Matrix metalloproteinases (MMPs) network with other biological molecules to maintain the extracellular matrix (ECM) in normal physiology and perform different roles. Understanding and assigning specific role to each of 24 members of these endoproteinases is impeded because of lack of specific and efficient detection methods in biological samples. Moreover, MMP-based anti-cancer drug development has also been challenged because, currently, there is no robust methodology to distinguish the inactive pro-enzymes, active enzymes or those complexed with endogenous inhibitors in biological specimens. The objective of this project is to develop a chemical proteomics strategy based on Matrix assisted laser desorption ionization tandem mass spectrometry (MALDI-MS/MS) to help identify and discriminate the various MMP forms. Firstly, a triazine dye-based ligand immobilized on chromatography beads was utilized to assess whether it binds to recombinant human MMPs (rhMMPs). The results highlighted that the ligand interacts with latent forms of MMPs in agreement with the literature. Secondly, the potential of the ligand was assessed using MALDI-MS/MS based methodology in in vitro cancer models. Cell line culture supernatants were used in amounts to emulate the availability of tumour biopsies in clinical settings. The MS/MS spectral peaks specific to MMPs (MMP-2 and MMP- 14), and two endogenous inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 were found in affinity chromatography eluates of cell culture supernatants with higher Mascot scores for the latter. While western blot detected MMP-2 in cell extracts, MALDI-MS/MS did not detect MMPs because of amounts below the limit of detection (LOD) of the instrument. Although the ligand was found to be interacting with MMPs and detergent-free salt elution buffers improved MALDI analysis, recovery of MMPs from biological samples was sub-optimal. The dye ligand was observed to bind other enzymes and despite various strategies to reduce non-specific binding of proteins or enable selective elution did not improve MMP enrichment. Further work using methodology described in this study is required after scaling up the MMP amounts in biological specimen and to resolve the issue of non-specific binding of proteins to the ligand by understanding its structure. / Shaukat Khanam Memorial Cancer Hospital and Research Centre, Pakistan and University of Bradford

Type II collagen, which gives the cartilage its tensile strength, is destroyed in osteoarthritis (OA). Cathepsin K is recognized as capable of cleaving type II collagen, however, the regulation of its activity in the cartilage is little known. Our hypothesis is that the activity of cathepsin K in cartilage is measured by an ELISA specific to cathepsin K cleavage site. A new specific ELISA (C2K77) was developed and tested by measuring the activity of the exogenous cathepsin K. The ELISA C2K77 was then used to measure the activity of the endogenous cathepsin K in equine articular cartilage explants cultured with or without stimulation (IL-1β, TNF-α, Oncostatin M (OSM) and LPS). Then the activity of cathepsin K was compared to that of MMPs (C1,2C ELISA) in the cartilage explants and in the freshly harvested cartilage. A significant difference was observed between normal cartilage and cartilage digested with cathepsin K (p˂0.01). There was no significant difference in the content of C2K77 between the control group and the groups stimulated while the content of C1,2C was increased by the combination of IL-1β and OSM (p = 0.002) and TNF-α and OSM (p˂0.0001). The new ELISA C2K77 demonstrates the ability to measure the activity of cathepsin K and revealed that there is a difference between the regulation of cathepsin K and MMP in articular cartilage. / Le collagène de type II, qui confère au cartilage articulaire sa résistance à la tension, est détruit dans l’arthrose. La cathepsine K est reconnue comme pouvant cliver le collagène de type II. Cependant, la régulation de son activité dans le cartilage est peu connue. Notre hypothèse est que l’activité de la cathepsine K dans le cartilage est mesurable par une ELISA spécifique au site de clivage de la cathepsine K. Une nouvelle ELISA spécifique (C2K77) a été développée et testée en mesurant l’activité de la cathepsine K exogène. L’ELISA C2K77 a ensuite été utilisée pour mesurer l’activité de la cathepsine K endogène dans des explants de cartilage articulaire équin mis en culture avec ou sans stimulations (IL-1β, TNF-α, oncostatine M (OSM) et le LPS). Puis l’activité de la cathepsine K a été comparée à celle des MMPs (avec l’ELISA C1,2C) dans les explants de cartilage et dans le cartilage fraichement récolté. Une différence significative a été observée entre le cartilage normal et le cartilage digéré avec la cathepsine K exogène (p˂0.01). Il n’y avait aucune différence significative dans la quantité de C2K77 entre le groupe control et les groupes stimulés tandis que la quantité de C1,2C a été augmenté par la combinaison de l’IL-1β et de l’OSM (p=0.002) et du TNF-α et de l’OSM (p˂0.0001). La nouvelle ELISA C2K77 démontre la capacité de mesurer l’activité de la cathepsine K et a permis de voir qu’il y a une différence entre la régulation de la cathepsine K et des MMPs.

