O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

A caracterização de vias de sinalização alteradas em células tumorais, e a validação de fármacos inibidores de transdução de sinal que interajam com as mesmas de modo a atuar como terapia principal ou adjuvante no tratamento de neoplasias sólidas e hematopoiéticas, é um campo de grande interesse em oncologia. A necessidade da caracterização de novos alvos moleculares advém da incidência considerável de recidivas, quadros de quimiorresistência e efeitos adversos associados ao tratamento com os agentes antitumorais clássicos. Nesta tese, desenvolvemos a hipótese de que o fator de transcrição NFκB poderia estar envolvido com processos de proliferação, antiapoptose e quimiorresistência em células neoplásicas, caracterizando-se como um potencial alvo para interferência farmacológica. Para isso, avaliamos: i) o papel de NFκB na resposta celular a ERO e no controle da decisão entre morte e proliferação celular; ii) o estado de ativação de NFκB em modelos tumorais in vitro e in vivo; iii) o potencial citotóxico e seletividade dos inibidores de NFκB, seus mecanismos de ação, atividade em células neoplásicas e em linhagens quimiorresistentes. Para isso, foram utilizadas abordagens in vitro (cultivos celulares), in vivo (modelo animal de implante tumoral), e análises de bancos de expressão gênica através de ferramentas de biologia de sistemas. Os resultados demonstraram que NFκB está superestimulado em linhagens de leucemia e de glioblastoma quando comparado com leucócitos e astrócitos não-transformados. O tratamento com inibidores farmacológicos de NFκB causou morte celular programada em um mecanismo seletivo para células tumorais, potenciando os efeitos de antitumorais clássicos tanto em linhagens selvagens quanto em células quimiorresistentes. Além disso, os inibidores BAY117082 e curcumina apresentaram atividade in vivo em modelo animal de glioma sem evidência de citotoxicidade aguda. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o fator de NFκB constitui-se um potencial alvo para inibição farmacológica no tratamento de neoplasias. Neste contexto, a diversidade da expressão de NFκB em diferentes tipos tumorais e a segurança associada ao uso clínico de seus inibidores permanece por ser avaliada. / Characterization of new molecular targets is one of the most important challenges in oncology. In this context, there is a growing interest in characterization of deregulated cell signaling pathways in solid and hematopoietic cancer cells in order to leverage the development of specific cell signaling inhibitors to act as principal or adjuvant therapy, and to circumvent the frequently observed chemoresistance and relapse in cancer patients. In this study, we hypothesized that the transcription factor NFκB could be involved on proliferation, antiapoptosis response and chemoresistance in cancer cells thus being a potential target for pharmacological interference. Attempting to test this, we evaluated: i) the role of NFκB in cell response against reactive oxygen species and in control of cell death and proliferation signaling; ii) NFκB activation status in cancer and noncancerous cells in vitro and in vivo; iii) cytotoxicity, selectivity and mechanisms of action of NFκB inhibitors in glioma and leukemia cells besides its biological activity against chemotherapy-resistant cell lines. Experiments were performed based on in vitro (cancer cell lines and primary cultures) and in vivo (tumor implants) models of cell growth. Moreover, in some experiments, bench-directed analysis of public gene expression databases followed by bioinformatic approach was used to ensure the significance and reliability of experimental data. Our findings showed an overstimulation of NFκB in leukemic and glioblastoma cell lines compared to healthy leucocytes and non-transformed astrocytes, respectively. Treatment with pharmacological inhibitors of NFκB induced programmed cell death in a cancer cells selective manner and potentiated the effects of classical anticancer drugs in both wild-type and chemoresistant cell lines. Indeed, the pharmacological NFκB inhibitors BAY117082 and curcumin showed significant anticancer efficacy in a model of brain-implanted gliomas without evidence of acute toxicity. Overall, the herein presented data suggest that NFκB is a potential target for cell death induction in leukemia and glioblastomas. Evaluation of its expression profile in different type of cancers beyond testing efficacy and safety of NFκB pharmacological inhibitors for clinical usefulness remains to be investigated.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / The economic importance of J. curcas is due to the high amount of oil accumulated in their seeds, specifically in the endosperm. In this context, the events related to the endosperm formation and the accumulation of toxic compounds in the seeds could help in the production of varieties that produce more oil and are less toxic. Thus, anatomical, proteomic and gene expression analysis were made with J. curcas seeds to contribute with the knowledge about physiologic events related with the formation of endosperm and the processes of synthesis and accumulation of phorbol esters. The anatomical analysis showed the maternal tissue responsible for the nutrients transfer to the endosperm and contributed to fill the gaps present in the literature about the anatomy of J. curcas seeds. The inner integument is the maternal tissue that presents the vasculature of the mother plant and is the responsible for the nutrition of the endosperm through the process of programmed cell death (PCD). Based on this result proteomic analysis of two anatomically different regions of the inner integument, named as proximal and distal, were performed. The identified proteins indicated that the inner integument pass through PCD in different degrees in the proximal and distal regions and that in this tissue there is a spatial distribution between catabolism and anabolism. In the proximal region especially hydrolases were identified and in the distal region storage proteins and proteins of biosynthetic pathways were prevalent. The gene expression analysis had two purposes: first, verify wether the transcripts levels of the genes likely involved in PCD, whose proteins were identified and quantified in the proteomic analysis, were related to the protein abundance and second, identify the site of synthesis of the committed enzyme in the phorbol esters biosynthesis, the casbene synthase, through a study with root, leaf, embryo, inner integument and endosperm and 14 putative genes of the mentioned enzyme. The results indicated that the proteins related to PCD must be controlled at transcript level. Nine putative genes from casbene synthase were expressed in roots and one of them was expressed in the leaf and embryo. This work denotes the role of PCD in the inner integument to the development of the seed and also demonstrates the transitory nature of storage of this tissue. In addition gives notation that the seed, despite of accumulates phorbol esters, do not synthesizes these compounds, but probably import them from roots. / A importÃncia econÃmica da espÃcie J. curcas deve-se a grande quantidade de Ãleo acumulada em suas sementes, especificamente no endosperma. Os eventos relacionados à formaÃÃo do endosperma e ao acÃmulo de compostos tÃxicos nas sementes podem auxiliar na produÃÃo de variedades com maior produÃÃo de Ãleo e menos tÃxicas. Visando isso, foram realizadas anÃlises anatÃmicas, proteÃmicas e de expressÃo de genes nas sementes de J. curcas para contribuir com o entendimento sobre os eventos fisiolÃgicos associados à formaÃÃo do endosperma e aos processos de sÃntese e acÃmulo dos Ãsteres de forbol. A anÃlise anatÃmica mostrou o tecido maternal responsÃvel pela transferÃncia de nutrientes para o endosperma e contribuiu para resolver lacunas existentes na literatura sobre a anatomia de sementes de J. curcas. O integumento interno à o tecido maternal que apresenta a vascularizaÃÃo da planta-mÃe e à o responsÃvel pela nutriÃÃo do endosperma atravÃs do processo de morte celular programada (PCD). Com base nesse resultado, realizou-se uma anÃlise proteÃmica do integumento interno na regiÃo proximal e distal ao endosperma, uma vez que as caracterÃsticas celulares indicativas de PCD nesse tecido se apresentavam diferentes nessas regiÃes. As proteÃnas identificadas indicaram que o integumento interno sofre PCD em diferentes graus nas diferentes regiÃes e que nesse tecido hà uma distribuiÃÃo espacial entre catabolismo e anabolismo, pois na regiÃo proximal identificaram-se principalmente hidrolases e na regiÃo distal proteÃnas de reserva e de vias biossintÃticas. A anÃlise de expressÃo de genes teve dois propÃsitos: primeiro, verificar se os nÃveis de transcritos de genes possivelmente relacionados à PCD, cujas proteÃnas foram identificadas e quantificadas na anÃlise proteÃmica, estavam relacionados à abundÃncia de proteÃnas e o segundo foi identificar o local de sÃntese da enzima comprometida na biossÃntese dos Ãsteres de forbol, a sintase do casbeno, atravÃs de um estudo com raiz, folha, embriÃo, integumento interno e endosperma e 14 genes candidatos à enzima mencionada. Os resultados indicaram que as proteÃnas relacionadas à PCD devem ser controladas no Ãmbito transcricional. Nove genes candidatos à sintase do casbeno foram expressos em raiz e um deles foi expresso na folha e no embriÃo. Este trabalho evidencia o papel da PCD no integumento interno para o desenvolvimento da semente, alÃm de demonstrar a natureza transitÃria de reserva desse tecido. Adicionalmente, dà indÃcios de que a semente, apesar de acumular Ãsteres de forbol, nÃo sintetiza esses compostos, mas possivelmente os importa das raÃzes.

O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

A caracterização de vias de sinalização alteradas em células tumorais, e a validação de fármacos inibidores de transdução de sinal que interajam com as mesmas de modo a atuar como terapia principal ou adjuvante no tratamento de neoplasias sólidas e hematopoiéticas, é um campo de grande interesse em oncologia. A necessidade da caracterização de novos alvos moleculares advém da incidência considerável de recidivas, quadros de quimiorresistência e efeitos adversos associados ao tratamento com os agentes antitumorais clássicos. Nesta tese, desenvolvemos a hipótese de que o fator de transcrição NFκB poderia estar envolvido com processos de proliferação, antiapoptose e quimiorresistência em células neoplásicas, caracterizando-se como um potencial alvo para interferência farmacológica. Para isso, avaliamos: i) o papel de NFκB na resposta celular a ERO e no controle da decisão entre morte e proliferação celular; ii) o estado de ativação de NFκB em modelos tumorais in vitro e in vivo; iii) o potencial citotóxico e seletividade dos inibidores de NFκB, seus mecanismos de ação, atividade em células neoplásicas e em linhagens quimiorresistentes. Para isso, foram utilizadas abordagens in vitro (cultivos celulares), in vivo (modelo animal de implante tumoral), e análises de bancos de expressão gênica através de ferramentas de biologia de sistemas. Os resultados demonstraram que NFκB está superestimulado em linhagens de leucemia e de glioblastoma quando comparado com leucócitos e astrócitos não-transformados. O tratamento com inibidores farmacológicos de NFκB causou morte celular programada em um mecanismo seletivo para células tumorais, potenciando os efeitos de antitumorais clássicos tanto em linhagens selvagens quanto em células quimiorresistentes. Além disso, os inibidores BAY117082 e curcumina apresentaram atividade in vivo em modelo animal de glioma sem evidência de citotoxicidade aguda. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o fator de NFκB constitui-se um potencial alvo para inibição farmacológica no tratamento de neoplasias. Neste contexto, a diversidade da expressão de NFκB em diferentes tipos tumorais e a segurança associada ao uso clínico de seus inibidores permanece por ser avaliada. / Characterization of new molecular targets is one of the most important challenges in oncology. In this context, there is a growing interest in characterization of deregulated cell signaling pathways in solid and hematopoietic cancer cells in order to leverage the development of specific cell signaling inhibitors to act as principal or adjuvant therapy, and to circumvent the frequently observed chemoresistance and relapse in cancer patients. In this study, we hypothesized that the transcription factor NFκB could be involved on proliferation, antiapoptosis response and chemoresistance in cancer cells thus being a potential target for pharmacological interference. Attempting to test this, we evaluated: i) the role of NFκB in cell response against reactive oxygen species and in control of cell death and proliferation signaling; ii) NFκB activation status in cancer and noncancerous cells in vitro and in vivo; iii) cytotoxicity, selectivity and mechanisms of action of NFκB inhibitors in glioma and leukemia cells besides its biological activity against chemotherapy-resistant cell lines. Experiments were performed based on in vitro (cancer cell lines and primary cultures) and in vivo (tumor implants) models of cell growth. Moreover, in some experiments, bench-directed analysis of public gene expression databases followed by bioinformatic approach was used to ensure the significance and reliability of experimental data. Our findings showed an overstimulation of NFκB in leukemic and glioblastoma cell lines compared to healthy leucocytes and non-transformed astrocytes, respectively. Treatment with pharmacological inhibitors of NFκB induced programmed cell death in a cancer cells selective manner and potentiated the effects of classical anticancer drugs in both wild-type and chemoresistant cell lines. Indeed, the pharmacological NFκB inhibitors BAY117082 and curcumin showed significant anticancer efficacy in a model of brain-implanted gliomas without evidence of acute toxicity. Overall, the herein presented data suggest that NFκB is a potential target for cell death induction in leukemia and glioblastomas. Evaluation of its expression profile in different type of cancers beyond testing efficacy and safety of NFκB pharmacological inhibitors for clinical usefulness remains to be investigated.

A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em países industrializados e, apesar dos estudos constantes, ainda não existe um tratamento eficaz. Nesse estudo, investigamos o efeito neuroprotetor da boldina, um alcalóide presente nas folhas e casca de Peumus boldus Molina, sobre os danos causados pela isquemia cerebral. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio e glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com boldina nas concentrações de 120 µM e 250 µM diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG de 36% para 20 e 11%, respectivamente. A boldina não apresentou efeito tóxico em condições basais em nenhuma das concentrações testadas. O efeito neuroprotetor da boldina ocorreu apenas quando ela estava presente durante o período de POG, não havendo diferença quando ela foi utilizada somente durante o período de 24 horas de recuperação. O tratamento com boldina durante a POG foi capaz de induzir ativação microglial observada 24 horas após o tratamento através da marcação com isolectina B4. Ela também causou um aumento considerável na produção de espécies reativas, o que pode ser causa ou conseqüência da ativação da microglia. Não foram observadas diferenças na fosforilação das proteínas Akt e GSK-3ß 24 horas após o tratamento e, portanto, alterações nessas proteínas não parecem estar envolvidas com a neuroproteção causada pela boldina. Em conjunto, os resultados sugerem um efeito neuroprotetor promissor da boldina contra os danos causados pela POG, sendo que os mecanismos que desencadeiam esse efeito devem ser melhor elucidados. / Ischemic stroke is among the major causes of mortality and morbidity in industrialized countries and, in spite of several studies, no efficient treatment is available to the patients. In this work, we investigated the neuroprotective effect of boldine, an alkaloid present in leaves and bark of Peumus boldus Molina, against the damage caused by an in vitro lesion that mimics ischemic stroke. For these experiments, we used an in vitro model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in rat organotypic hippocampal slice cultures. Our results showed that the treatment with boldine in the concentrations of 120 µM and 250 µM caused a significant reduction in cellular death after OGD from 36%, observed in OGDvehicle exposed cultures, to 20% and 11%, respectively. Boldine was not cytotoxic in basal conditions in any of the tested concentrations. The neuroprotective effect of boldine was observed when it was present during the period of OGD, showing no difference when it was used only during the recovery period of 24 hours. To elucidate a possible mechanism by which boldine exerts its neuroprotective effect we investigated the microglial activation, production of reactive species and the phosphorylation of Akt and GSK-3b proteins involved in PI3K cell signaling pathway. Our results showed that, when used during the OGD period, boldine 250 µM induced a marked microglial activation, as shown by isolectin B4 binding, increased reactive species production, as shown by DCF-DA oxidation and had no effect on Akt and GSK-3ß phosphorylation. Taken together, the results presented here suggest a promising neuroprotective effect of boldine against the damage caused by OGD, but the mechanism of action of this compound must be better elucidated.

Orientadores: Aníbal Eugênio Vercesi, Róger Frigerio Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T07:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ronchi_JulianaAparecida_M.pdf: 2592293 bytes, checksum: f14b83c15cfc0b7b79f5b89218adf498 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) é caracterizada pela abertura de um poro protéico não seletivo na membrana mitocondrial interna, o qual é induzido por Ca2+ e sensível à ciclosporina A. Trabalhos anteriores do nosso laboratório demonstram que o poro de transição de permeabilidade ocorre devido a ligações entre tióis (S-S) de proteínas, ocasionando a agregação de proteínas de membrana interna. Contrariamente, dados da literatura propõem a participação de proteínas da membrana mitocondrial externa na composição do poro, como o canal aniônico voltagem dependente (VDAC), hexoquinase e receptor benzodiazepínico. Para verificar a participação de proteínas da membrana externa no poro TPM, realizamos experimentos utilizando mitocôndrias desprovidas de membrana externa (mitoplastos). Mitoplastos de fígado e rim de rato foram obtidos através do tratamento de mitocôndrias com o detergente digitonina (seletivo para colesterol) para eliminar a membrana externa. Esses mitoplastos de fígado apresentaram menos que 5% e 10% dos marcadores de membrana externa monoamino oxidase e VDAC, respectivamente. Os mitoplastos de rim apresentaram depleção parcial de hexoquinase (73%). Os mitoplastos tiveram redução de 70% na velocidade de fosforilação do ADP, o que foi parcialmente recuperado pela adição de citocromo c exógeno. Estes mitoplastos foram capazes de gerar e sustentar potencial elétrico de membrana suficiente para fosforilar ADP. Como previsto, os mitoplastos sofreram TPM induzido por Ca2+ de modo semelhante às mitocôndrias. Os mitoplastos foram sensíveis a conhecidos indutores de TPM como Ca2+ e tert-butil hidroperóxido ou inibidores como ciclosporina A, quelantes de Ca2+, ADP, redutor ditiol e ainda catalase. Conjuntamente, nossos resultados indicam que a membrana mitocondrial externa não é necessária para a formação/abertura do poro de TPM. / Abstract: Mitochondrial permeability transition (MPT) is a Ca2+-induced opening of a nonselective proteinaceous membrane pore sensitive to cyclosporin A in the inner membrane. Data from our laboratory provided evidence that MPT is assembled by the aggregation of inner membrane proteins due to the formation of thiol cross-linking. Alternatively, literature data propose the participation of a number of other outer membrane proteins in the composition of the MPT pore, such as, voltage-dependent anion channel (VDAC), hexokinase and the benzodiazepine receptor. In order to ascertain the independence of outer membrane proteins to generate the MPT we performed experiments with mitochondria devoid of outer membrane (mitoplasts). Liver and kidney mitoplasts were obtained by use of cholesterol-specific detergent digitonin to eliminate the outer membrane. Compared with the mitochondria, liver mitoplasts retained less than 5% and 10% of the markers of the outer membrane monoamine oxidase and VDAC, respectively. Kidney mitoplasts also showed a partial depletion of hexokinase (~73%). Mitoplasts presented with a 70% lower oxygen consumption rate during ADP phosphorylation ,which was partially reverted by the addition of exogenous cytochrome c. Mitoplasts were able to generate and sustain a membrane potential high enough to phosphorylate ADP. As hypothesized, these mitoplasts undergo Ca2+ induced MTP with similar properties as compared to intact mitochondria. Mitoplast MPT was sensitive to known permeability transition inducers such as Ca2+ and tert-butyl hydroperoxide and to inhibitors such as cyclosporin A, Ca2+ chelators, ADP, dithiol reductant and catalase. Altogether, the data indicate that the outer membrane is not necessary for MPT assembling or opening. / Mestrado / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Silvana Pereira Barros, Decio dos Santos Pinto Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-09T16:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vaz_SoniaAndradeSilveira_D.pdf: 1101467 bytes, checksum: b3ab61ba8bad61148a6ab70c57bece91 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Muitas pesquisas a respeito do paratormônio (PTH) têm demonstrado que o efeito anabólico (neoformativo) desse peptídeo sobre o tecido ósseo, quando administrado de um modo intermitente, resulta na indução de nódulos de mineralização em cultura de osteoblastos, deposição óssea e aumento da resistência a fraturas em todo o esqueleto. Frente a esses possíveis benefícios, o PTH foi aprovado recentemente pela US Food & Drug Administration (FDA) com o nome genérico de Teriparatide e com o nome comercial de Forteo® (Lilly) que já está sendo comercializado para o tratamento da osteoporose, mas, no entanto ainda vem suscitando grande interesse na comunidade científica, uma vez que o seu complexo mecanismo de ação não está totalmente esclarecido. Relatos científicos indicam que parte do anabolismo do PTH se deve a diferenciação e proliferação dos osteoblastos, aumentando significativamente o número destas células, e parte a um efeito inibidor da apoptose nos osteoblastos. O presente estudo investigou in vitro a capacidade anti-apoptótica do hPTH(1-34) em osteoblastos induzidos à apoptose pelo TNF-a, elegendo como modelo de estudo o cultivo de osteoblastos de calvária de rato. As células foram cultivadas em MEM- a, suplementado com SFB, ácido ascórbico, ß-glicerofosfato e gentamicina, e foram divididas em grupos experimentais que receberam tratamentos diferentes. No grupo I, as células foram induzidas à apoptose, recebendo tratamento com o TNF-a; no grupo II, as células não foram induzidas à apoptose e receberam tratamento intermitente com o hPTH(1-34); no grupo III, as células foram induzidas à apoptose e receberam tratamento com o hPTH(1-34); e no grupo IV, as células não foram induzidas à apoptose e não receberam tratamento com o PTH (controle). Para a detecção da apoptose foram empregados os métodos de exclusão por marcação com o corante azul de Trypan (câmara de Neubauer) e a citometria de fluxo (FACSCalibur). Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística que demonstrou que o tratamento intermitente com o PTH inibiu a apoptose em torno de 60% nos osteoblastos induzidos pelo TNF-a, aumentando, desta forma, o número de osteoblastos / Abstract: It is still not clear why sustained elevation of parathyroid hormone (PTH) stimulates bone resorption, whereas intermittent administration stimulates bone formation. Intermittent PTH administration was recently approved by the United States Food and Drug Administration as the first form of osteoporosis therapy that increases bone mass de novo, reverses the bone deficit, providing a proof-of-principle that osteoblast-targeted (anabolic) agents can effectively reduce osteoporotic fractures. Considering indications that attenuation of osteoblast apoptosis by daily injections of PTH in mice should account for the increased number of osteoblasts and, thereby, the increased bone formation produced by this treatment regimen, in the present study we aimed to investigate the anti-apoptotic ability of hPTH (1-34) in cultured osteoblastic cells through induction by TNF-a in association with PTH anabolic treatment using a calvariaderived osteoblastic cell line. Cells were cultured in MEM-a, supplemented with FBS, ascorbic acid, ß-glycerphosphate and gentamicin, and were divided in experimental groups that received different treatments. In group I, cells were induced to apoptosis, receiveing treatment with TNF-a; in group II, cells were not induced to apoptosis and received intermittent treatment with hPTH(1-34); in group III, cells were induced to apoptosis and received intermittent treatment with hPTH(1-34); and in group IV, cells were not induced to apoptosis and didn¿t receive intermittent treatment with hPTH(1-34) (control). For determination of cell death, two methods were used: staining with Trypan Blue and flow cytometry. The results were statistically analyzed and demonstrated that intermittent treatment with hPTH(1-34) was able to inhibit apoptosis induction by 60%, thereby increasing osteoblast number even in the presence of TNF-a / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Roger Frigerio Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:53:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_KiviaAparecidaPontesde_M.pdf: 1348299 bytes, checksum: 60cf5041b7c98ff265e1fd5399cfef64 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As estatinas são inibidores da 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA (HMG-CoA) redutase usados no tratamento de hipercolesterolemia. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que as estatinas podem ter efeitos anti-cancerígenos. No presente estudo analisamos os mecanismos de toxicidade de sinvastatina e de lovastatina nas linhagens de câncer de próstata LNCaP e PC-3. Curvas dose-resposta do efeito das estatinas (0,1-100 µM) sobre as células LNCaP e PC-3 mostraram efeitos similares e maior sensibilidade das células PC-3 do que das células LNCaP. Tratamentos de células PC-3 com sinvastatina 10 µM durante 48 h induziu morte principalmente por apoptose, a qual foi associada ao aumento de 3 vezes da [Ca2+]cit. Tanto a apoptose quanto o aumento da [Ca2+]cit foram prevenidos por mevalonato 100 µM presente no meio de cultura. Isso indica que a inibição da HMG-CoA redutase leva à apoptose mediada por Ca2+. Pifitrina-a, inibidor da proteína supressora tumoral p53, não preveniu apoptose em células PC-3 (p53 negativas) nem em células LNCaP (p53 positivas). Isso mostrou que a apoptose de células de câncer de próstata induzida por estatinas é independente de p53. Sinvastatina 60 µM induziu morte de células PC-3 principalmente por necrose, a qual foi associada ao aumento de 3 vezes da [Ca2+]cit e à diminuição da respiração e do potencial de membrana mitocondrial. Tanto a necrose quanto a disfunção mitocondrial foram parcialmente prevenidas pelos compostos ciclosporina A (inibidor da transição de permeabilidade mitocondrial [TPM] e da fosfatase calcineurina), FK506 (inibidor de calcineurina) e boncrecato (inibidor da TPM). O aumento da [Ca2+]cit não foi prevenido por ciclosporina A, FK506 ou boncrecato, porém a complexação de Ca2+ citossólico com BAPTA protegeu as células PC-3 da necrose, sugerindo que o aumento da [Ca2+]cit seja um dos primeiros passos no processo de necrose celular, seguido pela ativação da via de calcineurina. Conclui-se que a apoptose induzida por sinvastatina em células PC-3 seja dependente da via do mevalonato enquanto que a necrose seja dependente da via da calcineurina associada à disfunção mitocondrial / Abstract: Statins are 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors used in the treatment of hypercholesterolemia. Both in vitro and in vivo studies have demonstrated that statins may have anti-cancer effects. In the present study we analyzed the mechanisms of simvastatin and lovastatina toxicity to the human prostate cancer cell lines LNCaP and PC-3. Dose-response curves of statins (0.1-100 µM) effects upon LNCaP and PC-3 cells showed similar effects and higher sensitivity of PC-3 than LNCaP cells. Treatments of PC-3 cells with 10 µM simvastatin during 48 h induced death mainly by apoptosis, which was associated with a 3-fold increase in [Ca2+]cyt. Both apoptosis and [Ca2+]cyt increase were prevented by 100 µM mevalonate present in the culture medium. This indicates that the inhibition of HMG-CoA reductase is followed by Ca2+ mediated apoptosis. Pifithrin-a, an inhibitor of tumor suppressor p53 protein, did not prevented apoptosis either in PC-3 (p53 negative) or LNCaP (p53 positive) cells. This showed that apoptosis of prostate cancer cells induced by statins is p53 independent. At 60 µM, simvastatin induced death in PC-3 cells mainly by necrosis, which was associated with a 3-fold increase in PC-3 [Ca2+]cyt, and decrease in both respiration and mitochondrial membrane potential. Both necrosis and mitochondrial dysfunction were partially prevented by the compounds cyclosporine A (mitochondrial permeability transition [MPT] and calcineurin inhibitor), FK506 (calcineurin inhibitor), and bongkrekic acid (MPT inhibitor). Increase in [Ca2+]cyt was not prevented by cyclosporine A, FK506 or bongkrekic acid, but chelation of [Ca2+]cyt with BAPTA protected PC-3 cells from necrosis, suggesting rise in [Ca2+]cyt is one of the first steps in the process of cell necrosis and is followed by activation of the calcineurin pathway. We may conclude that simvastatin-induced apoptosis in PC-3 cells is dependent on the mevalonate pathway whereas necrosis is dependent on the calcineurin pathway associated with mitochondrial dysfunction / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:22:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_AdrieneAlexandra_D.pdf: 2285275 bytes, checksum: e9d86e12d4ac3d041953799c130a314a (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A doença hepática gordurosa não alcoólica (Nonalcoholic fatty liver disease - NAFLD) é a principal manifestação hepática na obesidade e síndrome metabólica. A história natural da doença envolve a esteatose, estresse oxidativo, inflamação, fibrose e morte celular. Níveis plasmáticos elevados de lipoproteínas ricas em triglicérides são fatores de risco independentes para doenças cardiovasculares. Estudos clínicos e experimentais mostram forte correlação entre triglicérides plasmáticos (TG) e os níveis de apolipoproteína CIII. A apolipoproteína CIII também é aumentada no plasma de pacientes diabéticos. Ao comparar camundongos apoCIII transgênicos com controles não transgênicos irmãos (NTg), mostramos aqui que a super-expressão de apoCIII, independentemente da dieta rica em gordura (High fat diet - HFD), resulta em características NAFLD, ou seja, aumento do conteúdo de lípidos no fígado, diminuição poder antioxidante, aumento da expressão de TNF'alfa', receptor de TNF'alfa', caspase-1 clivada e interleucina-1'beta', diminuição do receptor de adiponectina-2 e aumento da morte celular. Além disso, os indicadores de inflamação sistêmica de TNF'alfa' e a proteína C-reactiva estão também elevados em camundongos apoCIII. Esse quadro é agravado e características adicionais da NAFLD são diferencialmente induzidas por HFD em camundongos apoCIII. A HFD induziu intolerância à glicose, juntamente com aumento da gliconeogênese, evidenciando a resistência hepática à insulina, induziu um aumento significativo da TNF'alfa' (8 vezes) e IL-6 (60%) no plasma em camundongos apoCIII comparados aos NTg. Os outros indicadores de inflamação (proteína C reativa plasmática e TNF?, TNFr, caspase-1 e IL-1'beta' hepática) mantiveram-se superiores em camundongos apoCIII em HFD. A ativação da via intrínseca (Bax / Bcl-2) e a proteina efetora (caspase-3) de apoptose foram aumentados em ambos os camundongos apoCIII com low fat diet (LFD) e HFD. Como esperado, o tratamento com fenofibrato reverteu vários dos efeitos da dieta e da apoCIII. No entanto, o fibrato não normalizou o padrão inflamatório nos animais apoCIII, tais como o aumento do TNF'alfa', TNFr, IL1'beta' e redução do adiponectina-R2, mesmo com total correção do teor de lipídios no fígado. Estes resultados indicam que a superexpressão apoCIII desempenha um papel importante na inflamação hepática e na morte celular e aumenta a suscetibilidade e a gravidade da esteatose hepática induzida pela dieta / Abstract: Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the principal liver manifestation in obesity and metabolic syndrome. The natural history of the disease involves steatosis, oxidative stress, inflammation, fibrosis and cell death. Elevated plasma levels of triglyceride-rich remnant lipoproteins are independent cardiovascular disease risk factors. Clinical and experimental studies show strong correlation and causal links between plasma triglycerides (TG) and apolipoprotein CIII levels. Apolipoprotein CIII is also increased in the plasma of diabetic patients. By comparing apolipoprotein (apo) CIII transgenic mice with control non-transgenic (NTg) littermates, we show here that the overexpression of apoCIII, independently of high fat diet (HFD), results in NAFLD features, namely, increased liver lipid content, decreased antioxidant power, increased expression of TNF'alfa', TNF'alfa' receptor, cleaved caspase-1 and interleukin-1'beta', decreased adiponectin receptor-2 and increased cell death. In addition, systemic indicators of inflammation TNF? and C-reactive protein are also elevated in apoCIII mice. This picture is aggravated and additional NAFLD features are differentially induced by HFD in apoCIII mice. HFD induced glucose intolerance together with increased gluconeogenesis, evidencing hepatic insulin resistance. Marked increases in plasma TNF'alfa' (8-fold) and IL-6 (60%) were induced by HFD in apoCIII mice compared to NTg mice. The other inflammatory indicators (plasma C reactive protein, liver TNF'alfa', TNFr, caspase-1 and IL1 'beta') remained higher in HFD apoCIII mice. Cell death signaling (Bax/Bcl2), effector (caspase-3) and apoptosis were augmented in both low and HFD apoCIII mice. As expected, fenofibrate treatment reversed several of the diet and apoCIII effects. However, fibrate did not normalize apoCIII inflammatory traits, such as increased TNF'alfa1, TNFr, IL1'beta' and reduced adiponectin-R2, even under fully corrected liver lipid content. These results indicate that apoCIII overexpression play a major role in liver inflammation and cell death increasing susceptibility to and the severity of diet induced NAFLD / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular