Universiẗat, Diss., 2002--Mainz.

Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt. / The Raf-MEK-ERK signaling cascade plays an important role in many diseases, such as cardiac hypertrophy, diabetes and inflammation. ERK1/2 is involved in many cellular processes, i.a. proliferation, differentiation, growth, hypertrophy and apoptosis. This MAPK signaling pathway also has a significant function in tumorigenesis because it is clearly activated in about 50% of all cancers. The aim of this work was to investigate the role of a newly discovered phosphorylation site on threonine188 in ERK2 in the genesis and possible therapy of tumors. For this, a Myc- ERK2309-357 peptide was used, which was developed in the research group Lorenz in 2013. It has previously been shown that Myc-ERK2309-357 binds directly to ERK2, inhibits ERK1/2 dimerization, and prevents increased localization of ERK2 in the nucleus. In this project we demonstrated that the Myc-ERK2309-357 peptide reduces the tumor cell proliferation of various cancer cell lines (Caco-2, SCC68, PC / 1-1 and PC / 13-1) by 60-80%. Furthermore, we could show that Myc-ERK2309-357 has no influence on the phosphorylation of ERK1/2 on the TEY motif. The activation of ERK1/2 by the kinases MEK1/2 is thus unaffected and the cytosolic ERK functions, e.g. the anti-apoptotic effect, would thus persist. In addition, we discovered that Myc-ERK2309-357 inhibits proliferation of the tumor cells significantly better compared to the MEK inhibitors U0126 and PD98059 and compared to the EGFR antibody Cetuximab.

Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden. / The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) have a central role in cardiac hypertrophy and cell survival. Hypertrophic stimuli activate ERK1/2, trigger ERK dimerization and subsequently ERKT188-autophosphorylation. This newly discovered autophosphorylation is a prerequisite for nuclear ERK1/2 translocation and leads to the development of pathological cardiac hypertrophy. As the ERK dimer interface is a potential target to selectively interfere with nuclear ERK1/2 signaling, we investigated whether the interference with ERK dimerization may serve as a therapeutic strategy to prevent pathological cardiac hypertrophy. For this, we generated ERK2 mutants and peptide constructs that interfere with ERK dimerization. These constructs were evaluated in various cell types by their effects on nuclear ERK translocation and dimerization by fluorescence microcopy, co-immunoprecipitation and Duolink proximity ligation assays. We showed that the peptides indeed prevented ERK-ERK interaction in response to phenylephrine and/or carbachol stimulation. In addition, the peptides prevented ERKT188-phosphorylation and interfered with all ERK1/2 effects that are associated with ERKT188-phosphorylation e.g. nuclear ERK translocation and cardiomyocyte hypertrophy. Interestingly, the peptide did not inhibit the general activation of ERK1/2. These data indicate that the ERK dimer interface is a valuable target for selective inhibition of nuclear ERK1/2 signaling, that is able to effectively attenuate ERK1/2 mediated cardiomyocyte growth but without impairing cell survival.

Biotic stresses such as infection by bacteria negatively affect plant growth and pose a severe threat to human food production. Improving our understanding of the immune systems of plants should help ensure food supplies in the years ahead. Bacterial infections induce Pattern-Triggered Immunity (PTI), a process in which plants perceive bacterial molecules and trigger an immune response. Mitogen- Activated Protein Kinase (MAPK) cascades are key players in this immunity process. Since the MAP Kinases (MPKs) 3/4/6 are mainly responsible for flg22- dependent phosphorylation events, we sought to find out how oxidation of MPK4 affects its ability to respond to stresses. Previous studies have shown varying kinase activity of MPK4 upon oxidation. Therefore, this project aims to provide an insight into the oxidative defense signaling mechanism of A. thaliana by investigating the role of MPK4 Cysteine181 in vitro and in vivo. Analysis of oxidation-mimicking as well as oxidation-dead mutants gave first hints that Cysteine181, which is located in the MPK4 substrate binding pocket, is a highly important regulatory residue of oxidative stress signaling by affecting MPK4 kinase activity and the activation of MPK3 and MPK6. Binding studies revealed that those events are due to sterical hindrance within the binding pocket of MPK4 and the blockage of upstream activator binding. The second part of this study characterizes compositional and post-translational changes of plant ribosomes during pathogen infection. Ribosomal proteins selectively participate in the formation of polysomes under different environmental and developmental conditions. However, the function of these changes still remains elusive. The current research project attempts to understand the plant ribosomal changes that occur upon exposure to bacterial pathogens. To observe ribosomal changes, A. thaliana plants were treated with a pathogen associated molecular pattern (PAMP), flg22. Mass spectrometric analysis identified quantitative changes of PAMP-induced ribosomal proteins in polysomes as well as changes in post-translational modifications. Spatial simulations of ribosomes revealed specific regions within the ribosomes to be PTI specific. This study demonstrates that MPK6 contributes to modification of P-stalk composition and phosphorylation status. The MPK6 mediated modifications may affect translation and in combination indicate a mechanism of PTI-related translational control.

