Le récepteur Met et son ligand l’HGF/SF sont essentiels pour le développement embryonnaire tandis que la dérégulation de la signalisation du récepteur Met est associée à la progression tumorale. Activé par son ligand, Met induit un large panel de réponses biologiques telles que la survie cellulaire, la migration ou la prolifération. En revanche, le fragment p40 Met issu du clivage du récepteur par les caspases participe à l’apoptose. Cette dualité fonctionnelle est caractéristique de la famille des récepteurs à dépendance. Bien que la signalisation positive des RTK soit bien décrite, les mécanismes moléculaires leur permettant de participer aux processus de mort restent encore méconnus. Nous avons montré que le fragment p40 Met est capable d’amplifier l’apoptose indépendamment de l’activité kinase bien qu’il comprenne l’intégralité du domaine catalytique. Au cours de l’apoptose, nous avons montré à partir de lignées cellulaires épithéliales ou dans des foies de souris que p40 Met présente une localisation mitochondriale indispensable à ses fonctions apoptotiques. De manière intéressante, p40 Met possède au sein du site de fixation de l’ATP un domaine BH3 comparable à celui des protéines pro apoptotiques Bcl-2 de type BH3-only. A l’image des BH3-only, ce domaine est impliqué à la fois dans l’activité apoptotique du fragment et dans son association avec la protéine Bcl 2. Le fragment p40 Met est capable d’induire la perméabilisation mitochondriale independamment des caspases ce qui conduit au relargage du cytochrome c. Enfin, au cours de l’apoptose, l’extinction de l’expression de Met entraîne un retard du relargage du cytochrome c, démontrant ainsi la participation du récepteur dans la voie intrinsèque de l’apoptose. / The receptor tyrosine kinase Met and its ligand, the hepatocyte growth factor, are essential to embryonic development, whereas deregulation of Met signaling is associated with tumorigenesis. While ligand-activated Met promotes survival, caspase-dependent generation of the p40 Met fragment leads to apoptosis induction, hallmark of the dependence receptor. We show that although p40 Met contains the entire kinase domain, it amplifies apoptosis independently of kinase activity. In cell cultures and mouse liver undergoing apoptosis, the fragment shows a mitochondrial localization, required for p40-Met-induced cell death. Interestingly, p40 Met exhibits a BH3-like domain overlapping with its ATP-binding site and required for the apoptotic response. It induces mitochondrial permeabilization, while Met silencing delays this response. This demonstrates the involvement of receptor cleavage in regulating mitochondrial cell death. The Met dependence receptor thus displays overlapping kinase and BH3 domains, the former involved in survival, the latter in cell death via the intrinsic apoptosis pathway.

c-Met is a tyrosine receptor kinase which is activated by its only ligand, the hepatocyte growth factor (HGF). Activation of c-Met leads to a wide spectrum of biological activities such as motility, angiogenesis, morphogenesis, cell survival and cell regeneration. c-Met and HGF knock-out mice are embryonic lethal. During embryogenesis, c-Met is required for liver, kidney and skeletal muscles development. In adult tissues, c-Met is involved in wound healing and hepatocyte regeneration. c-Met is abnormally activated in many tumours types. Aberrant c-Met activation was found to induce tumour development, tumour cell migration and invasion, and the worst and final step in cancer progression, metastasis. In addition, c-Met activation in cells was also shown to confer resistance to apoptosis induced by UV damage or chemotherapeutic drugs. c-Met is thus an attractive target for drug development. This study describes the development of monoclonal antibodies against c-Met as therapeutic molecules in cancer treatment/diagnostics. Antibodies were raised against the a-chain of c-Met. 21 hybridoma clones were single-cell cloned and subjected to preliminary monoclonal antibody characterisation. 11 monoclonal antibodies were finally selected for ascites production and antibody purification. These purified antibodies were characterised by Western blotting, immunofluorescence staining, functional assays (ERK phosphorylation and cell scatter) and for their ability to recognise native c-Met by flow cytometry. Some of the anti-a-chain c-Met antibodies perform better in Western blotting and immunofluorescence staining than the presently-available commercial antibodies. The Mab 2.1 and 13.1 bind strongly to native c-Met in flow cytometry and may be potential candidates for antibody therapy and cancer diagnostics.

