Herzinsuffizienz ist ein weltweites Gesundheitsproblem mit hoher Morbidität und Mortalität und immer noch schlechter Prognose. Ein charakteristisches Merkmal der molekularen und damit verbundenen strukturellen Veränderungen, die der terminalen Insuffizienz vorangehen ist die durch Desensitivierungsmechanismen vermittelte Abnahme des beta-adrenergen (β-AR) Signalmoleküls zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) auf der einen Seite und der gleichzeitigen Zunahme des von natriuretischen Peptiden (NP) und Stickstoffmonoxid (NO) generierten zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP) auf der anderen Seite. Während hohe cAMP-Spiegel im Herzen als schädlich gelten, werden cGMP-abhängige Signalkaskaden vorwiegend als protektiv verstanden. Amplitude, Lokalisation und Halbwertszeit beider Signalmoleküle werden durch spezifische Enzyme, den Phosphodiesterasen (PDE) reguliert. Unter der PDE-Superfamilie wird die Isoform PDE2 als einzige von cGMP aktiviert, um dann verstärkt cAMP abzubauen und steht damit im Zentrum eines negativen Crosstalks dieser beiden Signalwege. PDE2 ist sowohl in der humanen als auch der experimentellen Herzinsuffizienz hochreguliert und scheint dort am β-AR Desensitivierungsprozess beteiligt zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die pathophysiologische Rolle der PDE2 im Herzen näher charakterisiert. Es wird gezeigt, dass die PDE2 nicht nur in Kardiomyozyten, sondern auch in kardialen Fibroblasten exprimiert wird. In Fibroblasten inhibieren cAMP/cGMP-Signalwege die Transformation von kardialen Fibroblasten (CF) zu Myofibroblasten (MyoCF), einem zellulären Phänotyp, der unter anderem mit der persistenten Fibrotisierung des erkrankten Herzgewebes in Verbindung gebracht wird. In CF führte eine Überexpression von PDE2 zu eine starken Abnahme der basalen und β2-AR-vermittelten cAMP-Synthese und war ausreichend, um in Abwesenheit exogener, pro-fibrotischer Stimuli die Transformation zum MyoCF zu induzieren. In Übereinstimmung zeigten funktionale Analysen mit künstlich hergestelltem Bindegewebe aus PDE2-überexprimierenden CF eine deutliche Zunahme der Gewebssteifigkeit. PDE2 übte keinen Einfluss auf basale oder durch das atriale NP generiertes cGMP aus und reduzierte nur partiell die NO-induzierte cGMP-Akkumulation. Interessanterweise waren beide Stimuli in der Lage, trotz niedriger cAMP-Spiegel die PDE2-induzierte CF-Transformation zum MyoCF zu verhindern und lassen daher eine Redundanz dieser beiden sonst so gegensätzlichen Signalwege vermuten. Zur Untersuchung von PDE2 in Kardiomyozyten wurde ein transgenes (TG) Mausmodell mit spezifischer kardialer Überexpression herangezogen. Die Basalcharakterisierung zeigte eine erniedrigte Herzfrequenz (HR) mit kompensatorisch erhöhter, basaler Kontraktionskraft, sowie eine verminderte Maximalantwort bezüglich der HR nach akuter β-AR Stimulation. Auf molekularer Ebene war dieser Phänotyp mit einer verminderten Phosphorylierung verschiedener β-AR Zielstrukturen wie Troponin I, Phospholamban und Ryanodinrezeptor-2 assoziiert. Langzeitstudien belegten, dass eine Überexpression von PDE2 keine pathologischen Konsequenzen hat, sondern im Gegenteil die durchschnittliche Lebensspanne der Tiere eher verlängerte. Erste Studien im Herzinsuffizienzmodel der transversalen Aortenkonstriktion (TAC) zeigten bisher eine beständig erniedrigte HR und verminderte Wanddicken bei allerdings vergleichbarer Abnahme der kardialen Kontraktionskraft. Trotz der klaren Befunde und neuen Erkenntnisse über die vielfältige Rolle der PDE2 im Herzen lässt sich bisher noch nicht klar belegen, ob eine zusätzliche Aktivierung von myokardialen PDE2 tatsächlich im Sinne einer intrazellulären β-AR-Blockade die Progression zur Herzinsuffizienz verlangsamen oder verhindern könnte. Weitere darauf aufbauende Untersuchungen, wie z.B. eine akut induzierbare Aktivierung bzw. Deaktivierung in experimentellen Herzinsuffizienzmodellen könnten den Weg für die Entwicklung klinisch anwendbarer Ansätze zur therapeutischen Modulation dieser viel versprechenden Zielstruktur ebnen.

