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La voie ERK/MAPK est impliquée dans plusieurs processus biologiques dont la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose et la migration. Les protéines kinases MEK1 et MEK2 sont les seuls activateurs connus d'ERKl et ERK2. Les mutations inactivant les gènes Mekl et Mek2 ont été développées chez la souris pour étudier les fonctions des ces deux activateurs lors du développement embryonnaire. L'analyse phénotypique des mutants Mekl" montre une diminution de la prolifération et une augmentation de l'apoptose des populations trophoblastiques. Les embryons Mekïf~ meurent à mi-gestation d'une sous-vascularisation du labyrinthe placentaire qui normalement permet les échanges gazeux et nutritiormels foeto-maternels. Des analyses histologiques suggèrent également un problème de migration lors des processus d'invagination du réseau vasculaire. Ces résultats montrent que MEK1 est impliqué spécifiquement dans certaines fonctions des trophoblastes et que son absence induit une dysmorphogénèse létale du placenta murin. Pour étudier l'implication spécifique de MEK1 dans ces populations trophoblastiques, des modèles cellulaires ont été établis.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / L'angiogenèse et la formation de métastases sont des évènements clés dans le développement du cancer, de sa prolifération et de sa dissémination. Ces évènements sont contrôlés principalement par différents facteurs de croissance et par l' adhésion cellulaire. Pour comprendre les bases moléculaires du cancer, il est impératif de comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux facteurs de croissance et les mécanismes d'adhésion. Les kinases de la famille PAK (p21 Activated Kinase) et de la famille MLK (Mixed Lineage Kinase) régulent l'adhésion, la migration, la morphologie et la division cellulaire. Les travaux du laboratoire du Dr Moss ont démontré la nécessité de xP AKI dans la migration des cellules de la crête neurale et dans l'adhésion des blastomères d'embryons précoces. D' autre part, xMLK2 fut montrée comme étant essentielle à la formation du pronéphros. Donc, pour déterminer les mécanismes moléculaires modulés par xP AKI et xMLK2 chez Xenopus, j'ai identifié et caractérisé de nouveaux partenaires de ces kinases. Pour les interacteurs de P AK, mes travaux se sont concentrés sur le clone N 126 codant pour une protéine apparentée aux synaptotagmines, nommé E-Syt2 (Extended Synaptotagmin 2). Mes travaux ont identifié E-Syt2 comme inhibant l' activation de PAKI par Cdc42 et Rac. Cette inhibition entraîne la dépolymérisation de l' actine corticale. Nos études ont également identifié E-Syt2 comme un adaptateur endocytique pour le récepteur activé du FGF (FGFRl) et un régulateur de la voie de signalisation FGF. En effet, E-Syt2 interagit avec le FGFRI activé et avec l' adaptateur endocytique de la voie clathrine AP-2. Par ces interactions, elle gouverne l' internalisation et la signalisation émanant du FGFRl. De ce fait, mes études ont identifié une nouvelle protéine contrôlant l'activité de P AK 1, la stabilité de l' actine et la signalisation induite par les facteurs de croissance; elle représente donc une cible intéressante pour des thérapies contre le cancer. Mes travaux sur xMLK2 ont identifié un régulateur négatif de cette protéine, appelé ube2d3.2. Cette protéine fait partie de la famille des enzymes de conjugaison à l' ubiquitine (E2) et est co-exprimée avec xMLK2 dans le pronéphros où elle régule le niveau protéique de xMLK2 par ubiquitinylation. Puisque xMLK2 est requise pour la formation d' épithéliums provenant de tissus mésenchymateux, sa régulation négative par une E2 est importante pour les mécanismes contrôlant la transition épithélium-mésenchyme.

