Schätzungsweise 1 – 2 % der europäischen Bevölkerung reagieren allergisch auf bestimmte Lebensmittel. Die verantwortlichen Allergene sind meist Proteine und können während der Lebensmittelverarbeitung, vor allem infolge thermischer Prozesse, erheblich modifiziert werden. Daraus kann sowohl eine Senkung als auch eine Erhöhung des allergenen Potentials resultieren. Insbesondere die Entstehung von sog. „Neoepitopen“ in der Folge der Maillard-Reaktion ist bereits diskutiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Glykierung und dem allergenen Potential von Lebensmitteln, im Speziellen von Karotten und Erdnüssen, untersucht. Die Karottenallergie ist in der europäischen Bevölkerung relativ häufig. Etwa 23 – 25 % aller Nahrungsmittelallergiker leiden an dieser meist pollenassoziierten Allergie. Es ist bekannt, dass das allergene Potential von Karotten durch Hitzebehandlung, infolge der irreversiblen Denaturierung des Hauptallergens Dau c 1, stark gesenkt wird. Daher stellte sich die Frage, ob bestimmte Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) als Indikatoren für die Senkung des allergenen Potentials infolge der Hitzebehandlung geeignet sind. Da zum Ausmaß der Maillard-Reaktion in hitzebehandelten Karotten bisher kaum Daten vorlagen, wurden zunächst Untersuchungen zu relevanten Glykierungsprodukten und zur resultierenden Aminosäuremodifizierung durchgeführt. In verschiedenen Handelsproben (Säfte, Breie, Konserven und getrocknete Karotten) waren neben Fru-Lys die Amadori-Produkte (AP) zahlreicher Aminosäuren, wie Fru-Ala und Fru-GABA nachweisbar. Als Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion (advanced glycation endproducts, AGEs) wurden erstmals Pyrralin, Carboxymethyllysin (CML) und Pentosidin detektiert. Die resultierenden Aminosäure-modifizierungen waren in Produkten mit hohem Wasseranteil (Säfte, Breie sowie Konserven) mit bis zu 5 % gering. Dagegen zeigten getrocknete Karotten sehr hohe Derivatisierungsgrade (z. B. Lysin bis 58 %). Dabei war besonders die frühe Phase der Glykierung von Bedeutung, während die fortgeschrittene Phase kaum eine Rolle spielte. Das AP Fru-Lys bzw. dessen Hydrolyseprodukt Furosin gilt zwar als anerkannter Erhitzungsmarker für Lebensmittel, erwies sich aber in Karottenprodukten aufgrund von schnell stagnierenden Gehalten nur als bedingt geeignet. Insbesondere FM-GABA zeigte eine wesentlich bessere Korrelation mit der Intensität der Hitzebehandlung. Zudem korrelierte der Anstieg dieses AP gut mit der Senkung des Gehaltes an IgE-reaktivem Dau c 1. Damit ist FM-GABA ein geeigneter Parameter sowohl für die Hitzebehandlung von Karotten als auch für die damit verbundene Senkung des allergenen Potentials. Die Erdnussallergie gewinnt mit dem ansteigenden Verzehr von Erdnüssen zunehmend an Bedeutung. Diese Allergie zeichnet sich durch eine mitunter sehr schwere Symptomatik aus, so dass Erdnüsse hinsichtlich lebensbedrohender und letal verlaufender Nahrungsmittel-allergien an erster Stelle stehen. Bereits der Verzehr kleinster Mengen an Erdnuss, selbst Hautkontakt oder Inhalation können eine allergische Reaktion auslösen. Die Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, sind bekanntermaßen stabil und behalten ihr allergenes Potential während der Hitzebehandlung bei. Dennoch besteht die Vermutung, dass die Zubereitung von Erdnüssen deren Allergenität maßgeblich beeinflusst. Daher wurde der Einfluss des Röstens bereits untersucht, jedoch sind die erhaltenen Ergebnisse bisher sehr widersprüchlich. Während in einigen Studien keine Unterschiede zwischen rohen und gerösteten Erdnüssen beobachtet wurden, berichteten andere Autoren von einer 90-fachen Erhöhung des IgE-Bindungsvermögens infolge der Röstung, die mit der Bildung von Neoepitopen durch die Maillard-Reaktion in Verbindung gebracht wurde. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Röstung und insbesondere der Glykierung auf das allergene Potential von Erdnüssen untersucht. Da bisher kaum Daten zu MRP-Gehalten in Erdnüssen vorlagen, wurden zunächst verschiedene handelsübliche Proben (ungeröstete und geröstete Erdnüsse, Erdnussbutter und Erdnussflips) auf ihre Gehalte an Glykierungsprodukten und die resultierende Aminosäure-modifizierung untersucht. Dabei wurde erstmals das AP Fru-Lys und die AGEs Pyrralin und CML identifiziert und quantifiziert. Definierte Erhitzungsexperimente zeigten, dass während der Röstung von Erdnüssen insbesondere Pyrralin in hohen Mengen gebildet wird. Während in erhitzten Lebensmitteln üblicherweise Fru-Lys das dominierende MRP darstellt, trug Pyrralin in gerösteten Erdnüssen in vergleichbarem oder höherem Maße zur Lysinmodifizierung bei als das AP. Aufgrund der stetigen Zunahme ist Pyrralin als Erhitzungsparameter in Erdnüssen wesentlich besser geeignet als das Hydrolyseprodukt Furosin, dessen Gehalt schnell ein Plateau erreichte. Durch die Röstung von Erdnüssen wurden hohe Lysinmodifizierungen bis zu 55 % erreicht, die jedoch nur zu einem Zehntel durch die gemessenen MRP erklärbar waren. Da zahlreiche andere Aminosäuren ebenfalls deutliche Abnahmen zeigten, müssen andere Reaktionen neben der Maillard-Reaktion einen wesentlichen Beitrag zur Aminosäurederivatisierung leisten. Aufgrund des hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um Reaktionen mit Lipidperoxidationsprodukten handeln könnte. Der Einfluss der Röstung auf das allergene Potential der Erdnüsse wurde anhand des Antikörperbindungsvermögens bewertet. Dabei zeigten die Proteinextrakte roher und gerösteter Erdnüsse keine Unterschiede in der IgE-Reaktivität. Jedoch sind aufgrund der schlechten Extrahierbarkeit gerösteter Erdnussproteine keine Rückschlüsse auf das allergene Potential der gesamten Erdnüsse möglich. Vor allem das Allergen Ara h 1 bildete zunächst Di- und Trimere, unter drastischeren Bedingungen kam es zur weiteren Aggregation und damit zur Unlöslichkeit. Analog wurde auch die Löslichkeit aller anderen Erdnussproteine deutlich reduziert. Folglich konnten insbesondere stark modifizierte, aggregierte Proteine mit der verwendeten Extraktionsmethode nicht erfasst werden. Mittels Immunoblot wurde gezeigt, dass das IgE-Bindungsvermögen des Ara h 1 bei der Röstung nicht verändert wurde, solange das Allergen noch löslich war. Aussagen zum allergenen Potential des aggregierten Proteins waren noch nicht möglich. Hingegen wurden deutliche Hinweise auf die Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung erhalten. Um den Einfluss der Maillard-Reaktion im Einzelnen auf die beiden Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, untersuchen zu können, wurden diese Allergene aus rohen Erdnüssen isoliert und unter röstungsrelevanten Bedingungen glykiert. Durch diese Modifizierung wurde deren Antikörperbindungsvermögen jedoch nicht beeinflusst. Folglich liegen keine Hinweise auf die Bildung von Neoepitopen im Zuge der Maillard-Reaktion vor. Die beobachtete Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung ist daher auf andere Reaktionen, vermutlich mit Produkten der Lipidperoxidation, zurückzuführen. Die Grundvoraussetzung für eine allergische Reaktion ist, dass die verantwortlichen Epitope die gastrointestinale Verdauung überstehen und intakt aufgenommen werden. Durch thermische Behandlung und die daraus resultierende Umfaltung sowie kovalente Modifizierung kann die Verdauungsresistenz erheblich beeinflusst werden. Daher wurde mit Hilfe einer simulierten gastrointestinalen Verdauung der Einfluss der Röstung von Erdnüssen sowie der Glykierung von Ara h 1 und Ara h 2 auf die Verdaubarkeit der Allergene untersucht. Diese orientierenden Verdauungsstudien gaben Hinweise auf eine erhöhte Verdauungsresistenz der Proteinaggregate in gerösteten Erdnüssen. Durch Glykierung der Allergene Ara h 1 und Ara h 2 wurde hingegen keine Veränderung der Verdaubarkeit erreicht. Für die hohe Proteolyseresistenz der Proteine in gerösteten Erdnüssen sind offenbar wiederum Reaktionen mit peroxidierten Erdnusslipiden verantwortlich.