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Im Jahr 2015 steht für die Medizinische Fakultät der Universität Leipzig das 600. Gründungsjubiläum im Kalender. 600 Jahre Universitätsmedizin Leipzig bedeuten einen herausragenden Meilenstein in einer spannenden und wechselvollen Fakultätsgeschichte. "Forschen, Lehren, Heilen – aus Tradition für Innovation": In diesem Sinne versteht die Universitätsmedizin ihren Auftrag, exzellente Ergebnisse in Forschung und Lehre und in der klinischen Versorgung von Menschen jeden Alters zu erzielen. Sie gehört heute zu den größten Forschungsstandorten Sachsens.

Während die Chemoarchitektur des Plexus myentericus im Dünn- und Dickdarm verschiedener Tierspezies gut erforscht ist, fehlen für das Pferd aufgrund präparatorischer Probleme solche Daten bisher weitgehend. Als wesentliche Grundlage für die immunhistochemische Analyse erfolgte die Mikrosektion von Häutchenpräparaten des Plexus myentericus aus unterschiedlichen Dünndarmlokalisationen und der Beckenflexur von 15 Pferden. Ein Teil der Proben wurde vor der Fixation mit Kolchizin behandelt, um auch zelluläre Neuropeptidmarkierungen durchführen zu können. Die nachfolgende immunhistochemische Aufarbeitung erfolgte an frei beweglichen Häutchenpräparaten, so dass die chemische Neuroanatomie des Plexus myentericus in dessen natürlicher und flächiger Ausdehnung untersucht werden konnte. Neben der Quantifizierung der myenterischen Neurone sollten cholinerge, nitrerge und calretinin-exprimierende Subpopulationen evaluiert werden. Ferner wurde die Verteilung verschiedener Neuropeptide untersucht. Die Visualisierung der Primärantikörper erfolgte durch indirekte Immunfluoreszenz. Angefertigte Präparate wurden vorrangig mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (Zeiss LSM 510 Meta) ausgewertet. Der eingesetzte pan-neuronale Marker HuC/D führte zu einer reproduzierbaren, offenbar vollständigen Markierung der myenterischen Neurone. In keinem Fall konnte eine durch weitere Antikörper markierte Nervenzelle ohne HuC/D-Immunreaktivität angesprochen werden, was die hervorragende Eignung von HuC/D als pan-neuronaler Marker auch im enterischen Nervensystem des Pferdes verdeutlicht. Die Ganglien im Plexus myentericus zeichneten sich durch eine große Formenvielfalt und durch die Orientierung ihrer Längsachse an der Zirkulärmuskulatur aus. In den untersuchten Dünndarmlokalisationen traten vermehrt kleinere Ganglien auf, während in der Beckenflexur große, fusionierte Ganglien dominierten. Ferner wurde die Neuronendichte bestimmt, die als Neuronenanzahl/ cm² ganglionärer Fläche definiert war. Die Neuronen-dichte zeigte eine konstante Verteilung von 52.000 bis 58.000 Neuronen/ cm² ganglionärer Fläche in den untersuchten Dünndarmabschnitten und 57.000 Neuronen/ cm² ganglionärer Fläche in der Beckenflexur. Die enterische Glia wurde durch Immunmarkierung des sauren Gliafaserproteins GFAP dargestellt. In den ganglionären Bereichen erfolgte neben der Detektion von Gliafasern auch die Visualisierung von Gliazellkörpern, die den Nervenzellen kappenförmig aufsaßen. Eine deutliche Assoziation von Gliafasern mit Gefäßen, die durch Kartoffellektin markiert waren, konnte dagegen nicht beobachtet werden. Die cholinerge Subpopulation im Plexus myentericus, die durch Immunmarkierung der Cholinazetyltransferase (ChAT) erfasst wurde, war in den untersuchten Dünndarm-lokalisationen mit 35 bis 36 % größer als in der Beckenflexur (24 %). Im Gegensatz dazu umfasste die durch Stickoxidsynthase (NOS)-Immunreaktivität detektierte nitrerge Subpopulation in der Beckenflexur 33 %, wobei in den untersuchten Dünndarm-lokalisationen nur zwischen 20 bis 22 % NOS exprimierten. Weiterhin konnte in einigen Neuronen eine Koexpression von ChAT und NOS