Les vaisseaux sanguins sont composés de cellules enchâssées dans la matrice extracellulaire (MEC). Certaines interactions entre les cellules et les composés de la MEC sont impliquées dans plusieurs changements pathologiques et physiologiques au niveau de la paroi artérielle. L'hypertension systolo-diastolique provoque deux formes de remodelage vasculaire : hypertrophique dans les artères de conductance et eutrophique dans les artères de résistance. Les mécanismes régissant le remodelage eutrophique ne sont pas encore bien éclaircis. Afin de les étudier, nous avons utilisé un modèle d'hypertension systolodiastolique induite par l'inhibition de la synthèse de monoxyde d'azote. Nous avons démontré que la contribution des protéines de désadhésion semblait différer d'un type de remodelage à l'autre et que les métalloprotéinases matricielles (MMPs) ne jouaient pas un rôle crucial dans le développement du remodelage eutrophique, contrairement au remodelage hypertrophique. Au cours du vieillissement, on observe des modifications de la paroi vasculaire des artères de conductance, augmentant leur rigidité : une fragmentation des fibres élastiques, leur calcification (élastocalcinose), une augmentation des liens covalents entre les protéines de la MEC et une fibrose. Cette rigidité conduit au développement de l'hypertension systolique isolée. Afin d'évaluer l'implication des MMPs dans la fragmentation de l'élastine et leur rôle dans le développement de l'élastocalcinose, nous avons utilisé un modèle animal d'élastocalcinose basé sur l'inhibition de la maturation de la matrix Gla protein (MGP), une protéine anti-calcifiante, par la warfarine. Nous avons observé une augmentation rapide et transitoire de l'activité de la MMP-9, suivie de l'activation du transforming growth factor-ß (TGF-ß). L'inhibition de l'activité des métalloprotéinases et de TGF-ß a permis de prévenir l'élastocalcinose. Par ailleurs, l'élastocalcinose est accélérée par le diabète. Cette accélération est reliée à la durée et à la sévérité du diabète. Or, ce dernier est associé à une augmentation de la synthèse des produits avancés de glycation (AGEs) pouvant former des liens covalents iv entre les protéines de la MEC. Ne disposant pas de modèle animal pour étudier l'implication des AGEs dans l'élastocalcinose associée au diabète, nous en avons créé un. Dans ce modèle, le diabète est induit par une diète riche en lipides et une injection de streptozotocine (30 mg/kg/jr). L'élastocalcinose est provoquée par l'inhibition de la maturation de la MGP. Nous avons observé une accélération de l'élastocalcinose, liée à la durée du diabète, et une accumulation de AGEs dans la paroi des artères fémorales. L'utilisation de pyridoxamine, un inhibiteur de la formation des AGEs, et de l'ALT711, un briseur des liaisons covalentes formées par les AGEs, a permis de prévenir et de limiter, respectivement, la calcification dans ce modèle. En outre, nous avons montré que la stimulation du récepteur des AGEs (RAGE), pouvait être impliquée dans l'élastocalcinose et élucidé certains éléments de signalisation dans ce processus. Ces travaux ont fait émerger le rôle des MMPs, de TGF-ß et des produits avancés de glycation dans le remodelage hypertrophique et l'élastocalcinose associée ou non au diabète. Ceux-ci sont reliés à l'apparition de l'hypertension systolo-diastolique et systolique isolée, respectivement. L'inhibition de ces acteurs pourrait constituer de nouvelles thérapies anti-hypertensives.