Les inhibiteurs des histones désacétylase (HDACi) constituent une classe prometteuse de médicaments anticancéreux. Ils peuvent déclencher la voie apoptotique et sont proposés pour le traitement des désordres hématologiques. Cependant, les HDACi qui ciblent les HDAC de classe II, tel que le vorinostat, sont également des agents réactivateurs potentiels de l’EBV, un virus qui infecte de manière latente plus de 90% de la population adulte dans le monde et est associée à de nombreux lymphomes de type B. L’étude de la commutation entre le cycle latent et le cycle lytique de l’EBV est essentielle pour appréhender l’impact des HDACi lors du!traitement des lymphomes B associés à l’EBV (risque du relargage de virions en grande quantité lors des traitements chimio thérapeutiques).Notre étude a porté sur l'effet de vorinostat (25 μM pendant 48h) sur des cellules tumorales B infectées par l’EBV : trois lignées de lymphomes de burkitt (BL2B95.8, BL41B95.8 et P3HR1), trois lignées lymphoblastoides (1602, PRI et RUD) et la lignée B95.8 de marmouset en cycle lytique de l’EBV (contrôle positif). Nous avons mis en évidence que le vorinostat peut induire la réactivation de l’EBV (P3HR1 et B95.8) ou à l’apoptose (BL41B95.8, BL2B95.8, 1602, PRI et RUD) avec une inhibition mutuelle de ces deux processus. Au niveau moléculaire, nous avons pu montrer que le vorinostat active constitutivement et simultanément le facteur de transcription initiateur de la réactivation MEF2D (par déphosphorylation) et la MAP kinase pro-apototique p38 (par phosphorylation) suite à la diminution de l’expression de la MAP kinase phosphatase (MPK1) dont p38 est un substrat. Le pré-traitement avec un inhibiteur de p38 (SB203580) a mis en évidence que cette MAP kinase est à la fois impliquée dans les processus de réactivation de l’EBV et d’’apoptose. Cependant, les lignées cellulaires pour lesquelles l'activation de p38 augmente fortement lors du traitement par le vorinostat, entrent directement en apoptose, sans qu’il puisse y avoir réactivation de l’EBV.Nos résultats suggèrent que le niveau d’activation de la MAP kinase p38 permet de réguler la balance réactivation/apoptose des cellules B infectées par l’EBV lorsqu’elles sont soumises à un agent inducteur de la réactivation, en particulier dans le cas de cellules de lymphomes B traitées par le vorinostat. Ils posent la question de l’utilisation des HDACi lors du traitement des lymphomes associés à l'EBV, avec le risque d’une réactivation virale selon le niveau d’activation intracellulaire de p38 et la nécessité d’utiliser simultanément un anti-viral tel que le ganciclovir. / Histone deacetylase inhibitors (HDAC) are a promising class of anticancer drugs. They can trigger the apoptotic pathway and are available for treatment of blood disorders. However, the HDACi that target HDAC class II, as vorinostat, also are potential reactivators agents of EBV, a virus that infects latently over 90% of the adult population worldwide and is associated with many type B lymphomas the study of switching between the latent cycle and the lytic cycle of EBV is essential to understand the impact of HDACi when treating B-cell lymphoma associated with EBV (salting risk virions in large quantities during the chemotherapeutic treatment).Our study focused on the effect of vorinostat (25 .mu.M for 48) on tumor B cells infected with EBV: three lines of Burkitt lymphoma (BL2B95.8, BL41B95.8 and P3HR1), three lymphoblastoid cell lines (1602 PRI and RUD) and B95.8 marmoset line in the lytic cycle of the EBV (positive control). We have demonstrated that vorinostat can induce EBV reactivation (P3HR1 and B95.8) or apoptosis (BL41B95.8, BL2B95.8, 1602, PRI and RUD) with a mutual inhibition of these two process. At the molecular level, we have shown that the active vorinostat constitutively and simultaneously initiating transcription factor reactivation MEF2D (by dephosphorylation) and MAP kinase p38 pro-apototique (phosphorylation) following the reduction in the expression of the MAP kinase phosphatase (MPK1) p38 which is a substrate. The pre-treatment with a p38 inhibitor (SB203580) showed that MAP kinase is both involved in the process of EBV reactivation and apoptosis. However, cell lines where p38 activation greatly increases during treatment with vorinostat, come directly into apoptosis, without there may EBV reactivation.Our results suggest that the level of activation of p38 MAP kinase helps regulate the balance reactivation / apoptosis of B cell EBV infected when exposed to an inducing agent for the reactivation, in particular in the case of cells B lymphoma treated with vorinostat. They raise the question of the use of HDACi in the treatment of lymphomas associated with EBV, with the risk of viral reactivation by level of intracellular activation of p38 and the need to simultaneously use an antiviral such as ganciclovir.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2006. / Includes vita. Includes bibliographical references (leaves 166-187). Also available online.