Le génome des mammifères contient deux gènes ERK/MAP kinase kinase, soient Mek1 (Map2k1) et Mek2 (Map2k2), qui codent pour des enzymes responsables de l’activation de ERK1/2. Chez la souris, la perte de fonction de Mek1 engendre une mortalité embryonnaire, tandis que les mutants Mek2 survivent sans aucun phénotype apparent. Afin d’élucider les fonctions potentielles associées à MEK2 durant l’embryogenèse, la perte de Mek2 a été étudiée en présence d’une haplo-insuffisance de Mek1. La majorité des embryons Mek1+/-Mek2+/- meurent durant la gestation due à des défauts placentaires affectant les tissus extraembryonnaires. Ainsi, bien que Mek1 joue un rôle prédominant, ces résultats mettre en lumière l’implication de Mek2 durant le développement du placenta. La caractérisation histologique des placentas Mek1+/-Mek2+/- a révélé une diminution de la vascularisation et la formation aberrante de cellules trophoblastiques géantes multinucléées (MTG). Des expériences génétiques de traçage cellulaire in vivo ont démontré que les cellules MTG dérivent d’une différenciation aberrante des SynT-II et que leur formation découle en partie d’un effet cellule autonome. Un second objectif de cette thèse était de mieux caractériser le ou les types cellulaires nécessitant une activation de la voie ERK/MAPK essentielle au développement placentaire. Des analyses génétiques et histologiques ont démontré que la formation des cellules MTG résulte d’une fusion ectopique entre les deux couches de SynT qui participent normalement de façon indépendante à la barrière hématoplacentaire. La barrière hématoplacentaire est constituée d’une double couche de SynT et de cellules dérivées de l’allantoïs, soient les cellules endothéliales et leurs péricytes. La délétion d’un allèle supplémentaire de Mek1 dans l’allantoïs des mutants Mek1+/-Mek2+/- augmente la pénétrance et l’expressivité du phénotype placentaire. De plus, les expériences d’ablation cellulaire in vivo ont permis de démontrer que le développement des SynT-I en une fine couche de cellules multinucléées dépend de la présence de la deuxième couche de SynT. Finalement, par approche de gènes candidats et par analyse de biopuces dans les placentas mutants Mek1Mek2, nous avons montré une expression dérégulée de cibles potentielles de ERK1/2 impliquées dans la déterination, la polarité et la fusion cellulaire, ce qui contribue à la compréhension du phénotype observé. / The mammalian genome contains two ERK/MAP kinase kinase genes, Mek1 and Mek2, which encode dual-specificity kinases responsible for ERK/MAP kinase activation. In the mouse, the loss of Mek1 function causes embryonic lethality, whereas Mek2 mutants survive with a normal lifespan, suggesting that Mek1 rescues the lack of Mek2 function. The first objective of my thesis was to clarify potential functions of Mek2 during mouse embryogenesis. To do, I have analyzed the loss of Mek2 function in the presence of Mek1 haploinsufficiency. Most Mek1+/-Mek2+/- embryos die during gestation from placenta defects affecting extra-embryonic tissues. Thus, even though Mek1 plays a predominant role, these results enlightened the function of Mek2 in placenta development. The histological characterization of Mek1+/-Mek2+/- placentas revealed a diminution of the vascularization and an aberrant formation of multinucleated trophoblast giant (MTG) cells. Genetic experiments on the SynT-II cellular lineage in vivo demonstrated that MTG cells derive from the aberrant SynT-II differentiation and that their formation results from a cell-autonomous effect. The second objective of my thesis was to determine in which cell types the ERK/MAPK activation is essential for placenta development. Genetic analyses combined with histological studies revealed that MTG formation resulted from the ectopic fusion between both layers of SynT, which normally participate in an independent way in the blood-placental barrier. The blood-placental barrier is constituted of a double layer of SynT and by the cells derived from the allantois, the endothelial cells and their perycites. The deletion of both Mek1 alleles in allantois-derived tissues in a Mek1+/-Mek2+/- placenta environment increases the penetrance and the expressivity of the MTG phenotype. These results demonstrate the role of the ERK/MAPK pathway in defined embryonic and extraembryonic cell populations for correct placenta formation. Using mouse genetics, we also demonstrated that the normal development of syncytiotrophoblasts type I into a thin layer of multinucleated cells depends on the presence of the syncytiotrophoblasts type II. Finally, the combined mutations of Mek1 and Mek2 genes alter the expression of several genes involved in cell fate specification, cell fusion and cell polarity that likely explain the underdeveloped placenta and the MTG phenotype seen in Mek1Mek2 mutants.

Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2004. / Vita. Bibliography: 118-130.

L'intégrité de paroi cellulaire est cruciale pour la survie du champignon pendant son cycle de développement ou en réaction à des conditions de stress. Chez la levure, les voies de signalisation de MAP kinase, Slt2, et calcineurin, régulent la réparation de paroi cellulaire. MPS1, l'orthologue de SLT2, chez Magnaporthe grisea est essentiel pour la réparation de la paroi cellulaire et pour la pénétration de l'appressorium (Xu, et al., 1998). Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6, alors que le calcineurin active Crz1. Par ailleurs, PaIdc1 a un rôle dans la localisation nucléaire de PaMpk1 (orthologue de Slt2 et Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, et al., 2007). MgIDC1, Le gène orthologue de PaIDC1 a été, de même, identifié chez M. grisea. ScAGS1 (α-glucan synthase), est un composant principal de la paroi principal des champignons. CaCAS5, est un régulateur transcriptionel, régule plusieurs gènes de la paroi cellulaire et ScKnr4 est impliqué dans la régulation de l'activité de 1,3--glucan synthase et la formation de la paroi cellulaire Ces gènes ont été identifiés chez M. grisea et des mutants de délétion ont été construits par le remplacement de gène chez M. grisea. Les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δidc1 montrent une forte réduction de mycélium aérien. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δswi4 ont une très forte réduction de sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 et Guy11ΔKU80Δcrz1 ont une forte réduction de pouvoir pathogène. De plus, les mutants Guy11ΔKU80Δmps1 et Guy11ΔKU80Δswi4 sont inhibé, de 100% en présence d'un mélange de l'Aculéacine et Nikkomycine à faible dose (DI20). Les résultats montrent que chez M. grisea, il existe deux voies impliquées dans l'intégrité de la paroi cellulaire. La voie MAPK MPS1, qui régule les facteurs de transcription Rlm1, Swi4, Swi6 et la voie de Calcineurine, qui régule Crz1. D'après les analyses, SWI4 est impliquée dans la régulation des gènes de glucan synthases et chitine synthase, quand RLM1 n'est impliqué que dans la régulation des gènes de chitine synthase. Dans la voie de Calcineurine, CRZ1 contrôle les gènes de chitine synthase aussi. Ces études suggèrent que les facteurs de transcription qui sont régulés par Mps1 et Calcineurine sont spécialisés dans la régulation des gènes de cible spécifiques à l'intégrité et la réparation de la paroi cellulaire. / The cell wall integrity is crucial for the survival of fungi during its development or in reaction in stress conditions. In yeast, the MAP kinase pathway Slt2, and the calcineurin pathway are responsible of the cell wall repair. MPS1, the orthologous of SLT2, in Magnaporthe grisea is essential for the repair of the cell wall and the penetration of the appressorium (Xu, and Al, 1998). In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6, whereas the calcineurin activates Crz1. In addition, PaIdc1 has a role in the nuclear localization of PaMpk1 (orthologous of Slt2 and Mps1). (Corinne Jamet-Vierny, and Al, 2007), in Podospora anserina. MgIDC1, the gene orthologous of PaIDC1 , likewise, was identified in M. grisea. ScAGS1 (α- glucan synthase), is the principal component of the wall of fungi. CaCAS5, is a transcriptional regulator, controls several genes of the cell wall and ScKnr4 is implied in the regulation of the activity of 1,3-- glucan synthase and the formation of the cell wall These genes was identified at M. grisea and deletion mutants were obtained by the gene replacement in M. grisea. Mutants Guy11ΔKU80Δmps1 and Guy11ΔKU80Δidc1 show a strong reduction of mycelium. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 and Guy11ΔKU80Δswi4 have a very strong reduction of sporulation. Guy11ΔKU80Δmps1, Guy11ΔKU80Δrlm1 and Guy11ΔKU80Δcrz1 have a strong reduction of pathogenicity. Moreover, mutants Guy11ΔKU80Δmps1 and Guy11ΔKU80Δswi4 are 100% inhibited, in presence of a mixture of Aculéacine and Nikkomycine with low dose (DI20). The results show that in M. grisea, there are two pathways implied in the cell wall integrity. The MAPK pathway Mps1, which controls the tr anscription factors Rlm1, Swi4, Swi6 and the calcineurin pathway, which controls the transcription factor, Crz1. According to this study, SWI4 is implied in the regulation of glucan synthases and chitin synthase genes, when RLM1 is implied only in the regulation of chitin synthase genes. In the calcineurin pathway, CRZ1 controls chitin synthase genes. These studies suggest that the factors of transcription which are controlled by Mps1 and Calcineurin are specialized in the regulation of target genes, specific to the cell wall integrity and cell wall repair.