Proteingebundene Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) und Crosslink-Aminosäuren (CLAS) werden mit der Nahrung täglich in nicht unerheblichen Mengen aufgenommen. In Humanstudien wurde gezeigt, dass einzelne dieser Produkte resorbiert werden. Die Beteiligung einzelner MRP und CLAS an pathophysiologischen Prozessen wird diskutiert. Im ersten Teil der Arbeit wurden MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, CML, CEL, Pyrralin, MG-H1, Pentosidin) und CLAS (LAL, Glutamyllysin) in Casein angereichert und die Caseine einer simulierten gastrointestinalen Verdauung unterzogen. Mit der posttranslationalen Modifizierung ging eine Verschlechterung der Verdaubarkeit einher. Dies zeigte sich daran, dass während der Verdauung bei zunehmendem Modifizierungsgrad Peptide mit Molmassen > 1000 Da schlechter abgebaut wurden und somit die Bildung von Peptiden < 1000 Da abnahm. Die Verschlechterung der Verdaubarkeit ließ sich vor allem auf die Quervernetzung der Caseine, weniger auf die Modifizierung von Aminosäuren zurückführen. Zudem wurde die Freisetzbarkeit einzelner Aminosäuren durch posttranslationale Modifizierung gesenkt. Dies konnte praktisch ausschließlich auf die Modifizierung von Lysinresten, nicht auf die Quervernetzung, zurückgeführt werden. Vor allem Aminosäuren, die im Casein in der Nähe von Lysinresten überrepräsentiert sind, wurden mit zunehmender Modifizierung schlechter freigesetzt. Die modifizierten Aminosäuren selbst wiesen ein sehr differenziertes Freisetzungsmuster auf. Amadori-Produkte wurden sehr gut freigesetzt, quervernetzende Aminosäuren dagegen nur zu einem geringen Anteil. Als Referenzsubstanzen für chromatographische Messungen und als Testsubstanzen für Inhibitions- und Transportexperimente wurden im zweiten Teil der Arbeit insgesamt 19 freie MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, Tagatoselysin, Ribuloselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, 3-DG-H, PIO, Argpyrimidin, Pentosidin) und CLAS (Lysinoalanin, π- und τ-Histidinoalanin, Ornithinoalanin, Lanthionin) in hohen Ausbeuten synthetisiert und charakterisiert. Zwölf der Produkte (Fructoselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, Argpyrimidin, Lysinoalanin, π- und τ-Histidino¬alanin und N-ε-(γ-Glutamyl)-Lysin) wurden erstmals auch Dipeptidderivate (Ala-Xaa bzw. Xaa-Ala) synthetisiert und charakterisiert. Mithilfe von Kompetitionsexperimenten an Caco-2-Zellen konnte gezeigt werden, dass freie MRP und CLAS die Aufnahme von L-[3H]Lysin kaum hemmten und somit nicht mit Transportsystemen für basische Aminosäuren wechselwirken können. Der überwiegende Teil der dipeptidgebundenen Derivate hemmte jedoch in konzentrationsabhängiger Weise den Transport von [14C]Gly-Sar . Diese Dipeptide stellen somit z.T. hoch affine Inhibitoren des Peptidtransporters dar. Die Affinität zum Transporter ist stark sequenzabhängig. Caco-2-Zellen, die als Monolayer wachsen, wurden auf porösen Polycarbonatmembranen kultiviert und zu Transportstudien eingesetzt. Keines der freien MRP und CLAS wurde aktiv über den Monolayer transportiert. Wurden die Derivate dagegen dipeptidgebunden eingesetzt, stieg, außer bei fructosylierten Peptiden, der transepitheliale Transport stark an. Allerdings wurden die Peptide meist nicht intakt transportiert, sondern intrazellulär gespalten und die freien Aminosäuren basolateral abgegeben. Zum Teil reicherten sich die modifizierten Aminosäuren, besonders die hydrophilen, intrazellulär an. Hydrophobe Aminosäuren (Pyrralin, Formylin, Maltosin, Argpyrimidin) konnten die Zelle dagegen schnell verlassen. Diese Aminosäuren sollten daher auch in vivo effektiv resorbiert werden. In Kompetitionsexperimenten an OK-Zellen zeigte sich, dass modifizierte Aminosäuren auch an Nierenzellen nicht mit Transportsystemen für Lysin wechselwirken. Keine der freien Aminosäuren wurde aktiv über den OK-Zellmonolayer transportiert. Somit ist nicht von einer renalen Reabsorption der untersuchten MRP und CLAS auszugehen.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Dresden.