Nous avons étudié la voie MAPK Mps1/Slt2 du champignon pathogène du riz Magnaporthe Oryzae. Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6. Nous avons identifié le gène orthologue de ScSWI4 chez M. oryzae et étudié les rôles de Mps1, Rlm1, Swi4 et Swi6 en comparant les phénotypes de leurs mutants nuls. Δmps1, Δswi4, Δswi6 ont le même défaut de mélanisation, tandis que Δmps1 et Δrlm1 sont déficients pour la sporulation. L'absence d'hyphes aériens et d'hydrophobicité du mycélium sont des phénotypes spécifiques de Δmps1, tandis qu'une réduction de croissance est associée spécifiquement à Δswi4 et Δswi6. Aucun de ces mutants ne présente une hypersensibilité aux enzymes de dégradation de la paroi (EDPs) et aux inhibiteurs de la paroi (aculeacine A, nikkomycin Z, calcofluor white : CFW). La pathogénie de Δswi4 est réduite, tandis que celle de Δswi6 est similaire à la souche sauvage. Δmps1 et Δrlm1 sont non pathogènes. La transcriptomique comparative de la souche sauvage, Δmps1, Δrlm1 et Δswi4 montre qu'il n'existe qu'un petit nombre de gènes sur- ou sous- exprimés chez ces mutants, le nombre maximal étant observée entre Δmps1 et Δswi4. Le gène AGS1 encodant l'alpha-1, 3-glucane synthase, une cible supposée de Mps1, n'est ni sur- ni sous-exprimé chez ces mutants. La souche sauvage et Δmps1 ont la même sensibilité aux EDPs et au CFW à pH6. Cependant, à pH5, la souche sauvage devient résistante aux EDPs et au CFW à pH6. Cependant, à pH5, la souche sauvage devient résistante aux EDPs et au CFW, tandis que Δmps1 perd cette résistance, suggérant qu'elle nécessite Mps1. Notre étude montre que la voie MAPK Mps1 joue un rôle important dans plusieurs processus biologiques de M. oryzae et précise quels sont les cibles / We have studied the Mps1/Slt2 MAPK signalling pathway in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6. We have identified the M. oryzae gene orthologous to ScSWI4 and studied the roles of Mps1, Rlm1, Swi4 and Swi6 in M. oryzae by comparing the phenotypes of their null mutants. Δmps1, Δswi4, Δswi6 displayed the same defects in melanisation, while Δmps1 and Δrlm1 are defective in sporulation. Loss of aerial hyphae formation and mycelium hydrophobicity are phenotypes specific of Δmps1, while reduced growth is a specific phenotype of Δswi4 and Δswi6. None of these mutants displayed an increased sensitivity against cell wall degrading enzymes (CWDEs) and cell wall inhibitors (aculeacine A, nikkomycin Z, calcofluor white : CFW). Pathogenicity was reduced in Δswi4, while Δswi6 was as pathogenic as WT. Δmps1 and Δrlm1 were non-pathogenic. Comparative transcriptomic of WT, Δmps1, Δrlm1 and Δswi4 highlighted only a limited number of genes up- and down-regulated in these mutants, with the largest number observed between Δmps1 and Δswi4. The alpha-1,3-glucan synthase encoding gene AGS1, a suggested Mps1 target, was not up- nor down-regulated in these mutants. WT and Δmps1 have a similar sensitivity to CWDE and CFW at pH6. However, at pH5, WT displays a resistance to CWDEs and CFW, while Δmps1 loses this pH5 induced resistance, suggesting it requires the Mps1 pathway. This work shows that Mps1 MAPK pathway has an important role in different M. oryzae biological processes and provides new insights on its transcriptional targets

Platelet-derived growth factor (PDGF) is a family of signaling molecules that stimulates cell growth, survival and migration. PDGF is recognized by specific transmembrane proteins, the PDGF receptors, which relay the signals to the cell activating the Mitogen-activated protein (MAP) kinases and other signaling pathways. Aberrant activation of these pathways is frequently detected in cancer. Hence, the study of these processes is essential for identifying potential drug targets or diagnostic markers. In paper I, we identified Receptor Subfamily 4 Group A Member 1 NR4A1 to be regulated by PDGF via MAP kinases, clarifying the role of Extracellular signal–regulated kinases (Erk) 1/2, Erk5 and Nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) in its regulation. NR4A1 was found to be important for the tumorigenic potential, measured as anchorage-independent growth, of glioblastoma cells. Since the cellular responses elicited by PDGF result from the balance between phosphorylation and dephosphorylation events, we investigated the role of the dual specificity phosphatases DUSP4/MKP-2 and DUSP6/MKP-3. In paper II, we describe the crucial role of Erk1/2 and p53 in the expression of DUSP4/MKP2. Moreover, we observed that DUSP4/MKP-2 downregulation decreases Erk5 activation and accelerates PDGFRβ internalization and downregulation resulting in a specific inhibition of