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Embargoed. Vita. Bibliography: 133-159.

La voie KRAS/BRAF/MEK/ERK MAP Kinase joue un rôle clé dans le contrôle de la prolifération des cellules épithéliales intestinales normales et cancéreuses. En effet, on retrouve des mutations du gène KRAS dans près de 35 à 40% des cancers colorectaux et une mutation du gène BRAF dans 10 à 15% des cas. Ces mutations de type gain-de-fonction sont mutuellement exclusives, ce qui suggère que la signalisation MEK/ERK qui est en aval de BRAF joue possiblement un rôle crucial dans le développement de plus de 60% des cancers colorectaux. Notre laboratoire a d’ailleurs rapporté que l’expression d’une forme mutante hyperactive de MEK1 est suffisante pour induire la transformation des cellules épithéliales intestinales normales en culture. Cette transformation est caractérisée par une transition épithélium-mésenchyme (EMT) conférant aux cellules des capacités tumorales, invasives et métastatiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les effets transformant de MEK1, une analyse comparative par micropuces d’ADN (Affymetrix) a été effectuée et celle-ci a montré que le gène codant pour la protéine CDK8, une kinase dépendante des cyclines, est un des gènes les plus induits (12 fois) par l’hyperactivation de MEK1. Ce résultat suggèrerait l’implication de CDK8 dans l’oncogenèse colorectale induite par l’hyperactivation de la voie KRAS/MAP Kinase. De manière intéressante, nous avons d’abord mis en évidence que CDK8 était surexprimée dans des tumeurs de patients atteints de cancer colorectal de différents stades ainsi que dans des lignées cancéreuses colorectales humaines. Parmi ces lignées cellulaires analysées, nous avons mis en évidence que cette surexpression était en partie dépendante de l’activité MEK. Nous avons aussi confirmé la surexpression de CDK8 dans des lignées de cellules épithéliales intestinales de rat exprimant les oncogènes KRAS ou BRAF ou le mutant de MEK1 constitutivement actif. La baisse d’expression de CDK8 par l’utilisation d’un shARN a révélé que CDK8 contribue à l’hyperprolifération cellulaire ainsi qu’à la croissance en indépendance d’ancrage induite par l’expression du mutant hyperactif de MEK1. De plus, la baisse d’expression de CDK8 atténue le phénotype fibroblastique des cellules transformées par l’oncogène BRAF ou le mutant de MEK1 constitutivement actif, qui exhibent un phénotype plus épithélial. Nous avons pu mettre en évidence que CDK8 serait impliqué dans l’expression de gènes liés à la morphologie cellulaire tel que Snail1, Snail2 et Gem. Nos résultats montrent donc que CDK8 contribue au potentiel oncogénique de la voie MAP Kinase dans les cellules épithéliales intestinales en modulant leurs capacités prolifératives et leur transformation morphologique.