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d'ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d'acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l'aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d'association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d'un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d'entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d'intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d'une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Le développement d'une nouvelle sonde dite " activity-based probe " pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d'un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu'avec cette nouvelle sonde qu'il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l'ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l'analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l'analyse de carotides humaines de patients souffrant d'athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l'avenir de tester d'autres fluides pathologiques d'origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.

Transforming growth factor beta (TGF-β) has been implicated in anterior subcapsular cataract (ASC) development. In the first section of this thesis, an in-vitro rat lens model was used to determine the role of matrix metalloproteinases during TGF-β-induced ASC. In the second part, an in-vivo TGF-β transgenic and Smad3 knockout model was used to examine the role of Smad3 signaling pathway in TGF-β-induced ASC development. Lastly, an in-vitro rat lens epithelial explant culture model was used to investigate the potential role of heat shock proteins (Hsps) in TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT). Optical, morphological and molecular changes were analyzed in theses studies. Results from cultured rat lenses show a significant increase of back vertex distance variability (decrease of sharpness and focus) during ASC development. Inhibition of MMPs eliminated the TGF-β-induced plaque formation. Similarly, the overexpression of TGF-β1 in transgenic mouse lenses leads to ASC formation and a decrease in lens optical quality in comparison to wild-type lenses, while TGF-β1/Smad3-/- (null) lenses show diminished TGF-β-induced effects. The plaques formed in the TGF-β1/Smad3-/- lenses are substantially smaller than in the TGF-β1/Smad3+/+ lenses. The morphological and molecular changes of TGF-β2/FGF-2 treated rat lens epithelial explants are similar to those found in the TGF-β2 treated rat lenses and transgenic TGF-β1 mouse lenses. Heat shock treatment prior to TGF-β treatment significantly reduced the effects of EMT in rat LECs. In conclusion, MMP inhibition prevented TGF-β-induced ASC formation whereas heat shock treatment and the absence of Smad3 protein expression only reduced the severity of TGF-β-induced effects.

Transforming growth factor beta (TGF-β) has been implicated in anterior subcapsular cataract (ASC) development. In the first section of this thesis, an in-vitro rat lens model was used to determine the role of matrix metalloproteinases during TGF-β-induced ASC. In the second part, an in-vivo TGF-β transgenic and Smad3 knockout model was used to examine the role of Smad3 signaling pathway in TGF-β-induced ASC development. Lastly, an in-vitro rat lens epithelial explant culture model was used to investigate the potential role of heat shock proteins (Hsps) in TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT). Optical, morphological and molecular changes were analyzed in theses studies. Results from cultured rat lenses show a significant increase of back vertex distance variability (decrease of sharpness and focus) during ASC development. Inhibition of MMPs eliminated the TGF-β-induced plaque formation. Similarly, the overexpression of TGF-β1 in transgenic mouse lenses leads to ASC formation and a decrease in lens optical quality in comparison to wild-type lenses, while TGF-β1/Smad3-/- (null) lenses show diminished TGF-β-induced effects. The plaques formed in the TGF-β1/Smad3-/- lenses are substantially smaller than in the TGF-β1/Smad3+/+ lenses. The morphological and molecular changes of TGF-β2/FGF-2 treated rat lens epithelial explants are similar to those found in the TGF-β2 treated rat lenses and transgenic TGF-β1 mouse lenses. Heat shock treatment prior to TGF-β treatment significantly reduced the effects of EMT in rat LECs. In conclusion, MMP inhibition prevented TGF-β-induced ASC formation whereas heat shock treatment and the absence of Smad3 protein expression only reduced the severity of TGF-β-induced effects.