Signal transducers and activators of transcription (Stat) 3, Src and protein kinase C (PKC), and partially of p38, Stat1/5 and Phoshoplipase Cγ (PLCγ). In paper III, we report that DUSP6/MKP-3 creates a negative cross-talk between Erk1/2 and Erk5 and an auto-inhibitory feedback loop on the PI3-kinase/Akt pathway. In paper IV, we identify a new regulative mechanism of the PDGF pathway. PDGF induces Erk5 expression and activation that modulates the PDGFRβ activity. After Erk5 downregulation, the receptor undergoes to a faster and stronger activation that results in a faster internalization and degradation. In conclusion, we present a mechanism through which the PDGF/MAP kinases support tumor growth, and elucidate different regulatory pathways involved in PDGF signaling.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Echinococcus multilocularis verursacht die Alveoläre Echinokokkose (AE), eine lebendsbedrohliche Krankheit mit limitierten chemotherapeutischen Möglichkeiten. Die jetzige Anti-AE Chemotherapie basiert auf einer einzigen Wirkstoffklasse, den Benzimidazolen. Obwohl Benzimidazole in vitro parasitozid wirken, wirken sie in vivo bei AE-Behandlung lediglich parasitostatisch und rufen schwere Nebenwirkungen hervor. In Fällen operabler Läsionen erfordert die Resektion des Parasitengewebes über einen längeren Zeitraum eine chemotherapeutische Unterstützung. Damit sind die jetzigen Behandlungsmöglichkeiten inadäquat und benötigen Alternativen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Signalwege von Plattwürmern analysiert, um potentielle Targets für neue therapeutische Ansätze zu identifizieren. Dabei konzentrierte ich mich unter Anwendung von molekularbiologischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden auf Faktoren, die an Entwicklung und Proliferation von E. multilocularis beteiligt sind. Darunter waren die drei MAP kinases des Parasiten EmMPK1, ein Erk1/2-Ortholog, EmMPK2, ein p38-Ortholog und EmMPK3, ein Erk7/8-Ortholog. Des Weiteren identifizierte und charakterisierte ich EmMKK2, ein MEK1/2-Ortholog des Parasiten, welches zusammen mit den bekannten Kinasen EmRaf und EmMPK1 ein Erk1/2-ähnliches MAPK Modul bildet. Ich konnte zudem verschiedene Einflüsse von Wirtswachstumsfaktoren wie EGF (epidermal growth factor) und Insulin auf die Signalmechanismen des Parasiten und das Larvenwachstum zeigen, darunter die Phosphorylierung von Elp, ein Ezrin-Radixin-Moesin ähnliches Protein, die Aktivierung von EmMPK1 und EmMPK3 und eine gesteigerte mitotische Aktivität der Echinokokkenzellen. Zusätzlich wurden verschiedene Substanzen auf ihre letale Wirkung auf den Parasiten untersucht, darunter befanden sich (1.) generelle Inhibitoren von Tyrosinkinasen (PP2, Leflunamid), (2.) gegen die Aktivität von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen gerichtete Präparate, (3.) ursprünglich anti-neoplastische Wirkstoffe wie Miltefosin und Perifosin, (4.) Inhibitoren von Serin/ Threonin-Kinasen, die die Erk1/2 MAPK Kaskade blockieren und (5.) Inhibitoren der p38 MAPK. In diesen Untersuchungen hat sich EmMPK2 aus den folgenden Gründen als vielversprechendes Target erwiesen. Aminosäuresequenz-Analysen offenbarten einige Unterschiede zu menschlichen p38 MAP Kinasen, welche sehr wahrscheinlich die beobachtete gesteigerte basale Aktivität des rekombinanten EmMPK2 verursachen, verglichen mit der Aktivität humaner p38 MAPK-α. Zusätzlich suggerieren die prominente Autophosphorylierungsaktivität von rekombinantem EmMPK2 und das Ausbleiben einer Interaktion mit den Echinococcus MKKs einen unterschiedlichen Regulierungsmechanismus im Vergleich zu den humanen Proteinen. Die Aktivität von EmMPK2 konnte sowohl in vitro als auch in kultivierten Metazestodenvesikeln durch die Behandlung mit SB202190 und ML3403, zwei ATP kompetitiven Pyridinylimidazolinhibitoren der p38 MAPK, in Konzentrations-abhängiger Weise inhibiert werden. Zudem verursachten beide Substanzen, insbesondere ML3403 die Inaktivierung von Parasitenvesikeln bei Konzentrationen, die kultivierte Säugerzellen nicht beeinträchtigten. Ebenso verhinderte die Anwesenheit von ML3403 die Generation von neuen Vesikeln während der Kultivierung von Echinococcus Primärzellen. Das Targeting von Mitgliedern des EGF-Signalwegs, insbesondere der Erk1/2-ähnlichen MAPK Kaskade mit Raf- und MEK- Inhibitoren verhinderte die Phosphorylierung von EmMPK1 in in vitro kultivierten Metazestoden. Obwohl das Parasitenwachstum unter diesen Konditionen verhindert wurde, blieb die strukturelle Integrität der Metazestodenvesikeln während der Langzeitkultivierung in Anwesenheit der MAPK Kaskade-Inhibitoren erhalten. Ähnliche Effekte wurden beobachtet nach