Proefschrift Rijksuniversiteit Limburg, Maastricht. / Met lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

L’activation du récepteur tyrosine kinase Met par son ligand, l’Hépatocyte Growth Factor, induit des réponses cellulaires nécessaires au développement embryonnaire, comme la survie ou la migration. Cependant une dérégulation de sa signalisation favorise la tumorigenèse. Mon laboratoire a montré que le récepteur Met subit des clivages protéolytiques régulant son activité. Ainsi, le « PreSenilin-dependent Regulated Intramembrane Proteolysis », un double clivage par des métalloprotéases membranaires puis le complexe γ-sécrétase, contrôle sa demi-vie. Suite à un stress apoptotique, Met est clivé par les caspases en un fragment intracellulaire amplificateur d’apoptose. J’ai pu montrer que le récepteur Met est la cible d’une autre famille de protéases, les calpaïnes, qui réalisent deux clivages distincts en fonction du contexte cellulaire. En effet, la mutation R970C observée dans certains cancers ou une forte densité cellulaire induisent le clivage de Met en un fragment de 45 kDa, p45 Met, qui se relocalise dans le noyau et augmente la dispersion et la motilité cellulaire, suggérant un rôle dans la transformation cellulaire. D’autre part, lors d'un stress calcique induisant la nécrose, le récepteur Met est à la fois clivé par les calpaïnes et les métalloprotéases. Bien que les fragments générés ne semble pas amplifier la mort cellulaire, ce double clivage permet une dégradation efficace de Met et inhibe ainsi des signaux de survie transmis pas Met. L’ensemble de ces fragments est détecté dans des tumeurs pulmonaires surexprimant Met, indiquant que les clivages identifiés par notre laboratoire reflètent des mécanismes existant dans des conditions pathologiques. / Met receptor activation by its ligand, Heptocyte Growth Factor, induces cell responses necessary for embryonic development such as cell survival or motility. However, its deregulation is involved in tumorigenesis. My laboratory previously showed that Met activity is regulated by proteolytic cleavage. Indeed, PreSenilin-dependent Regulated Intramembrane Proteolysis (or PS-RIP), two sequential cleavages mediated by membrane metalloproteases and the γ-secretase complex, controls Met half-life. Following apoptotic stress, Met is also cleaved by caspases into an intracellular fragment which amplifies apoptosis.I showed that Met is targeted by calpains, another protease family mediating two different cleavages in two different cellular contexts. Indeed, the R970C Met mutation or high cell density induces cleavage of Met into a fragment about 45kDa, p45 Met, which translocates in the nucleus and favors cell scattering and motility, suggesting it is involved in cell transformation. On the other hand, during necrosis induced by calcium stress, Met receptor is cleaved by both calpains and metalloproteases. Although the generated fragments do not seem to have biological properties, these two cleavages mediate an efficient degradation of Met receptor and consequently inhibiting of the survival signals it can provide. Interestingly, these fragments are detected in lung cancer samples overexpressing Met indicating that proteolytic cleavages of Met we identified have a pathological relevance.

Des études cliniques indiquent que l’hétérogénéité des récepteurs tyrosine kinase (RTK) dérégulés dans le cancer colorectal (CCR) contribue à la résistance aux thérapies ciblant qu’un seul RTK. Une alternative serait de cibler les protéines effectrices engagées par plusieurs RTK régissant les processus clés à la progression du CCR, mais la signalisation des RTK dans le CCR reste peu définie. Des travaux réalisés au laboratoire ont démontré par une approche dominante négative que le pouvoir oncogénique du RTK Met chez les cellules épithéliales intestinales transformées par une forme active de Met (Tpr-Met-IEC-6) serait dépendant des protéines Gab (Grb2-associated binder). Cette approche reposait sur l’inhibition de l’interaction entres les protéines Gab et Met par l’expression du domaine de Gab1 renfermant un motif d’interaction indirect aux RTK, via la protéine Grb2, et le site de liaison direct, unique à Gab1, avec Met. Ainsi, cette approche ne permet pas de discerner les effets de Gab1 de ceux de Gab2 en aval de Met. L’objectif de cette présente étude était de définir les rôles qui sont propres à Gab1 et à Gab2, en aval de Met, dans les cellules Tpr-Met-IEC-6. Pour ce faire, nous avons évalué l’impact d’une modulation de l’expression de Gab1 et de Gab2, par une approche d’interférence à l’ARN et de surexpression, sur les caractéristiques oncogéniques de ces cellules. De façon surprenante, nous démontrons que Gab1 affecte positivement l’expression Tpr-Met, la transformation morphologique ainsi que la croissance cellulaire. De plus, nous démontrons que la diminution ou la surexpression de Gab2 dans les cellules Tpr-Met-IEC-6 n’a aucun effet sur la morphologie, la croissance cellulaire, la capacité des cellules à croître au-delà de la confluence et sans ancrage à la matrice extracellulaire et enfin sur la migration. En conclusion, mes travaux de recherche suggèrent que la protéine Gab1, et non Gab2, joue un rôle essentiel dans le pouvoir oncogénique de Met dans les cellules épithéliales intestinales. Ainsi, Gab1 et ses voies de signalisation pourraient représenter des cibles prometteuses pour l’élaboration de nouvelles thérapies contre le CCR.