Matrix metalloproteinases (MMPs), such as collagenases, are a family of enzymes capable of degrading most constituents of the extracellular matrix. MMPs are thought to be involved in the aetiopathogenesis of tendon rupture. Additionally, failure of healing has in some instances been associated with elevated levels of MMPs. We have studied (a) the effects of the MMP-inhibitor doxycycline on healing of tendons and intestines in experimental models and (b) systemic levels of MMPs and their endogenous inhibitors (TIMPs) in patients with tendon rupture. In the first study, systemic doxycycline treatment lead to weakened rat Achilles tendons during healing after injury. Subsequently, systemic doxycycline was shown to improve biomechanical properties of tendon suture fixation in the rat Achilles tendon. Sutures were also coated with doxycycline, leading to similar improvement in mechanical strength of the suture construct during healing. In the third study, doxycycline-coated sutures improved the strength of healing intestinal anastomoses in an experimental model. Finally, we showed that patients with a history of Achilles tendon rupture had elevated levels of MMP-2, MMP-7 and TIMP-2 in serum. In addition, MMP-7 correlated inversely to mechanical strength of the tendon during healing. In conclusion, MMP-inhibitors can be administered systemically and locally to manipulate healing of tendons and intestines. Generalised alterations in the MMP-TIMP system may be involved in the pathogenesis of Achilles tendon rupture and associated with differences in outcome of healing.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'arthrite est une maladie qui affecte les articulations. Les métalloprotéases matricielles (MMPs) et les aggrécanases sont hautement exprimées chez les patients souffrant de l'arthrite rhumatoïde (RA) et de l'arthrose (OA). Quatre inhibiteurs tissulaires spécifiques des métalloprotéinases (TIMPs): TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 et TIMP-4, identifiées à date, sont capables d'abolir spécifiquement les activités des MMPs. La dégradation physiologique et pathologique de la matrice extracellulaire du cartilage est réglée par un équilibre entre MMPs et leurs inhibiteurs TIMPs, TIMP-4 étant le plus récent membre de la famille TIMP. La distribution tissulaire de TIMP-4 nous montre qu'elle est abondamment présente dans le tissu cardiaque, par contre elle est moins exprimée dans le foie, le rein, et les autres organes. l) Dans ce travail nous avons démontré pour la première fois que l'ARN et la protéine correspondante TIMP-4, sont exprimés dans le cartilage grâce aux techniques d'lmmunohistochimie, RT-PCR, et Western blot. Également nous avons mis en évidence que le gène TIMP-4 est exprimé dans le cartilage arthritique et non-arthritique. Le gène TIMP-4 est aussi exprimé dans les membranes synoviales, les chondrocytes primaires humaines et les chondrocytes bovines ainsi que dans le cartilage bovin. 2) Chez les patients la comparaison de l'expression du gène TIMP-4 indique bien la surexpression de ce dernier dans le cartilage des patients ostéoarthritiques et arthritiques. Nous avons remarqué que l'expression de TIMP-4 dans le cartilage chez les patients ostéoarthritiques, était principalement dans la zone superficielle du cartilage articulaire. Ceci suggère qu'il pourrait avoir un rôle dans le remodelage et dans le processus pathologique du cartilage arthritique. La présence et l'augmentation des TIMPs ne protègent pas contre la destruction du cartilage par une surabondance des MMPs et des aggrécanases. 3) La régulation de l'expression des MMPs, TIMP-1, TIMP-3 se fait par les cytokines et des facteurs de croissance inflammatoires : IL-1, TNF-α, l'oncostatin M (OSM) et TGF- β. Alors que celle de TIMP-4 n'est pas réglée par ces facteurs. Ceci suggère que TIMP-4 pourrait jouer un rôle distinct dans le processus de la maladie arthritique dont les mécanismes restent à étudier.