Behandlung mit den anderen zuvor aufgeführten Inhibitoren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass verschiedene Targets identifiziert werden konnten, die hoch sensibel auf die Anwesenheit der inhibitorischen Substanzen reagierten, aber nicht zum Absterben des Parasiten führten, mit Ausnahme der Pyridinylimidazolen. Die vorliegenden Daten zeigen, dass EmMPK2 ein Überlebendsignal vermittelnden Faktor darstellt und dessen Inhibierung zur Behandlung der AE benutzt werden könnte. Dabei erwiesen sich p38 MAPK Inhibitoren der Pyridinylimidazolklasse als potentielle neue Substanzklasse gegen Echinokokken. / Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a life-threatening disease with limited options of chemotherapeutic treatment. Anti-AE chemotherapy is currently based on a single class of drugs, the benzimidazoles. Although acting parasitocidic in vitro, benzimidazoles are merely parasitostatic during in vivo treatment of AE and cause severe site effects. In the case of operable lesions, the resection of parasite tissue needs to be supported by a prolonged chemotherapy. Thus, the current treatment options for AE are inadequate and require alternatives. In the present work, the flatworm signaling pathways were analyzed to establish potential targets for novel therapeutic approaches. I focused on factors that are involved in development and proliferation of E. multilocularis using molecular, biochemical and cell biological methods. Among the analysed factors were three MAP kinases of the parasite, EmMPK1, an Erk-1/2 orthologue, EmMPK2, a p38 orthologue and EmMPK3, an Erk7/8 orthologue. Further, I identified and characterized EmMKK2, a MEK1/2 orthologue of the parasite, which, together with the known kinases EmRaf and EmMPK1, forms an Erk1/2-like MAPK module. Moreover, I was able to demonstrate several influences of host growth factors such as EGF (epidermal growth factor) and insulin on worm signaling mechanisms and larval growth, including the phosphorylation of Elp, an ezrin-radixin-moesin like protein, EmMPK1, EmMPK3 and increased mitotic activity of Echinococcus cells. In addition, several substances were examined for their efficacy against the parasite including (i) general tyrosine kinase inhibitors (PP2, leflunamide), (ii) compounds designed to inhibit the activity of receptor tyrosine kinases, (iii) anti-neoplastic agents (miltefosine, perifosine), (iv) serine/threonine kinase inhibitors that have been designed to block the Erk1/2 MAPK cascade and (v) inhibitors of p38 MAPKs. In these studies, EmMPK2 proved to be a promising drug target for the following reasons. Amino acid sequence analysis disclosed several differences to human p38 MAPKs, which is likely to be the reason for the observed enhanced basal activity of recombinant EmMPK2 towards myelin basic protein in comparison to human recombinant p38 MAPK-α. In addition, the prominent auto-phosphorylation activity of the recombinant EmMPK2 protein together with the absence of an interaction with the Echinococcus MKKs suggest a different mechanism of regulation compared to the human enzyme. EmMPK2 activity could be effectively inhibited in vitro and in cultivated metacestode vesicles by treatment with SB202190 and ML3403, two ATP-competitive pyridinyl imidazole inhibitors of p38 MAPKs, in a concentration-dependent manner. Moreover, both compounds, in particular ML3403, caused parasite vesicle inactivation at concentrations which did not affect cultured mammalian cells. Likewise, during the cultivation of Echinococcus primary cells, the presence of ML3403 prevented the generation of new vesicles. Targeting members of the EGF signaling pathway, particulary of the Erk1/2-like MAPK cascade, with Raf and MEK inhibitors prevented the phosphorylation of EmMPK1 in metacestodes cultivated in vitro. However, although parasite growth was prevented under these conditions, the structural integrity of the metacestode vesicles maintained during long-term cultivation in the presence of the MAPK cascade inhibitors. Similar results were obtained when studying the effects of other drugs mentioned above. Taken together, several targets could be identified that reacted with high sensitivity to the presence of inhibitory substances, but did not cause the parasite’s death with one exception, the pyridinyl imidazoles. Based on the presented data, I suggest pyridinyl imidazoles as a novel class of anti-Echinococcus drugs and imply EmMPK2 as survival signal mediating factor, the inhibition of which could be used for the treatment of AE.

Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken. / Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis.