Bone Cancer Research Trust / The full text will be available at the end of the embargo: 6th October 2027

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies. / G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies.

Le récepteur humain de la mélatonine MT1 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). En raison du rôle majeur qu'il joue dans la régulation du rythme circadien, ce récepteur est impliqué dans les troubles du sommeil et la dépression et présente donc un intérêt thérapeutique important. Afin de progresser vers une meilleure caractérisation structurale et fonctionnelle de ce récepteur, nous avons élaboré une stratégie globale visant à générer les échantillons et méthodes nécessaires pour de telles études. Nous avons ainsi mis au point un ensemble original de conditions de production et de purification permettant d'isoler les récepteurs MT1 sous forme relativement pure, homogène et fonctionnelle. Parallèlement, à partir d'un RCPG de référence, le récepteur de l’adénosine A2A, nous avons mis au point un panel de techniques d’analyses biochimiques et biophysiques qui contribuent à une caractérisation fine des récepteurs purifiés et leur interaction avec des ligands. / The human MT1 melatonin receptor belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). It plays a major role in the regulation of circadian rhythm and is involved in sleep disorders and depression. This receptor is thus of significant therapeutic interest. However, very few in vitro studies have been conducted on this receptor and in particular no structural characterization and interactio studies by biophysical methods. In order to progress on these aspects, we developed conditions of production and purification of MT1 receptors for obtaining samples compatible with this type of study. Furthermore, we initiated stabilization tests of the purified receptors. Meanwhile, we have developed biochemical and biophysical analysis techniques to characterize the purified receptors and study their interactions with ligands, on a reference GPCR, the A2A adenosine receptor.

Yes / Despite significant preclinical promise as anticancer agents, vascular-disrupting agents have yet to fulfil their clinical potential due to systemic toxicities. ICT2588 is a tumour-selective MT1-MMP-targeted prodrug of azademethylcolchicine, ICT2552. We investigate activation of ICT2588 and subsequent release of ICT2552 in tumour cells, and examine its ability to induce G2/M cell cycle arrest. We also explore synergism between ICT2588 and ATR inhibition, since colchicine, in addition to its vascular-disrupting properties, is known to induce G2/M arrest, DNA damage, and trigger apoptosis. Several ATR inhibitors are currently undergoing clinical evaluation. The cellular activation of ICT2588 was observed to correlate with MT1-MMP expression, with selective release of ICT2552 not compromised by cellular uptake and prodrug activation mechanisms. ICT2588 induced G2/M arrest, and triggered apoptosis in MT1-MMP-expressing cells, but not in cells lacking MT1-MMP expression, while ICT2552 itself induced G2/M arrest and triggered apoptosis in both cell lines. Interestingly, we uncovered that the intracellular release and accumulation dynamics of ICT2552 subsequent to prodrug activation provided synergism with an ATR inhibitor in a way not observed with direct administration of ICT2552. These findings have important potential implications for clinical combinations of ICT2588 and DNA repair inhibitors.

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