New Zealand is the world’s third-largest honey exporter by value behind China and Argentina and honey accounts for up to 80 % of New Zealand’s exports. However, it is only the 16th biggest global supplier by volume. Manuka honey from New Zealand is sold for premium prices and merchandised for its health benefits. Because of its exceptional antibacterial effect, there is a strong market demand and the price for a kilogram of manuka honey has tripled in recent years (Ministry for Primary Industries 2015). When consumers are willing to pay prices up to 200 €/kg manuka honey, the risk of misleading advertisement and intended fraud increases. This thesis aims to further characterize manuka honey and contribute to the development of a manuka honey definition. The first part deals with the antibacterial activity of manuka honey. The effect of manuka honey is mainly due to methylglyoxal, whereas the effect of non-manuka honeys is primarily caused by hydrogen peroxide. The objective is to develop a method to quantify the effect solely due to one of the respective chemical compounds and compare their effectiveness. Finally, an evaluation of the contribution of methylglyoxal and hydrogen peroxide to the inhibitory effect of honey should be given. The second part deals with chemical reactions of carbonyl compounds in honey. Because of the reactive nature of carbonyl compounds, the formation of specific glycation compounds in honey is assumed. Since the carbonyl profile of manuka honey differs remarkably from non-manuka honeys, the reaction products are expected to vary widely. Specific compounds, solely present in manuka honey, could serve as quality control parameters to ensure manuka honey authenticity. The final part deals with the metabolism of food-derived carbonyl compounds. Carbonyl compounds, like methylglyoxal or 3-deoxyglucosone are discussed to be potentially toxic to human tissues. Until now, only little is known about the impact of the diet on the physiological carbonyl-load and the metabolism of carbonyl compounds. With the help of nutrition studies and the analysis of body fluids, the question of metabolic transit of carbonyl compounds shall be addressed. The antibacterial studies showed that bacterial species are affected differently by bioactive compounds present in honey. Methylglyoxal (MGO), which is solely present in manuka honeys and hydrogen peroxide, which is formed in most conventional honeys by glucose oxidase, are strong inhibitors of the growth of S. aureus and E. coli. The strain of P. aeruginosa used for this work was not inhibited by MGO, whereas B. subtilis was not inhibited by hydrogen peroxide. To compare and quantify the effect of MGO and hydrogen peroxide, a mathematic model was created. By comparing the slopes of the linearized dose-response curves, it was found that S. aureus, E. coli and P. aeruginosa were more sensitive to hydrogen peroxide than to MGO. However, the natural amounts of MGO in honey are higher than the formation of hydrogen peroxide. Although most bacteria are more sensitive to hydrogen peroxide, MGO is the predominantly antibacterial compound in honey, because of its higher concentrations compared to hydrogen peroxide formation. The inclusion of manuka honey in α-cyclodextrin had only minor consequences on bioavailability and antibacterial activity. The commercial product “Cyclopower” (α-cyclodextrin with manuka honey) does not enhance the antibacterial activity of manuka honey on S. aureus, E. coli and P. aeruginosa. With the help of the newly developed quantitative model, it was shown that the growth of B. subtilis is synergistically inhibited with cyclopower compared to manuka honey and α-cyclodextrin alone. The study of bacterial enzymes as possible targets for bacterial inhibition with manuka honey revealed that MGO and DHA inhibited jack bean urease, which was used as a model for Helicobacter pylori urease. The concentration of MGO and DHA in manuka honey positively correlated with its urease inhibition. Conventional honeys, which lack MGO and DHA, showed significantly less urease inhibition. Based on the unique presence of MGO, manuka honey has extraordinary effects on bacteria, which might lead to further application to fight the emerging crisis of antibacterial resistance to antibiotics. Until now, there is no consistent definition for the term “genuine manuka honey”. In the present work, an approach based on unique chemical reactions in manuka honey was followed. It was shown that the exceptional high amounts of MGO induced the formation of 2-acetyl-1-pyrroline (2-AP). In manuka honey containing ≥ 250 mg/kg MGO, the 2-AP concentration was significantly increased compared to conventional honey. Moreover, honey proteins form MGO-derived reactions products, which were studied by measuring the molecular size of honey proteins. Manuka honey proteins significantly shifted to high molecular weights (HMW) with a size above 510 kDa. The amount of HMW protein in non-manuka honey was significantly lower. The cleavage of disulphide bonds led to a decrease of HMW fraction of conventional honeys but not of manuka honeys. It is hypothesized that MGO cross-linking of proteins is mainly responsible for the formation of HMW adducts in manuka honey. The formation of HMW adducts was also shown with fluorescence analysis, whereby manuka honey proteins had higher fluorescence intensities at λex=350 nm and λem=450 nm compared to non-manuka honeys. The artificial addition of MGO and its precursor dihydroxyacetone (DHA) to a non-manuka honey did not lead to an increased fluorescence up to the level of commercial manuka honeys. The MGO-derived modifications of proteins were further studied by quantifying the protein-bound Maillard reaction products N-ε-carboxyethyllysine (CEL) and methylglyoxal-derived hydroimidazolone 1 (MG-H1) after enzymatic hydrolysis of honey proteins and LC-MS/MS analysis. Their amount was significantly higher in manuka compared to conventional honeys and correlated with the MGO content of the honey. Most of the MGO-derived reactions could be simulated by spiking a conventional honey or a low MGO manuka honey with artificial MGO and subsequent storage at elevated temperatures. Higher storage temperatures were associated with a quick increase of 5-hydroxymethylfurfuraldehyd (HMF). The HMF level in honey is used as a quality parameter and should not exceed 40 mg/kg (Codex Alimentarius Commission, 2001). High concentrations of HMF may point to a fraudulent addition of MGO and the production of artificial high-price manuka honey products. Taken together, the Maillard reaction in honey could be used to control the natural origin of MGO and DHA. The consumption of honey and especially manuka honey exposes humans to high levels of dietary dicarbonyl compounds like MGO and 3-deoxyglucosone (3-DG). Both compounds were discussed as potential risk factors for the development of age-related diseases. The simulated digestion of manuka honey in the presence of gastric and ileal fluids showed that only 9 % of the initial concentration can be recovered after 8 h. The honey matrix had no stabilising effect on MGO compared to a synthetic MGO solution. In contrast to MGO, the manuka honey compound DHA was stable during all simulated digestion steps. The complexation of MGO with α-cyclodextrin did not enhance the stability of MGO. The metabolic transit of dietary MGO and 3-DG was further studied with an intervention study with healthy volunteers, who collected their daily urine. It was shown that urinary concentrations of 3-DG and its less reactive metabolites 3-deoxyfructose (3-DF) and 2-keto-3-deoxygluconic acid (3-DGA), but not MGO, were influenced by the diet. During the intervention studies, up to 40 % of dietary 3-DG was recovered as the sum of 3-DG, 3-DF and 3-DGA. The metabolite 3-DGA only played a minor role in the metabolism of dietary 3-DG in comparison to 3-DF. The concentrations 3-DF and 3-DGA in plasma only increased after the consumption of dietary 3-DG and not after the uptake of carbohydrate rich meals in general. This led to the conclusion that dietary 3-DG is effectively metabolized to 3-DF extracellularly on the apical site of the intestinal epithelium and is resorbed slowly into the circulation. In contrast, 3-DG, which is formed (intracellularly) postprandial from glucose, bypasses this metabolic system and cannot be metabolized as rapidly to 3-DF. Preliminary results obtained with saliva instead of urine as a bio fluid to study the dietary influence of dicarbonyl compounds, confirmed the hypothesis. Based on the present results, dietary dicarbonyl compounds are effectively metabolized during digestion.