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La Esquizofrenia es una enfermedad mental crónica y compleja que afecta al 1% de la población. El gen que codifica a la enzima catecol o-metil transferasa (COMT) es candidato de riesgo porque participa en el catabolismo de la dopamina. El polimorfismo funcional Val/Met (rs4680) en el gen COMT genera actividad enzimática diferencial, es variable en las poblaciones y ha sido asociado a la esquizofrenia. En el Perú, no existen estudios de asociación genética y es necesario implementarlas para la prevención, diagnóstico, pronóstico y farmacogenética de la enfermedad. El objetivo fue establecer la asociación entre el polimorfismo Val/Met en el gen COMT y la esquizofrenia en una muestra peruana. Se ha realizado un estudio tipo casos-controles, previo consentimiento informado, con una muestra de 50 pacientes esquizofrénicos del hospital nacional Hermilio Valdizán y 150 personas saludables, sin diagnóstico de la enfermedad, residentes en la ciudad de Lima. El análisis molecular del polimorfismo Val/Met se realizó mediante la técnica PCR-RFLP y confirmado por secuenciamiento automático. En los controles y los pacientes las frecuencias genotípicas fueron similares (Val/Val=40-44%, Val/Met=46-52%, Met/Met=8-10%), y evaluados según el modelo de herencia codominante, no se han encontrado diferencias significativas [p>0.05; Val/Met: OR=0.80 (IC 95%: 0.41-1.58) y Met/Met: OR=1.14 (IC 95%: 0.36-3.64)]; la tendencia es similar bajo los modelos de herencia dominante, recesivo, sobredominante y aditivo. Asimismo, las frecuencias alélicas en ambos grupos (Val=66-67%, Met=33-34%), no muestran diferencias (p>0.05). Además, el género no interactúa en la asociación con la enfermedad según genotipos Val/Met (p>0.05). Los resultados nos indican que no existe asociación entre el polimorfismo Val/Met en el gen COMT y la susceptibilidad a la esquizofrenia en esta muestra peruana evaluada. En perspectiva, es necesario estudiar un mayor número de muestra, incluir otras subpoblaciones peruanas según ancestralidad, evaluar en conjunto con otros genes y epigenes, considerar los endofenotipos clínicos y utilizar tecnologías de secuenciamiento de ADN de alto rendimiento.

Global maritime education and training (MET) is currently subject to great change brought about by new international legislation, a dynamic shipping environment, the growing impact of technology, and the challenges maritime institutions face to survive in an uncertain market place.The aim of the research is to determine to what extent global MET institutions can enhance and enrich traditional practices through access to new technology and the use of innovative teaching and assessment methods' within a sustainable and achievable framework.The first Chapters of the study investigate the impact of change on the global MET scene by examining how international maritime legislation influences activities of maritime institutions. Ninety institutions from fifty-three countries responded to a survey that examines their intentions regarding the use of satellite communications, Information Technology, computing, multimedia, simulation and distance learning delivery methods. Shipboard operations that impact upon future training needs are also put under the spotlight.The study analyses the potential use of the Internet, e-mail, simulation and distance education services to determine how these elements can be used to advantage for the education and training of seafarers. An evaluation is made of the use of computers and marine simulators as assessment tools, in the light of international concerns about standards of competence.The study concludes that maritime institutions can benefit from the use of new technology, but only through rational planning and sustainable staged growth. A series of continua of technical development are provided to assist institutions, from to the largest, to plan for technical development and growth in a rational way.

Proefschrift Maastricht. / Lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Zugl.: Tübingen, Universiẗat, Diss., 2008.