beobachtet werden. In den untersuchten Dünn- und Dickdarmlokalisationen exprimierten 6 bis 7 % der myenterischen Neurone Calretinin (CR), wobei sie im Allgemeinen mit ChAT kolokalisiert waren. Die CR-markierten Zellen zeigten hauptsächlich eine Dogiel Typ-I-Morphologie und in wenigen Fällen eine Dogiel Typ-II-Morphologie. Während Calcitonin gene-related peptide (CGRP) markierte Neurone und Nervenfasern detektiert werden konnten, blieb die Methionin-Enkephalin-Immunreaktivität auf Nervenfasern in den untersuchten Dünndarmlokalisationen beschränkt. Neurone, die das vasoaktive intestinale Polypeptid (VIP) exprimierten, zeigten überwiegend auch NOS-Immunreaktivität. Dagegen wurde eine Koexpression von ChAT und VIP oder Neuropeptid Y (NPY) nur vereinzelt dokumentiert, während die Koexpression von NPY und NOS nicht beobachtet wurde. Die vorliegende Arbeit liefert zahlreiche Daten zur Chemoarchitektur des Plexus myentericus des Pferdes unter physiologischen Bedingungen. Diese Befunde können dem Verständnis neuropathologischer Veränderungen dienen sowie deren Diagnose und Behandlung erleichtern.

6. ZUSAMMENFASSUNG Charakterisierung b-adrenerger Rezeptoren auf Pferdelymphozyten und deren Regulation unter dem Einfluß von Clenbuterol und Dexamethason Getu Abraham Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, Deutschland Juni, 2001 86 S., 205 Lit., 7 Tab., 23 Abb. Über Vorkommen und Eigenschaften von b-Adrenozeptoren auf Pferdelymphozyten und ihre pharmakologische Regulation liegen bisher keine Untersuchungen vor. Mit der vorliegenden Arbeit sollten b-adrenerge Rezeptoren an intakten Pferdelymphozyten in Bindungsstudien mit dem Radioliganden (-)-(125I)-Iodocyanopindolol (ICYP), einem potenten b2-selektiven Adrenozeptorenantagonisten, charakterisiert und deren funktionelle Ansprechbarkeit durch Messung des Isoprenalin-induzierten Anstiegs des intrazellulären cAMP-Gehaltes mittels Radioimmunoassay bestimmt werden. Die Bindung von ICYP an intakten Pferdelymphozyten war schnell, sättigbar (maximale Anzahl der Bindungsstellen 320 ± 20 ICYP Bindungsstellen/Zelle, Mittelwert±SEM, n = 12) ) und hochaffin (KD-Wert für ICYP 14,37 ± 1,66 pmol/l, Mittelwert±SEM, n = 12). Verdrängungsexperimente mit Agonisten und Antagonisten zeigten eine Affinität und Stereoselektivität, wie sie bei b-Adrenozeptoren zu erwarten waren. Der nicht radioaktiv markierte b2-selektive Adrenozeptorantagonist ICI 118,551 verdrängte den Radioliganden ICYP aus seiner Bindung mit mehr als 1500fach höherer Affinität als der nicht radioaktiv markierte b1-selektive Adrenozeptorantagonist CGP 20712A. In Pferdelymphozyten können somit mehr als 90 % der b-Adrenozeptoren dem b2-Subtyp zugeordnet werden. Ein Anteil von weniger als 10 % an b1-Adrenozeptoren kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Die Bindungsstellen waren stereospezifisch, da das biologisch aktive (-)-Propranolol die Bindung von ICYP mit 40fach höherer Affinität verdrängte als (+)-Propranolol. b-adrenerge Agonisten verdrängten ICYP aus seiner spezifischen Bindung in der Rangfolge ihrer pharmakologischen Wirkungstärke, die typisch für den b2-Subtyp des Adrenozeptors ist: (-)-Isoprenalin > (-)-Adrenalin > (-)-Noradrenalin. Eine ähnliche Rangfolge wurde auch für die Agonist-induzierte cAMP-Bildung in Lymphozyten festgestellt. Aufgrund der dargestellten Befunde kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß ICYP ein geeigneter Radioligand ist, um b-adrenerge Rezeptoren an Pferdelymphozyten zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Bindung von ICYP an intakte Lymphozyten stellt somit ein geeignetes Modell dar, um wichtige Informationen über die Funktion und Regulation des b-adrenergen Systems beim Pferd sowohl unter physiologischen (pathophysiologischen) Bedingungen als auch über Arzneimittel-induzierte Veränderungen in vivo zu gewinnen. Ausgehend von den beschriebenen Grundlagenuntersuchungen wurden in einer weiteren Versuchsreihe bei zwölf klinisch gesunden Pferden der Einfluß von Clenbuterol und Dexamethason lymphozytäre b2-Adrenozeptoren, hinsichtlich ihrer Dichte, ihrer Affinität zum Radioliganden und ihrer cAMP-Bildung (als Maß für die funktionelle Ansprechbarkeit der b2-Adrenozeptoren bestimmt über Stimulation durch 10 µmol/l Isoprenalin) untersucht. Während der 12tägigen Clenbuterolbehandlung (2 Ž 0,8 µg/kg/Tag, i. v.) fielen die Anzahl der b2-Adrenozeptoren an Lymphozyten und der durch (-)-Isoprenalin-induzierte Anstieg des intrazellulären cAMP-Gehaltes signifikant (p < 0,05, n = 8) unter die Ausgangswerte unbehandelter Tiere ab. Clenbuterol bewirkte in der therapeutischen Dosis bereits 48 Stunden nach der Behandlung einen Abfall der Anzahl der b2-Adrenozeptoren bzw. der cAMP-Bildung um etwa 30 - 40 %. Während der restlichen Behandlungsdauer unter Clenbuterol blieb die Rezeptorendichte auf diesem niedrigen Niveau. Bei einer weiteren Versuchsgruppe wurde der Effekt des Glukokortikoids Dexamethason auf die Clenbuterol-induzierte Desensibilisierung von b2-Adrenozeptoren untersucht. Dexamethasonverabreichung (1 Ž 0,1mg/kg/d, i. v.) unmittelbar nach der letzten Clenbuteroldosis über 5 Tage beschleunigte die Wiederherstellung der down-regulierten Anzahl der lymphozytären b2-Adrenozeptoren und des Isoprenalin-induzierten Anstiegs des intrazellulären cAMP-Gehaltes (p < 0,05, n = 4). Schon 24 Stunden nach der ersten Dexamethasongabe waren beide Parameter von den Durchschnittswerten am Tag vor Behandlungsbeginn statistisch nicht zu unterscheiden. Die Anzahl der lymphozytären b2-Adrenozeptoren stieg sogar ab dem dritten Tag der Dexamethasonbehandlung bis auf das Doppelte bei unbehandelten Tiere an. Nach dem Absetzen der Dexamethasonbehandlung kam es zu einer langsam Abnahme der Rezeptorendichte und ihrer Ansprechbarkeit, wobei die vor der Clenbuterolbehandlung gemessenen Werte erst nach 4 Tagen erreicht wurden. Bei gleichzeitiger Behandlung der Tiere mit Clenbuterol und Dexamethason konnte durch das Glukokortikoid die Clenbuterol-induzierte Abnahme der b2-Adrenozeptorendichte und deren Ansprechbarkeit vollständig verhindert werden. Weder durch die Clenbuterol-abhängige Down-Regulation noch durch die Dexamethason-bedingte Hochregulation kam es zu signifikanten Veränderungen der Dissoziationskonstante (KD) und somit der Affinität von ICYP zu b2-Adrenozeptoren. Die Ergebnisse zeigen, daß es unter Behandlung mit Clenbuterol zu einer schnell einsetzenden, umfangreichen Down-Regulation der b2-Adrenozeptorendichte an Lymphozyten des Pferdes kommt und daß diese Toleranzentwicklung durch Glukokortikoide vollständig wieder aufgehoben oder verhindert werden kann. Zur Therapie der COB von Pferden scheint somit die kombinierte Anwendung von b2-Mimetika und Glukokortikoiden von Vorteil zu sein. / 7. Summary Characterization of b-adrenergic Receptors on Equine Lymphocytes and their Regulation under the Influence of Clenbuterol and Dexamethasone Getu Abraham Institute of Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig, Germany June, 2001 86 pp., 205 ref., 7 tab., 23 fig. b-Adrenoceptors and their regulation by pharmacological active substances have not yet been characterized in equine lymphocytes. In this study, b-adrenoceptors were identified and subclassified by (-)-[125I]-iodocyanopindolol (ICYP) binding, a potent b2-adrenergic antagonist, as well as by their isoprenaline-induced responsiveness using radioimmunoassay in intact viable equine lymphocytes. The specific ICYP binding was rapid, saturable (maximum number of binding sites 320 ± 20 ICYP binding sites/cell, means±SEM, n = 12) and of high affinity (KD-value for ICYP 14.37 ± 1.66 pmol/l, means±SEM, n = 12). The competition binding studies with agonists and antagonists showed the affinity and stereoselectivity to be expected for b-adrenergic receptors. The unlabelled selective b2-adrenoceptor antagonist ICI 118,551 was about 1500 times more potent in inhibiting ICYP binding than was the b1-selective adrenoceptor antagonist CGP 20712A. It is, therefore, concluded that in intact equine lymphocytes ICYP labels a class of functional b-adrenoceptors, that belong predominantly (> 90 %) to the b2-adrenoceptor subtype. A minor (< 10 %) b1-adrenoceptor component, however, cannot be completely ruled out. The binding sites were stereoselective, as the (-)-isomer of propranolol was about 40 times more potent to inhibit ICYP binding than was the (+)-isomer. Agonists competed for specific binding with a rank order of potency (-)-isoprenaline > (-)-adrenaline > (-)-noradrenaline, which is typical for a b2-subtype of adrenergic receptor; the same order of potency was obtained for agonist-induced stimulation of lymphocyte cyclic AMP content. Thus, it can be concluded that ICYP is a promising compound for the reliable determination of the binding characteristics of b-adrenoceptors of equine lymphocytes and besides that, this might give an insight in providing physiologically significant information about the regulation of the b-adrenergic receptor system. Based upon this study, we further investigated, in 12 healthy thoroughbred horses, the effects of the b2-agonist clenbuterol and the glucocorticoid dexamethasone on the lymphocyte b2-adrenenergic receptor density and affinity as well as on its responsiveness (assessed by lymphocyte cyclic AMP responses to 10 µmol/l (-)-isoprenaline). Clenbuterol (2Ž0.8µg/kg/d, i. v. for 12 days) decreased ICYP binding sites only 48 h after application by ~30-40 %; concomitantly, lymphocyte cAMP response to (-)-isoprenaline was significantly reduced (p < 0.05, n = 8). The values remained at these low levels throughout the following 10 days of treatment. After withdrawal of clenbuterol the density and responsiveness of b2-adrenoceptors gradually increased, reaching pre-drug levels after 4 days. Next the effects of dexamethasone on clenbuterol-induced desensitisation were studied. Administration of dexamethasone (1Ž0.1mg/kg/d, i. v. for five days) immediately after clenbuterol withdrawal accelerated b2-adrenergic receptor recovery (p < 0.05, n = 4): only 24 hours after administration dexamethasone restored the number of binding sites and cAMP response to (-)-isoprenaline to levels statistically indistinguishable from the values before starting clenbuterol treatment. Three days after dexamethasone administration the density of lymphocyte b2-adrenoceptors was further increased about two fold the pre-treatment values, and this increase declined gradually after dexamethasone withdrawal, reaching baseline values after 4 days. Furthermore, in groups simultaneously exposed to both drugs dexamethasone completely prevented clenbuterol-induced decrease in lymphocyte b2-adrenoceptor density and responsiveness. No significant change was observed in the dissociation constant and, thus, in the affinity of ICYP to b-adrenoceptors remained unchanged during or after treatment with either clenbuterol or dexamethasone. It is concluded that dexamethasone (glucocorticoids) can reverse and prevent clenbuterol-induced down-regulation of the lymphocyte b2-adrenoceptors and thus, a combined therapy with clenbuterol and dexamethasone may be potentially beneficial in COPD of horses.

München, Techn. Univ., Diss., 2005

Köln, University, Diss., 2006.

Zugl.: Fribourg, Univ., Univ., Diss., 2004