Proteingebundene Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) und Crosslink-Aminosäuren (CLAS) werden mit der Nahrung täglich in nicht unerheblichen Mengen aufgenommen. In Humanstudien wurde gezeigt, dass einzelne dieser Produkte resorbiert werden. Die Beteiligung einzelner MRP und CLAS an pathophysiologischen Prozessen wird diskutiert. Im ersten Teil der Arbeit wurden MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, CML, CEL, Pyrralin, MG-H1, Pentosidin) und CLAS (LAL, Glutamyllysin) in Casein angereichert und die Caseine einer simulierten gastrointestinalen Verdauung unterzogen. Mit der posttranslationalen Modifizierung ging eine Verschlechterung der Verdaubarkeit einher. Dies zeigte sich daran, dass während der Verdauung bei zunehmendem Modifizierungsgrad Peptide mit Molmassen > 1000 Da schlechter abgebaut wurden und somit die Bildung von Peptiden < 1000 Da abnahm. Die Verschlechterung der Verdaubarkeit ließ sich vor allem auf die Quervernetzung der Caseine, weniger auf die Modifizierung von Aminosäuren zurückführen. Zudem wurde die Freisetzbarkeit einzelner Aminosäuren durch posttranslationale Modifizierung gesenkt. Dies konnte praktisch ausschließlich auf die Modifizierung von Lysinresten, nicht auf die Quervernetzung, zurückgeführt werden. Vor allem Aminosäuren, die im Casein in der Nähe von Lysinresten überrepräsentiert sind, wurden mit zunehmender Modifizierung schlechter freigesetzt. Die modifizierten Aminosäuren selbst wiesen ein sehr differenziertes Freisetzungsmuster auf. Amadori-Produkte wurden sehr gut freigesetzt, quervernetzende Aminosäuren dagegen nur zu einem geringen Anteil. Als Referenzsubstanzen für chromatographische Messungen und als Testsubstanzen für Inhibitions- und Transportexperimente wurden im zweiten Teil der Arbeit insgesamt 19 freie MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, Tagatoselysin, Ribuloselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, 3-DG-H, PIO, Argpyrimidin, Pentosidin) und CLAS (Lysinoalanin, π- und τ-Histidinoalanin, Ornithinoalanin, Lanthionin) in hohen Ausbeuten synthetisiert und charakterisiert. Zwölf der Produkte (Fructoselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, Argpyrimidin, Lysinoalanin, π- und τ-Histidino¬alanin und N-ε-(γ-Glutamyl)-Lysin) wurden erstmals auch Dipeptidderivate (Ala-Xaa bzw. Xaa-Ala) synthetisiert und charakterisiert. Mithilfe von Kompetitionsexperimenten an Caco-2-Zellen konnte gezeigt werden, dass freie MRP und CLAS die Aufnahme von L-[3H]Lysin kaum hemmten und somit nicht mit Transportsystemen für basische Aminosäuren wechselwirken können. Der überwiegende Teil der dipeptidgebundenen Derivate hemmte jedoch in konzentrationsabhängiger Weise den Transport von [14C]Gly-Sar . Diese Dipeptide stellen somit z.T. hoch affine Inhibitoren des Peptidtransporters dar. Die Affinität zum Transporter ist stark sequenzabhängig. Caco-2-Zellen, die als Monolayer wachsen, wurden auf porösen Polycarbonatmembranen kultiviert und zu Transportstudien eingesetzt. Keines der freien MRP und CLAS wurde aktiv über den Monolayer transportiert. Wurden die Derivate dagegen dipeptidgebunden eingesetzt, stieg, außer bei fructosylierten Peptiden, der transepitheliale Transport stark an. Allerdings wurden die Peptide meist nicht intakt transportiert, sondern intrazellulär gespalten und die freien Aminosäuren basolateral abgegeben. Zum Teil reicherten sich die modifizierten Aminosäuren, besonders die hydrophilen, intrazellulär an. Hydrophobe Aminosäuren (Pyrralin, Formylin, Maltosin, Argpyrimidin) konnten die Zelle dagegen schnell verlassen. Diese Aminosäuren sollten daher auch in vivo effektiv resorbiert werden. In Kompetitionsexperimenten an OK-Zellen zeigte sich, dass modifizierte Aminosäuren auch an Nierenzellen nicht mit Transportsystemen für Lysin wechselwirken. Keine der freien Aminosäuren wurde aktiv über den OK-Zellmonolayer transportiert. Somit ist nicht von einer renalen Reabsorption der untersuchten MRP und CLAS auszugehen.

Schätzungsweise 1 – 2 % der europäischen Bevölkerung reagieren allergisch auf bestimmte Lebensmittel. Die verantwortlichen Allergene sind meist Proteine und können während der Lebensmittelverarbeitung, vor allem infolge thermischer Prozesse, erheblich modifiziert werden. Daraus kann sowohl eine Senkung als auch eine Erhöhung des allergenen Potentials resultieren. Insbesondere die Entstehung von sog. „Neoepitopen“ in der Folge der Maillard-Reaktion ist bereits diskutiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Glykierung und dem allergenen Potential von Lebensmitteln, im Speziellen von Karotten und Erdnüssen, untersucht. Die Karottenallergie ist in der europäischen Bevölkerung relativ häufig. Etwa 23 – 25 % aller Nahrungsmittelallergiker leiden an dieser meist pollenassoziierten Allergie. Es ist bekannt, dass das allergene Potential von Karotten durch Hitzebehandlung, infolge der irreversiblen Denaturierung des Hauptallergens Dau c 1, stark gesenkt wird. Daher stellte sich die Frage, ob bestimmte Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) als Indikatoren für die Senkung des allergenen Potentials infolge der Hitzebehandlung geeignet sind. Da zum Ausmaß der Maillard-Reaktion in hitzebehandelten Karotten bisher kaum Daten vorlagen, wurden zunächst Untersuchungen zu relevanten Glykierungsprodukten und zur resultierenden Aminosäuremodifizierung durchgeführt. In verschiedenen Handelsproben (Säfte, Breie, Konserven und getrocknete Karotten) waren neben Fru-Lys die Amadori-Produkte (AP) zahlreicher Aminosäuren, wie Fru-Ala und Fru-GABA nachweisbar. Als Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion (advanced glycation endproducts, AGEs) wurden erstmals Pyrralin, Carboxymethyllysin (CML) und Pentosidin detektiert. Die resultierenden Aminosäure-modifizierungen waren in Produkten mit hohem Wasseranteil (Säfte, Breie sowie Konserven) mit bis zu 5 % gering. Dagegen zeigten getrocknete Karotten sehr hohe Derivatisierungsgrade (z. B. Lysin bis 58 %). Dabei war besonders die frühe Phase der Glykierung von Bedeutung, während die fortgeschrittene Phase kaum eine Rolle spielte. Das AP Fru-Lys bzw. dessen Hydrolyseprodukt Furosin gilt zwar als anerkannter Erhitzungsmarker für Lebensmittel, erwies sich aber in Karottenprodukten aufgrund von schnell stagnierenden Gehalten nur als bedingt geeignet. Insbesondere FM-GABA zeigte eine wesentlich bessere Korrelation mit der Intensität der Hitzebehandlung. Zudem korrelierte der Anstieg dieses AP gut mit der Senkung des Gehaltes an IgE-reaktivem Dau c 1. Damit ist FM-GABA ein geeigneter Parameter sowohl für die Hitzebehandlung von Karotten als auch für die damit verbundene Senkung des allergenen Potentials. Die Erdnussallergie gewinnt mit dem ansteigenden Verzehr von Erdnüssen zunehmend an Bedeutung. Diese Allergie zeichnet sich durch eine mitunter sehr schwere Symptomatik aus, so dass Erdnüsse hinsichtlich lebensbedrohender und letal verlaufender Nahrungsmittel-allergien an erster Stelle stehen. Bereits der Verzehr kleinster Mengen an Erdnuss, selbst Hautkontakt oder Inhalation können eine allergische Reaktion auslösen. Die Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, sind bekanntermaßen stabil und behalten ihr allergenes Potential während der Hitzebehandlung bei. Dennoch besteht die Vermutung, dass die Zubereitung von Erdnüssen deren Allergenität maßgeblich beeinflusst. Daher wurde der Einfluss des Röstens bereits untersucht, jedoch sind die erhaltenen Ergebnisse bisher sehr widersprüchlich. Während in einigen Studien keine Unterschiede zwischen rohen und gerösteten Erdnüssen beobachtet wurden, berichteten andere Autoren von einer 90-fachen Erhöhung des IgE-Bindungsvermögens infolge der Röstung, die mit der Bildung von Neoepitopen durch die Maillard-Reaktion in Verbindung gebracht wurde. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Röstung und insbesondere der Glykierung auf das allergene Potential von Erdnüssen untersucht. Da bisher kaum Daten zu MRP-Gehalten in Erdnüssen vorlagen, wurden zunächst verschiedene handelsübliche Proben (ungeröstete und geröstete Erdnüsse, Erdnussbutter und Erdnussflips) auf ihre Gehalte an Glykierungsprodukten und die resultierende Aminosäure-modifizierung untersucht. Dabei wurde erstmals das AP Fru-Lys und die AGEs Pyrralin und CML identifiziert und quantifiziert. Definierte Erhitzungsexperimente zeigten, dass während der Röstung von Erdnüssen insbesondere Pyrralin in hohen Mengen gebildet wird. Während in erhitzten Lebensmitteln üblicherweise Fru-Lys das dominierende MRP darstellt, trug Pyrralin in gerösteten Erdnüssen in vergleichbarem oder höherem Maße zur Lysinmodifizierung bei als das AP. Aufgrund der stetigen Zunahme ist Pyrralin als Erhitzungsparameter in Erdnüssen wesentlich besser geeignet als das Hydrolyseprodukt Furosin, dessen Gehalt schnell ein Plateau erreichte. Durch die Röstung von Erdnüssen wurden hohe Lysinmodifizierungen bis zu 55 % erreicht, die jedoch nur zu einem Zehntel durch die gemessenen MRP erklärbar waren. Da zahlreiche andere Aminosäuren ebenfalls deutliche Abnahmen zeigten, müssen andere Reaktionen neben der Maillard-Reaktion einen wesentlichen Beitrag zur Aminosäurederivatisierung leisten. Aufgrund des hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um Reaktionen mit Lipidperoxidationsprodukten handeln könnte. Der Einfluss der Röstung auf das allergene Potential der Erdnüsse wurde anhand des Antikörperbindungsvermögens bewertet. Dabei zeigten die Proteinextrakte roher und gerösteter Erdnüsse keine Unterschiede in der IgE-Reaktivität. Jedoch sind aufgrund der schlechten Extrahierbarkeit gerösteter Erdnussproteine keine Rückschlüsse auf das allergene Potential der gesamten Erdnüsse möglich. Vor allem das Allergen Ara h 1 bildete zunächst Di- und Trimere, unter drastischeren Bedingungen kam es zur weiteren Aggregation und damit zur Unlöslichkeit. Analog wurde auch die Löslichkeit aller anderen Erdnussproteine deutlich reduziert. Folglich konnten insbesondere stark modifizierte, aggregierte Proteine mit der verwendeten Extraktionsmethode nicht erfasst werden. Mittels Immunoblot wurde gezeigt, dass das IgE-Bindungsvermögen des Ara h 1 bei der Röstung nicht verändert wurde, solange das Allergen noch löslich war. Aussagen zum allergenen Potential des aggregierten Proteins waren noch nicht möglich. Hingegen wurden deutliche Hinweise auf die Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung erhalten. Um den Einfluss der Maillard-Reaktion im Einzelnen auf die beiden Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, untersuchen zu können, wurden diese Allergene aus rohen Erdnüssen isoliert und unter röstungsrelevanten Bedingungen glykiert. Durch diese Modifizierung wurde deren Antikörperbindungsvermögen jedoch nicht beeinflusst. Folglich liegen keine Hinweise auf die Bildung von Neoepitopen im Zuge der Maillard-Reaktion vor. Die beobachtete Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung ist daher auf andere Reaktionen, vermutlich mit Produkten der Lipidperoxidation, zurückzuführen. Die Grundvoraussetzung für eine allergische Reaktion ist, dass die verantwortlichen Epitope die gastrointestinale Verdauung überstehen und intakt aufgenommen werden. Durch thermische Behandlung und die daraus resultierende Umfaltung sowie kovalente Modifizierung kann die Verdauungsresistenz erheblich beeinflusst werden. Daher wurde mit Hilfe einer simulierten gastrointestinalen Verdauung der Einfluss der Röstung von Erdnüssen sowie der Glykierung von Ara h 1 und Ara h 2 auf die Verdaubarkeit der Allergene untersucht. Diese orientierenden Verdauungsstudien gaben Hinweise auf eine erhöhte Verdauungsresistenz der Proteinaggregate in gerösteten Erdnüssen. Durch Glykierung der Allergene Ara h 1 und Ara h 2 wurde hingegen keine Veränderung der Verdaubarkeit erreicht. Für die hohe Proteolyseresistenz der Proteine in gerösteten Erdnüssen sind offenbar wiederum Reaktionen mit peroxidierten Erdnusslipiden verantwortlich.

Die Maillard-Reaktion und ihre Produkte (MRPs) sind aus der Lebensmittelchemie bekannt. Der Nachweis der Derivate in physiologischen Medien und die Beobachtung erhöhter Gehalte im Zusammenhang mit Alterungsgeschehen und Stoffwechselerkrankungen führte zur Diskussion möglicher pathophysiologischer Konsequenzen in vivo. Auf diesem Hintergrund stellt sich die Frage nach der Relevanz der täglichen Nahrung als MRP-Quelle. Grundlage zur Beurteilung sind quantitative Daten zum Vorkommen der Verbindungen in Lebensmitteln. Heterogenität und Vielzahl der Produkte machen die Betrachtung individueller und die Berücksichtigung noch unbekannter Derivate notwendig. Durch Bestimmung von Lysin, dem Amadori-Produkt (AP) Ne-Desoxylactulosyl-1-lysin, Pyrralin, Ne-Carboxymethyllysin (CML), Glyoxal- und Methylglyoxal-Lysin-Dimer (GOLD, MOLD) und 2-Amino-6-(3-hydroxy-2-methyl-4-oxo-4H-pyridin-1-yl)-hexansäure (Maltosin) in verschiedenen Milchprodukten konnte gezeigt werden, dass AP das Hauptprodukt der Lysinderivatisierung in diesen Proben darstellt. CML und Pyrralin gewannen mit zunehmender Erhitzung an Bedeutung, wobei Pyrralin auch in den stark thermisch behandelten Proben nur in relativ geringen Mengen gebildet wird. GOLD und MOLD waren nicht nachweisbar. Mit den erfassten Derivaten konnte nur ein Teil, 40-50 % in flüssigen Proben, der Lysinmodifizierung erklärt werden. Es kommt demnach in erheblichem Maße zur Bildung weiterer in Nahrungsmitteln noch nicht erfasster Derivate. Das hier erstmals in Lebensmitteln quantifizierte Maltosin leistet keinen relevanten Beitrag zur weiteren Aufklärung der Lysinmodifizierung, da es erst in sehr stark erhitzten Produkten und in deutlich geringeren Mengen als Pyrralin entsteht. Zur Beurteilung der ernährungsphysiologischen Relevanz alimentärer MRPs sind neben der zugeführten Menge deren Resorbierbarkeit und Elimination aus dem Körper von Interesse. Anhand der renalen Exkretion definierter Lysinderivate in Abhängigkeit von der nahrungsbedingten Zufuhr sollten Aussagen zu deren metabolischem Transit getroffen werden. Es wurde eine Ernährungsstudie durchgeführt, in der die Probanden zunächst auf MRP-haltige Lebensmittel verzichteten, dann, bis auf eine Kontrollgruppe, Mahlzeiten mit bekannten Gehalten verzehrten und im Anschluss wieder MRPfrei lebten. Die 24h-Urinproben der Teilnehmer wurden hinsichtlich der Gehalte an freiem AP, Pyrralin, CML und Pentosidin untersucht. Die Gehalte lagen für AP, Pyrralin und CML in der Größenordnung weniger mg pro Tag, für Pentosidin dagegen nur bei wenigen µg pro Tag. Der Verzicht auf MRP-haltige Nahrung führte innerhalb von 48 bis 72 h zum Absinken der Gehalte auf ein Basislevel. Es zeigte sich, dass mehr als 85 % des AP, ca. 90 % des Pyrralins aber nur 30 bis 40 % des Pentosidins im Urin aus alimentären Quellen stammen. AP, Pyrralin und Pentosidin werden demnach grundsätzlich aus der Nahrung resorbiert und über die Nieren eliminiert. Im Gegensatz zu Literaturberichten waren die im Urin messbaren CML-Gehalte durch die MRP-freie Diät nicht beeinflussbar, was auf eine geringe oder fehlende proteolytische Freisetzung und/oder schlechtere Resorbierbarkeit der Verbindung hindeutet. Nach Verzehr definierter MRP-Mengen zeigten sich stark unterschiedliche Wiederfindungen. Während freies Pentosidin und proteingebundenes Pyrralin nahezu vollständig bzw. zum überwiegenden Teil (50 bis 60 %) über den Urin eliminiert werden, trifft dies nur auf einen geringen Prozentsatz des proteingebundenen Pentosidins (2 %) und des AP (&amp;lt;3 %) zu. Eine ernährungsphysiologische Beurteilung kann demnach nur nach Kenntnis der im Lebensmittel enthaltenen Derivate und deren individuellen metabolischen Transits erfolgen. Ausgehend von der vorliegenden Arbeit und der Literatur ist das von der Nahrung ausgehende Gefährdungspotential als gering anzusehen. Zu berücksichtigen bleibt, dass ein großer Teil der MRPs noch immer unbekannt ist, ernährungsphysiologische Konsequenzen damit nicht abschließend einzuschätzen sind.

The Maillard reaction is a network of different non-enzymatic reactions between carbonyl groups of reducing sugars and amino groups from amino acids, peptides, or proteins, which progresses in three major stages and originates a very heterogeneous mixture of reaction products. It is also known as non-enzymatic browning, due to the brown macromolecular pigments formed in the final stage of the reaction. The chemistry underlying the Maillard reaction is complex. It encloses not only one reaction pathway, but a whole network of various transformations. As virtually all foods contain both proteins and carbohydrates, Maillard reaction products are present in the daily diet in considerable amounts. The endogenous formation of Maillard reaction products, especially related to ageing and diabetes, aroused intense discussions about the health consequences of the “glycation”, the term that describes the in vivo reaction corresponding to the Maillard reaction in foods. Melanoidins are the final brown products of the Maillard reaction. They are responsible for the color formed during the heat processing of foods like coffee, bread, malt, and beef. Melanoidins are high molecular weight polydisperse polymers containing nitrogen. Their structure is largely unknown. Coffee melanoidins, which are object of the present study, contain thermally transformed polysaccharides, proteins, and phenolic compounds. Since the mechanisms involved on the formation of these macromolecules, and the chemical transformations which take place during the heat treatment are not completely elucidated, key structural features were analyzed. Especially the incorporation of chlorogenic acids in the melanoidin skeleton was object of attention of the present work. Another major aim of this work was to investigate the influence of the Maillard reaction on the inhibitory potential of food components against zinc metalloproteases. The studied enzymes were three human matrix metalloproteases (MMP-1, -2 and -9), which are able to degrade matrix proteins and participate in many physiological processes, including tissue turnover and repair, but also constitute important targets in malignant and degenerative diseases. A microbial collagenase from Chlostridium histolyticum was chosen due to its subtract similarity to MMPs. Furthermore, Angiotensin Converting Enzyme (ACE), which plays a central role in cardiovascular pathologies such as hypertension and cardiac hypertrophy, was investigated. As a prototypical Maillard reaction product, coffee melanoidin was adopted. Due to the roast dependent inhibitory activity of the coffee melanoidin fractions against matrix metalloproteases, the functionalization caused by the non-enzymatic browning was closer investigated. Na-carboxyalkylated derivatives of a sequence of relevant peptides were synthesized, in a variation of the process-induced formation of Nε-carboxymethyllysine, a major advanced glycation end-product (AGE). The inhibitory activity against zinc metalloproteases of the sequence of selected peptides and their Na-carboxymethyl- (CM-) and Na-carboxyethyl- (CE-) derivates was investigated.

Milch dient der Versorgung neugeborener Säugetiere mit allen lebensnotwendigen Nährstoffen, wie Proteinen, Fetten, Kohlenhydraten, Vitaminen und Mineralstoffen. Insbesondere die Proteingruppe der Caseine, die in der Milch zum Großteil zu Caseinmicellen assoziiert vorliegen, stellen essentielle Aminosäuren bereit und transportieren große Mengen Calcium und Phosphor (Fox, 2008; Horne, 2008). Neben der Bedeutung als erste Nahrungsquelle für Neugeborene haben sich Milch und Milchprodukte zu einem der wichtigsten Handels- und Verarbeitungsgüter entwickelt. In Deutschland ist vorrangig der Konsum von Kuhmilch verbreitet. Zunehmend wird aber auch die Milch von Büffel, Schaf und Ziege direkt oder verarbeitet konsumiert (Fox, 2008; Töpel, 2016). Dabei unterscheidet sich die Zusammensetzung der Milch zwischen den verschiedenen Tierarten zum Teil beträchtlich. Diese Unterschiede betreffen nicht nur die Anteile der Hauptnährstoffe, sondern auch die Eigenschaften und die Zusammensetzung der Caseinmicellen (CM) (Fox, 2008). Die Eigenschaften und die Stabilität gegenüber einer Calciumkomplexierung wurden für bovine Caseinmicellen in der Literatur bereits ausführlich diskutiert (Horne, 1984; Banon & Hardy, 1992; Needs et al., 2000; O’Connell et al., 2001; Huppertz et al., 2004). Über die Micellen anderer Tierarten lagen zu Beginn der Untersuchungen hingegen kaum Informationen vor. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die Caseinmicellen aus der Milch der wiederkäuenden Paarhufer Kuh, Büffel, Schaf, Ziege und Kamel und der nicht wiederkäuenden Unpaarhufer Pferd und Esel sowie aus Humanmilch bezüglich Größe, Struktur, Zusammensetzung und Stabilität zu charakterisieren und daraus Erkenntnisse zum tierartspezifischen Micellaufbau abzuleiten. Hierzu wurden die Caseinmicellen mit Hilfe der Ultrazentrifugation von der Molke abgetrennt und in tierartspezifischem, synthetischem Milchultrafiltrate (SMUF) resuspendiert. Untersuchungen der hydrodynamischen Durchmesser mittels dynamischer Lichtstreuung zeigten, dass die CM der Nicht-Wiederkäuer Stute und Esel sowie des Kamels deutlich größer waren als die der Wiederkäuer Kuh, Büffel, Schaf und Ziege, wohingegen sich die humanen CM als die kleinsten zeigten. Mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) konnten aufgrund der beobachteten unterschiedlichen Oberflächenstrukturen für einige Tierarten Hinweise hinsichtlich einer größen- und κ-Casein-abhängigen Ausbildung von κ Casein ‚bunches‘ oder einer ‚hairy layer‘ an der Oberfläche der kolloidalen Partikel erhalten werden. Anhand der Aminosäurezusammensetzung der micellaren Proteine konnte abgeleitet werden, dass bei allen Tierarten vor allem Phosphoserin sowie die hydrophoben Aminosäuren maßgeblich am Aufbau der CM beteiligt sein dürften. Hierbei wurden jedoch tierartspezifische Unterschiede festgestellt. Bei den Wiederkäuern wurde eine besonders starke Assoziation der Caseinmonomere über Phosphoserincluster vermutet, während bei den Nicht-Wiederkäuern und insbesondere bei den humanen CM auch hydrophobe Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle spielen. Calcium und anorganischer Phosphor konnten als die bedeutendsten micellaren Salze identifiziert werden, die in besonders hohen Gehalten in den CM von Stute und Esel vorkamen. Humane Micellen wiesen deutlich niedrigere Mineralstoffgehalte auf, weshalb die Bedeutung der elektrostatischen Wechselwirkungen für die Verknüpfung der Caseinmonomere geringer eingeschätzt wurde als bei den weiteren untersuchten Tierarten. In Bezug auf die Stabilität gegenüber einer Calciumkomplexierung mit Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N\',N\'-tetraessigsäure (EGTA) unterschieden sich die CM der Tiere sehr deutlich voneinander. Instabile Micellen zeichneten sich durch eine starke Abnahme der Trübung, eine Zunahme des extra-micellaren Caseins sowie eine schneller einsetzende Verkleinerung des hydrodynamischen Durchmessers aus. Für die Micellstabilität ergab sich die folgende Reihenfolge: Kuh << Büffel < Ziege < Schaf < Kamel = Stute < Esel < Mensch. Caseinmicellen eignen sich, neben dem natürlichen Transport von Aminosäuren und Mineralstoffen, als Nanotransporter für bioaktive Substanzen wie Vitamin D2 (Semo et al., 2007), β-Carotin (Sáiz-Abajo et al., 2013), Curcumin (Sahu et al., 2008), Triclosan (Roach et al., 2009) oder auch dem antibakteriellen Enzym Lysozym (de Roos et al., 1998; Anema & de Kruif, 2013). Da zu Beginn der Untersuchungen ausschließlich Daten zur Beladung boviner Caseinmicellen mit Hühnereiweißlysozym (HEWL) verfügbar waren, sollte zunächst die Stabilität der tierartspezifischen Micellen und die Effektivität der Beladung mit Lysozym beurteilt werden. Zusätzlich sollte die antibakterielle Wirksamkeit der mit Lysozym beladenen Caseinmicellen verschiedener Säugetiere sowohl in vitro als auch in orientierenden Untersuchungen gegenüber Bakterien erfasst werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass die CM aller untersuchten Tierarten mit HEWL beladen werden können. Hinsichtlich der Stabilität der CM sowie der Aufnahmekapazität wurden jedoch tierartspezifische Unterschiede festgestellt. Allgemein konnten die CM aus Wiederkäuer- und aus Humanmilch als stabiler beschrieben werden, wobei die HEWL-Aufnahme bei den CM der Wiederkäuer höher war. Die lytische Enzymaktivität des HEWL in vitro veränderte sich infolge der Micellassoziation für die meisten untersuchten Tierarten im Vergleich zu frei vorliegendem HEWL nicht. Für die antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Bacillus subtilis wurden hingegen Unterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Für die HEWL-haltigen CM von Büffel und Ziege ergaben sich die gleichen Wachstumsverzögerungen wie bei freiem HEWL in SMUF. Im Gegensatz dazu wurde die bakteriostatische Wirkung durch die HEWL-Micellen von Kuh, Kamel und Mensch inhibiert, durch die von Schaf, Stute und Esel hingegen verstärkt. Neben der Funktionalisierung der Caseinmicellen durch den Einbau bioaktiver Substanzen, können die Partikel auch chemisch modifiziert werden. Eine Möglichkeit stellt hierbei die Glykierung dar. Glykierungsreaktionen zwischen den Carbonylgruppen reduzierender Zucker und Aminosäureseitenketten wurden für nicht-micellare Caseine in einer Vielzahl an Studien untersucht (Zin El-Din & Aoki, 1993; Morales & van Boekel, 1996; Pellegrino et al., 1999; Lima et al., 2009; Akıllıoğlu & Gökmen, 2014). Über den Einfluss der micellaren Anordnung der Caseine auf die Glykierungsreaktionen war nur wenig bekannt. Erkenntnisse diesbezüglich könnten einen Beitrag zur Aufklärung des Aufbaus der Caseinmicellen leisten. Die Untersuchungen zeigten, dass bei der Erhitzung von micellaren und nicht-micellaren Caseinen für 0 - 4 h bei 100 °C in Gegenwart der reduzierenden Zucker Lactose und Glucose hauptsächlich die frühe Phase der Maillard Reaktion abläuft. Die Bildung der Amadori-Produkte erfolgte dabei in den CM und im nicht micellaren Natrium-Caseinat (NaCas) in gleichem Maße. Hieraus wurde eine ähnliche Zugänglichkeit der reaktiven Aminosäureseitenketten in den micellaren und nicht micellaren Caseinen geschlussfolgert. Signifikante Unterschiede konnten hinsichtlich der Produktbildung der späten Phase der Maillard-Reaktion beobachtet werden. Während Nε-Carboxymethyllysin (CML) im NaCas in höheren Gehalten detektiert wurde, trat in den CM eine verstärkte Pyrralin-Bildung auf. Zudem bewirkte eine Inkubation in Gegenwart von Lactose eine bevorzugte CML-Bildung, wohingegen mit Glucose Pyrralin in höheren Mengen gebildet wurde. Die Maillard-induzierten Proteinquervernetzungsprodukte Glyoxal-Lysin-Dimer und Pentosidin wurden im Vergleich zum zuckerunabhängig gebildeten Lysinoalanin in deutlich geringeren Gehalten erfasst. Hohe Oligomerisierungsgrade zwischen 50 und 84 % zeigten jedoch, dass die Proteinquer-vernetzungen, die im Zuge der Glykierung entstehen, quantitativ von größerer Bedeutung sind. Anhand der Bestimmung der hydrodynamischen Durchmesser und mit Hilfe von REM-Aufnahmen konnte eine weitgehend intra-micellare Proteinquervernetzung abgeleitet werden. Die Ausbildung intra-micellarer Oligomere bewirkte dabei eine höhere Micellstabilität gegenüber einem Calciumentzug durch EGTA. Die vorliegenden Untersuchungen deuten darauf hin, dass die hydrophilen Zuckermoleküle über die von Dalgleish (2011) vorgeschlagenen Wasserkanäle in die CM eindringen und die frühe Phase der Maillard-Reaktion anschließend vor allem in diesen Regionen erfolgt. Die weiteren Phasen der Maillard-Reaktion könnten dann, durch ein tieferes Eindringen der reaktiven Komponenten, zunehmend auch in dehydratisierteren Bereichen ablaufen. Bezüglich des Aufbaus der Caseinmicellen unterstützen die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse die Vorstellungen des Internal Structure Modells.

The Maillard reaction is a network of different non-enzymatic reactions between carbonyl groups of reducing sugars and amino groups from amino acids, peptides, or proteins, which progresses in three major stages and originates a very heterogeneous mixture of reaction products. It is also known as non-enzymatic browning, due to the brown macromolecular pigments formed in the final stage of the reaction. The chemistry underlying the Maillard reaction is complex. It encloses not only one reaction pathway, but a whole network of various transformations. As virtually all foods contain both proteins and carbohydrates, Maillard reaction products are present in the daily diet in considerable amounts. The endogenous formation of Maillard reaction products, especially related to ageing and diabetes, aroused intense discussions about the health consequences of the “glycation”, the term that describes the in vivo reaction corresponding to the Maillard reaction in foods. Melanoidins are the final brown products of the Maillard reaction. They are responsible for the color formed during the heat processing of foods like coffee, bread, malt, and beef. Melanoidins are high molecular weight polydisperse polymers containing nitrogen. Their structure is largely unknown. Coffee melanoidins, which are object of the present study, contain thermally transformed polysaccharides, proteins, and phenolic compounds. Since the mechanisms involved on the formation of these macromolecules, and the chemical transformations which take place during the heat treatment are not completely elucidated, key structural features were analyzed. Especially the incorporation of chlorogenic acids in the melanoidin skeleton was object of attention of the present work. Another major aim of this work was to investigate the influence of the Maillard reaction on the inhibitory potential of food components against zinc metalloproteases. The studied enzymes were three human matrix metalloproteases (MMP-1, -2 and -9), which are able to degrade matrix proteins and participate in many physiological processes, including tissue turnover and repair, but also constitute important targets in malignant and degenerative diseases. A microbial collagenase from Chlostridium histolyticum was chosen due to its subtract similarity to MMPs. Furthermore, Angiotensin Converting Enzyme (ACE), which plays a central role in cardiovascular pathologies such as hypertension and cardiac hypertrophy, was investigated. As a prototypical Maillard reaction product, coffee melanoidin was adopted. Due to the roast dependent inhibitory activity of the coffee melanoidin fractions against matrix metalloproteases, the functionalization caused by the non-enzymatic browning was closer investigated. Na-carboxyalkylated derivatives of a sequence of relevant peptides were synthesized, in a variation of the process-induced formation of Nε-carboxymethyllysine, a major advanced glycation end-product (AGE). The inhibitory activity against zinc metalloproteases of the sequence of selected peptides and their Na-carboxymethyl- (CM-) and Na-carboxyethyl- (CE-) derivates was investigated.:LIST OF CONTENTS I LIST OF TABLES IV LIST OF FIGURES V LIST OF ABBREVIATIONS VII 1 INTRODUCTION 1 2 BACKGROUND 3 2.1 Maillard reaction in food 3 2.1.1 Melanoidins 8 2.2 Coffee 11 2.2.1 General aspects 11 2.2.1.1 Coffee production 12 2.2.1.2 General chemical composition 14 2.2.1.3 Coffee and health 20 2.2.2 Coffee melanoidins 24 2.2.2.1 Chemistry of coffee melanoidins 24 2.2.2.2 Properties of coffee melanoidins 29 2.3 Zinc metallopeptidases 32 2.3.1 Matrix metalloproteinases (MMPs) 33 2.3.1.1 Functions of MMPs 35 2.3.1.2 Structure of MMPs 37 2.3.1.3 Inhibition of MMPs 39 2.3.2 Clostridium histolyticum collagenase (ChC) 43 2.3.2.1 Functions of ChC 43 2.3.2.2 Structure of ChC 43 2.3.2.3 Inhibition of ChC 44 2.3.3 Agiotensin converting enzyme (ACE) 45 2.3.3.1 Functions of ACE 45 2.3.3.2 Structure of ACE 46 2.3.3.3 Inhibition of ACE 48 3 EXPERIMENTAL SECTION 50 3.1 Chemicals, materials and equipment 50 3.1.1 Chemicals 50 3.1.2 Material 52 3.1.3 Equipment 52 3.1.4 Solutions 54 3.2 Synthesis of Nα-carboxyalkylated peptides 55 3.2.1 Nα-carboxyalkylation of GP, LL, IA, GA, GL, AP, IP and IPP by reductive alkylation 55 3.2.2 Nα-carboxyalkylation of IW using sodium cyanoborohydride 56 3.3 Purification 57 3.3.1 Ion Exchange Chromatographic purification 57 3.3.1.1 Spotting test 58 3.3.2 HPLC purification of CM-IW 58 3.3.3 Overview of the synthesis and elution conditions 59 3.4 Characterization of carboxyalkylated peptides 61 3.4.1 Mass spectrometry 61 3.4.2 Elemental Analysis 61 3.4.3 Analytical characteristics of carboxyalkylated peptides 62 3.5 Preparation of coffee fractions 65 3.5.1 Roasting conditions 65 3.5.2 Fractionation of coffee samples: Isolation of coffee melanoidins 67 3.6 Structural studies 69 3.6.1 Estimation of the molecular weight 69 3.6.2 C/N ratio 70 3.6.3 Amino acid analysis 70 3.6.3.1 Acid hydrolysis 70 3.6.3.2 General amino acid analysis 70 3.6.3.3 Lysinoalanine 71 3.6.3.4 Pentosidine 72 3.6.4 Total phenols 74 3.6.5 Raman spectroscopy 74 3.7 Study on inhibition of zinc metalloproteases 75 3.7.1 Inhibition of ACE 75 3.7.1.1 General enzymatic assay 75 3.7.1.2 Quantification 78 3.7.2 Inhibition of MMP-1, -2 and -9 79 3.7.2.1 General enzymatic assay 80 3.7.2.2 Effect of zinc addition on the inhibition of MMP-1 by melanoidins 81 3.7.3 Inhibition of ChC 82 3.7.3.1 General enzymatic assay 82 3.7.3.2 Quantification 84 3.7.4 Calculation of IC50 84 4 RESULTS AND DISCUSSION 86 4.1 Coffee melanoidins 86 4.1.1 Isolation of coffee fractions 86 4.2 Inhibition of zinc-dependent peptidases by coffee fractions 89 4.2.1 Inhibition of MMPs 89 4.2.2 Inhibition of other zinc metalloproteases 98 4.2.3 General considerations 99 4.3 Structural studies on coffee melanoidins 101 4.3.1 Gel permeation chromatography 102 4.3.2 Elemental analysis: C/N ratio 113 4.3.3 Amino acid analysis 116 4.3.4 Total phenolics 120 4.3.5 Correlation between total phenols content and C/N ratio in coffee melanoidins 123 4.3.6 Raman spectroscopy 124 4.4 Derivatization of peptides 129 4.4.1 Nα-carboxyalkylation of peptides by reductive alkylation 130 4.5 Preliminary investigations on the inhibitory potential of Nα-carboxyalkyl derivatives of peptides against metalloproteases 133 4.5.1 Inhibition against ACE 134 4.5.2 Inhibition against other zinc metalloproteases 138 5 SUMMARY 141 6 REFERENCES 145 LIST OF PUBLICATIONS AND CONFERENCE CONTRIBUTIONS 168 AKNOWLEDGMENTS 169 ERKLÄRUNG 170