<p align="justify">The production of reactive oxygen species is strictly kept under control in the Human body. However, several conditions are characterized by the over-production or the uncontrolled production of these species, promoting damage to the host tissue. Among oxygen species producer, the myeloperoxidase/hydrogen peroxide/chloride system is a key element. This the consequence of the large quantity of myeloperoxidase found in neutrophils and that can be released rapidly during an inflammatory process. Moreover, hypochlorous acid, synthesized by this system, is a powerful oxidant.</p> <p align="justify">We have studied the impact of non-steroidal anti-inflammatory drugs (oxicams, nimesulid and flufenamic acid) on three reactive oxygen species, namely, hydroxyl radical, hydrogen peroxide and hypochlorous acid. The first results showed the weak antioxidant properties of these molecules and the necessity to focus on the myeloperoxidase/hydrogen peroxide/chloride system. During the study of the myeloperoxidase inhibition, it appeared that flufenamic acid was an efficient inhibitor that modulated the hypochlorous acid production and was directly oxidized by the enzyme.</p> <p align="justify">Due to the efficacy of flufenamic acid, this molecule was tested in a model of myeloperoxidase-dependent low-density lipoprotein (LDL) oxidation and compared to thiol-containing molecules like N-AcetylCystein and its lysinate salt, glutathione and captopril. The results showed that flufenamic acid lost part of its inhibiting effect while thiol-containing molecules demonstrated an interesting inhibiting activity in this model. A potential explanation could be the ability of myeloperoxidase to bind lipoproteins, masking the entry of its catalytic pocket. In these conditions, the inhibitor size becomes a key parameter in the inhibition of the MPO-dependent low-density lipoprotein oxidation and N-AcetylCystein appears as a powerful inhibitor in this context. These results render N-AcetylCystein an excellent candidate for studies that focus on the reduction of cardiovascular pathology risk.</p> <br> <p align="justify">Le corps humain est le siège constant de la synthèse d’espèces oxygénées réactives dont la production contrôlée est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme. Cependant dans de nombreuses pathologies, il arrive qu’une production exagérée et/ou incontrôlée de ces espèces aboutisse à des dégâts oxydatifs. Parmi les mécanismes de production d’espèces oxydantes, le système myéloperoxydase / peroxyde d’hydrogène / chlorure détient une place importante. Ceci est notamment la conséquence de la grande quantité de MPO présente dans les neutrophiles, pouvant être libérée très rapidement lors de l’inflammation. De plus l’acide l’hypochloreux synthétisé par ce système est un très bon oxydant.</p> <p align="justify">Nous avons étudié l’impact des anti-inflammatoires non-stéroïdiens (oxicams, nimésulide et acide flufénamique) sur trois espèces oxygénées réactives : le radical hydroxyle, le peroxyde d’hydrogène et l’acide hypochloreux. Les premiers résultats montrent le faible pouvoir anti-oxydant des molécules testées et la nécessité de concentrer notre recherche sur le système myéloperoxydase / peroxyde d’hydrogène / chlorure, responsable de la synthèse de l’acide hypochloreux. Lors de l’étude de l’inhibition de ce système, il est ressorti que l’acide flufénamique est un bon inhibiteur de la myéloperoxydase car il inhibe la synthèse de l’acide hypochloreux en étant directement oxydé par l’enzyme.</p> <p align="justify">En raison de l’efficacité de l’acide flufénamique, cette molécule a été testée dans un modèle d’oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDL) par le système myéloperoxydase / peroxyde d’hydrogène / chlorure en comparaison avec des thiols tels que la N-acétylcystéine et son sel de lysine, le glutathion et le captopril. Les résultats montrent une perte importante du pouvoir d’inhibition de l’acide flufénamique dans ce modèle alors que les thiols et la N-acétylcystéine en particulier, présentent une efficacité non négligeable. Ce phénomène pourrait être attribué à la capacité de la myéloperoxydase de se fixer sur les lipoprotéines, ce qui pourrait masquer l’entrée du site catalytique. Dans ces conditions, la taille de la molécule devient un facteur crucial dans l’inhibition de l’oxydation des lipoprotéines de basse densité et la N-acétylcystéine apparaît dès lors comme un inhibiteur puissant dont les résultats en font un excellent candidat dans des études d’intervention visant la diminution du risque de pathologies cardiovasculaires chez certains patients.</p>

Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) représentent un groupe de pathologies fréquentes. L'apport de l'analyse anatomopathologique des prélèvements dans le cadre de ces pathologies représente un rôle non négligeable dans la prise en charge des patients atteints par ces maladies. Nous avons montré que la présence de lésions de pléxite sur la limite proximale de pièces de résection iléocaecale relative à une atteinte par la maladie de Crohn était prédictive d'une rechute de la maladie nécessitant une seconde chirurgie, pouvant ainsi guider le clinicien pour une prise en charge thérapeutique plus adaptée. D'un point de vue physiopathologique, les MICI sont des maladies dont la pathogénie reste encore en partie à élucider. Dans ce travail nous avons montré l'importance de certains acteurs comme PPAR gamma et NRLP6 dans le maintien d'un fonctionnement normal de l'intestin. Il en est de même pour une carence en donneurs de méthyles : nous avons démontré qu'une telle carence aggravait les lésions de colite induites par DSS (Dextran Sulfate Sodium) chez le rat. Afin de mieux comprendre comment une carence en donneurs de méthyles pouvait intervenir dans la pathogénie de la maladie de Crohn, nous avons étudié l'impact de cette carence sur le fonctionnement et le développement de l'intestin grêle chez des ratons issus de mères carencées en folate et en vitamine B12 durant la gestation et l'allaitement, démontrant ainsi qu'un déficit en donneurs de méthyles entraîne des conséquences sur le fonctionnement de l'intestin grêle, pouvant ainsi créer un état de prédisposition au développement de la maladie de Crohn / Inflammatory bowel diseases (IBD) are very frequent. Pathological examination in IBD management is important for the diagnosis and for the follow-up of the disease. In this study we show that submucosal plexitis in the proximal resection margins and early surgical revision after the first ileocecal resection are associated with CD recidive requiring surgical treatment. It could be very important in order to stratify patients according to their risk, identifying those who can benefit from aggressive medication regimen, possibly modifying the natural course of CD. IBD pathogenesis is not completely clarified. We show the importance of molecules as PPAR gamma and NRLP6 in intestinal homeostasis : a reduced expression of PPAR gamma and NRLP6 could predispose of IBD. The same observation is made for methyl donor deficiency (MDD): methyl deficient diet aggravates experimental colitis induced by Dextran Sodium Sulfate in rat. To understand how MDD could play a part in Crohn?s disease pathogenesis, we investigated whether MDD may affect development and functions of small intestine in rat pups from dams subjected to the MDD during gestation and lactation. MDD has dual effects on small intestine by producing dramatic effects on enterocyte differentiation and barrier function in rats. Our observations could explain how vitamin B12 and folate deficiency can play a role in Crohn?s disease development

Les basophiles sont les granulocytes les plus rares. Ils sont impliqués dans la polarisation des réponses immunitaires de type Th2, dans la différenciation des lymphocytes B et dans la protection contre les infections helminthiques. Les basophiles sont impliqués dans la modulation des réponses immunitaires, en particulier dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Des études récentes ont montré que les basophiles murins sont cellules présentatrices d’antigène (CPA) et induisent des réponses Th2 et IgE contre les allergènes et les infections helminthiques.Par conséquent, Nous avons exploré les fonctions des basophiles humains, en particulier comme CPA professionnelles. Les résultats montrent que les basophiles, contrairement aux cellules dendritiques et monocytes, n’expriment pas HLA-DR et les marqueurs de co-stimulations CD80 et CD86. De plus, la stimulation des basophiles par divers allergènes, comme des ligands de TLR et IgE, n’induit pas des changements dans l’expression de ces marqueurs. Enfin, nos résultats montrent que les basophiles ne favorise pas les réponses immunitaire de type Th2 ou Th17. Ainsi,notre étude montre que les basophiles humains circulant ne possèdent pas des fonctions de CPA professionnelles. Des plus, les basophiles sont impliqués dans la pathogenèse de maladies auto-immunes et inflammatoires dépendantes des réponses Th2 et médiées par les lymphocytes B. Puisque la dérégulation des basophiles joue un rôle important dans le développement des réponses immunitaires dans différentes conditions pathologiques, nous avons exploré les mécanismes de régulations qui modulent les fonctions les basophiles. En particulier, nous avons étudié le rôle suppresseur des lymphocytes T régulateurs (Tregs) CD4+CD25+FoxP3, des cellules clés dans la maintenance de l’homéostasie immune, sur les fonctions des basophiles. Nos résultats montrent que les fonctions des basophiles, contrairement à la majorité des cellules immunes, ne sont pas régulées par les Tregs. Bien au contraire, nos résultats montrent que les lymphocytes T favorisent l’activation des basophiles. En résumé, nous avons exploré de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation des fonctions des basophiles humains. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le rôle des basophiles dans les conditions inflammatoires et dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Basophils are the rare granulocytes and play an important role in the polarization of Th2 responses, differentiation of B cells and protection against helminths. Basophils have a major influence on immune responses and various roles of these cells in autoimmune and inflammatory diseases are emerging. Recent reports showed that murine basophils function as antigen presenting cells (APCs) to induce Th2 and IgE responses to allergens and helminths. Therefore, I explored whether human basophils possess the features of APCs. I found that unlike dendritic cells (DCs) and monocytes, steady-state circulating human basophils did not express HLA-DR and co-stimulatory molecules CD80 and CD86. Basophils remained negative for these molecules following stimulation with various allergens, toll-like receptor ligands and IgE cross-linking.Unlike DCs, basophils did not promote Th2 and Th17 responses. Together, these results demonstrate the inability of circulating human basophils to function as professional APC. Further, basophils were also reported to be implicated in the pathogenesis of Th2 –associated and B cell-mediated autoimmune and inflammatory diseases. Considering the impact of dysregulated function of basophils on the outcome immune responses in various pathological conditions, it was essential to investigate the regulatory mechanisms by which basophil functions are kept in check. As CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells (Tregs) are critical for the maintenance of immune homeostasis, I sought to investigate the interaction of Tregs with human basophils and its repercussion on basophil functions. My results indicated that unlike other immune cells that aresusceptible to Treg-mediated suppression, basophils are refractory to regulatory mechanism of Tregs. On the contrary I found that T cells could promote activation of basophils. My results thus provided an insight on cellular and molecular basis of regulation of human basophil functions. These data will have a repercussion in understanding role of basophils ininflammatory conditions and in designing therapeutic strategies.

Les maladies inflammatoires intestinales (MII) sont caractérisées par des périodes d'inflammation chronique entrecoupées de périodes de rémission. Elles mobilisent l'action de plusieurs molécules pour favoriser le retour à l'homéostasie. Il a été démontré que l'expression du récepteur P2Y[indice inférieur 2] (P2Y[indice inférieur 2]) est augmentée chez les patients atteints de MII et dans un modèle murin de colite chimique. Cette thèse s'intéresse aux mécanismes de régulation transcriptionnelle du gène de P2Y[indice inférieur 2] et à son rôle dans les MII. Premièrement, la disponibilité de la chromatine au promoteur de P2Y[indice inférieur 2] a été caractérisée par le statut d'acétylation des histones H3 et H4 par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le site d'initiation de la transcription du gène de P2Y[indice inférieur 2] a été identifié par 5' RLM-RACE. NF-[kappa]B et C/EBP[bêta] sont des candidats idéals pour réguler l'expression de P2Y[indice inférieur 2] puisqu'ils sont impliqués dans la régulation de gènes liés à l'inflammation. En utilisant le logiciel TRANSFAC, les sites de liaison potentielle (SLP) de NF-[kappa]B et C/EBP[bêta] ont été identifiés sur le promoteur du récepteur P2Y[indice inférieur 2]. Ensuite, des essais luciférase ont démontré que NF-[kappa]B et C/EBP[bêta] transactivent le promoteur de P2Y[indice inférieur 2] dans les cellules épithéliales intestinales (CEI) en condition inflammatoire ou non. Lorsque ces deux facteurs de transcription sont co-exprimés dans les CEI, on observe une synergie de la transactivation du promoteur de P2Y[indice inférieur 2]. Par des essais luciférase avec des constructions du promoteur mutées pour les SLP des facteurs de transcription à l'étude ainsi que par des gels de retardement et des essais de ChIP, nous avons montré que C/EBP[bêta] se lie en position -229 à -220pb du promoteur et que NF-[kappa]B se lie en position -181 à -172pb. Finalement, la stimulation du récepteur P2Y[indice inférieur 2] active la voie de signalisation PI-3K/Akt qui inactive GSK-3[bêta] favorisant la stabilisation des microtubules permettant à la cellule de migrer pour réparer une monocouche de CEI blessées. De plus, dans les CEI, l'expression de COX-2 et PGE[indice inférieur 2] qui sont des molécules importantes pour la réparation tissulaire, est augmentée par la stimulation de P2Y[indice inférieur 2]. In vivo, la stimulation du récepteur favorise la rémission de souris atteintes de colite chimique. Cette thèse démontre donc que l'expression du récepteur P2Y[indice inférieur 2] dans les MII est régulée par NF-[kappa]B et C/EBP[bêta] et que ce récepteur joue un rôle important dans les MII en favorisant la phase de rémission.

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), qui comprennent les deux principales formes, la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH), sont caractérisées par une inflammation chronique et récurrente de la muqueuse intestinale, ayant un impact considérable sur la qualité de vie. À l'heure actuelle, la prise en charge thérapeutique de la MC n'est pas curative et un tiers des patients ne réagissent pas aux traitements biologiques et aux immunosuppresseurs. Par conséquent, de nouvelles stratégies pour traiter cette maladie sont fortement attendues. La dérégulation de l'interaction entre d'une part les facteurs génétiques et le système immunitaire de l'hôte, et d'autre part le microbiote intestinal et les facteurs environnementaux, est impliquée dans le développement des MICI. Cette perturbation entraîne effectivement une augmentation de la perméabilité intestinale et une inflammation persistante. Restaurer le microbiote «dysbiotique» et les fonctions intestinales altérées représentent donc une thérapeutique alternative intéressante. De ce fait, les probiotiques sont une option intéressante et ont été utilisés avec succès chez des patients souffrant de pouchite et de RCH. Cependant, leur effet protecteur est clairement souche-dépendant et plusieurs souches probiotiques bien connues n’ont pu conduire à un résultat clinique probant, en particulier chez les patients souffrant de MC. Le décryptage des mécanismes moléculaires sera donc la clé pour permettre une recommandation efficace des probiotiques dans le traitement ou la prévention des MICI. La sélection de souches basée sur des critères de sélection bien définis et en utilisant des modèles bien maitrisés est indispensable à ce processus. L'objectif principal de cette thèse était de sélectionner des lactobacilles et des bifidobactéries parmi une collection de souches françaises et libanaises, capables de présenter des propriétés protectrices contre les MICI, en se concentrant sur leurs capacités immuno-régulatrices et leurs capacités à renforcer la barrière épithéliale. Des approches in vitro ont été utilisées pour sélectionner des souches ayant une activité anti-inflammatoire et également capables d'améliorer la fonction de la barrière intestinale. Cinq souches ont été identifiées présentant des caractéristiques différentes, mais avec un potentiel thérapeutique élevé. Deux souches se sont révélées hautement protectrices dans deux modèles différents de colite aiguë et de colite de bas grade. Nos résultats ont confirmé en outre l'hypothèse selon laquelle la capacité des souches à atténuer l'inflammation est en partie due à l'amélioration de la barrière intestinale et à la restauration des protéines de jonction serrés.Un nombre croissant d’études génétiques ont prouvé que l’autophagie peut affecter plusieurs aspects de la réponse immunitaire des muqueuses, notamment via l’élimination de bactéries intracellulaires, la sécrétion de peptides antimicrobiens, la production de cytokines pro-inflammatoires et la présentation des antigènes. Par conséquent, l'autophagie peut être considérée comme un mécanisme de régulation clé impliqué dans la physiopathologie de la MC. Nous avons donc évalué la capacité des souches à activer cette voie et montré que les souches sélectionnées étaient en effet capables d’induire une activation de l’autophagie dans des cellules dendritiques murines. Nous avons démontré in vitro que le blocage de l'autophagie pouvait diminuer la capacité des souches à induire la sécrétion d'IL-10, cytokine anti-inflammatoire et, inversement, à exacerber la sécrétion d'IL-1β, cytokine pro-inflammatoire. Nous avons pu confirmer, à l'aide d'un modèle murin de colite, que la capacité protectrice d’une souche impliquait la machinerie autophagique, et nous avons pu mettre en évidence le rôle des cellules dendritiques dans ce processus [...] / Inflammatory bowel disease (IBD), including the two main types, Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), is characterized by chronic, relapsing inflammation of the gut mucosa with considerable impact on the quality of life. At present, the therapeutic management of CD is not curative and one third of patients fails to respond to current biologicals and immunosuppressive drugs. Therefore new strategies for treating this disease are imperative.The deregulation of the normal interplay between the genetics and immune system of the host on the one hand, and the gut microbiota and environmental factors on the other hand, is known to be associated with the development of IBD, as this disturbance is leading to increased intestinal permeability and persistent inflammation. Restoring the “dysbiotic” microbiota and the impaired intestinal functions represent an attractive therapeutic alternative. Probiotics represent therefore an interesting option and have been used quite successfully in patients suffering from pouchitis and UC. However, their protective effect is clearly strain-dependent and several well-known probiotic strains failed to fulfill the expected clinical outcome, especially when applied in CD. Deciphering the molecular mechanisms will be the key to the recommendation of probiotics for the treatment or prevention of IBD. Selecting strains on well-defined selection criteria and using well-studied models is indispensable to this process.The main objective of this thesis was first to select lactobacilli and bifidobacteria from a collection of French and Lebanese strains that exhibited protective properties against IBD, focusing on their immunoregulatory capacities and their capacities to strengthen the epithelial barrier.In vitro approaches were used to select strains with anti-inflammatory activity and also able to enhance intestinal barrier function. Five strains were identified with different characteristics, but entailing a high potential for the management of IBD. Two strains, e.g. were found to be highly protective in two different models of acute and low grade colitis. Our results furthermore support the hypothesis that the capacity of the strains to alleviate inflammation is in part mediated by the improvement of the intestinal barrier and the restoration of tight junction proteins.A growing number of genetic studies provided strong evidence that autophagy machinery can affect several aspects of the mucosal immune response, including intracellular bacterial killing, antimicrobial peptide secretion, pro-inflammatory cytokine production and antigen presentation. Therefore, autophagy can be considered as a key regulator mechanism most likely involved in the physio-pathogenesis of CD.We therefore evaluated the capacity of the strains to activate this pathway and showed that the selected strains were indeed able to induce autophagy activation in dendritic cells. We demonstrated in vitro that blocking the autophagy machinery can abolish the capacity to induce the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 after immune cell stimulation, while exacerbating the secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-1β. We could confirm, using a murine model of colitis, that the protective capacity of the selected strains indeed involves autophagy mechanisms, and we could highlight the role of dendritic cells in this process. We therefore propose here that autophagy is a novel mechanism through which probiotics can exhibit their immunoregulatory capacities.

Les maladies inflammatoires à médiation immunitaire représentent un groupe de maladies cliniquement distinctes mais liées par de multiples mécanismes pathogéniques inflammatoires sous- jacents, associant facteurs génétiques, immunitaires et environnementaux. La pathogenèse de ces maladies n’est toujours pas complètement établie, en particulier l’importance et les interactions entre ces différents facteurs, mais leur étude a permis d’établir un lien entre diverses maladies, comme les spondylarthropathies et les maladies des barrières épithéliales telles que le psoriasis et les maladies inflammatoires de l’intestin. En effet, ces dernières partagent des voies biologiques communes perturbées, notamment au niveau de l’immunité de type 3.Afin d’étudier les interactions entre les articulations, la peau et l’intestin dans un contexte inflammatoire, nous avons utilisé un modèle murin développant un syndrome inflammatoire spontané multi-organique lié à une déficience en tristétraproline, qui est une protéine impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle de nombreuses cibles inflammatoires. Ce syndrome présente des similitudes avec le groupe des spondylarthropathies, par l’atteinte des articulations et de la peau, et une dépendance au TNFα et à l’IL-23. Dans ce contexte, nous avons investigué les bases cellulaires et moléculaires responsables de ce syndrome spontané, et les liens entre les différents organes, grâce à des approches transgéniques et interventionnelles.Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux interactions entre la peau et les articulations. Nous avons montré qu’une inflammation cutanée se développait en l’absence de tristétraproline, liée à une dérégulation de l’immunité de type 3 et que la tristétraproline avait un rôle essentiel au sein des kératinocytes dans le maintien de l’homéostasie cutanée, mais également dans le contrôle d’une inflammation systémique et articulaire. Nous avons ensuite étudié plus spécifiquement le rôle de la tristétraproline au niveau de l’homéostasie intestinale. Nous avons observé que la perte de tristétraproline n’entraînait pas de pathologie intestinale franche grâce à la présence de mécanismes régulateurs locaux tels qu’une expansion intestinale de lymphocytes T régulateurs et de cellules lymphoïdes innées du groupe 3, et que la perte de la tristétraproline au sein des cellules épithéliales intestinales ne perturbait pas l’homéostasie intestinale. Par contre, la modulation du microbiote intestinal a permis de montrer son impact direct sur le contrôle de l’inflammation locale mais également sur les manifestations systémiques de ce syndrome spontané. Enfin, la modulation des voies de détection microbienne a montré de façon plus complexe un rôle amplificateur ou inhibiteur selon les compartiments investigués.En conclusion, malgré une complexité liée aux différents types cellulaires probablement impliqués et au nombre d’organes atteints, ce modèle murin spontané a donc permis une étude plus détaillée des liens entre la peau, les intestins et les articulations dans un contexte inflammatoire, ainsi que le rôle du microbiote, dans le but d’une meilleure compréhension de la pathogenèse de maladies inflammatoires humaines et de leur prise en charge. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les basophiles sont les granulocytes les plus rares. Ils sont impliqués dans la polarisation des réponses immunitaires de type Th2, dans la différenciation des lymphocytes B et dans la protection contre les infections helminthiques. Les basophiles sont impliqués dans la modulation des réponses immunitaires, en particulier dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Des études récentes ont montré que les basophiles murins sont cellules présentatrices d'antigène (CPA) et induisent des réponses Th2 et IgE contre les allergènes et les infections helminthiques.Par conséquent, Nous avons exploré les fonctions des basophiles humains, en particulier comme CPA professionnelles. Les résultats montrent que les basophiles, contrairement aux cellules dendritiques et monocytes, n'expriment pas HLA-DR et les marqueurs de co-stimulations CD80 et CD86. De plus, la stimulation des basophiles par divers allergènes, comme des ligands de TLR et IgE, n'induit pas des changements dans l'expression de ces marqueurs. Enfin, nos résultats montrent que les basophiles ne favorise pas les réponses immunitaire de type Th2 ou Th17. Ainsi,notre étude montre que les basophiles humains circulant ne possèdent pas des fonctions de CPA professionnelles. Des plus, les basophiles sont impliqués dans la pathogenèse de maladies auto-immunes et inflammatoires dépendantes des réponses Th2 et médiées par les lymphocytes B. Puisque la dérégulation des basophiles joue un rôle important dans le développement des réponses immunitaires dans différentes conditions pathologiques, nous avons exploré les mécanismes de régulations qui modulent les fonctions les basophiles. En particulier, nous avons étudié le rôle suppresseur des lymphocytes T régulateurs (Tregs) CD4+CD25+FoxP3, des cellules clés dans la maintenance de l'homéostasie immune, sur les fonctions des basophiles. Nos résultats montrent que les fonctions des basophiles, contrairement à la majorité des cellules immunes, ne sont pas régulées par les Tregs. Bien au contraire, nos résultats montrent que les lymphocytes T favorisent l'activation des basophiles. En résumé, nous avons exploré de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation des fonctions des basophiles humains. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le rôle des basophiles dans les conditions inflammatoires et dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

La progression tumorale MSI (Microsatellite Instable) est un processus multi-étapes résultant de mutations générées par un processus d'instabilité génétique qui affecte en majorité les motifs répétés en tandem de l'ADN (microsatellites). Ces mutations contribuent à l'oncogenèse lorsqu'elles perturbent la fonction d'oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs. Le trait phénotypique MSI est consécutif à l'inactivation du système de réparation des mésappariements de l'ADN (système MMR). Dans ce travail, je me suis intéressé au rôle des microARNs dans l'oncogenèse MSI. Les microARNs régulent l'expression de nombreux gènes pouvant avoir un rôle clé dans le cancer. J'ai donc fait l'hypothèse d'un rôle de ces microARNs lors des différentes étapes du processus tumorigénique MSI. Tout d'abord nous avons mis en évidence une surexpression du miR-155 (ciblant les principales protéines MMR) au niveau de la muqueuse colique non transformée des malades atteints d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale, qui pourrait constituer un évènement pré-tumoral favorisant l'émergence de clones MMR-déficients (notion d'effet de champs). Dans une deuxième partie, nous avons pu identifier la première mutation somatique touchant un microARN. Il s'agit du miR-3613 dont la répétition microsatellite est entièrement localisée dans le miR mature. L'instabilité au niveau de ce miR conduit à des changements de séquence à l'extrémité 3' du miR (notion d'IsomiRs). Les isomiRs produits ont un répertoire de cibles qui pour certaines sont communes à la forme sauvage et pour d'autres spécifiques à chacun des variants. / MSI tumor progression (Microsatellite Instability) is depicted as a multistage process that results from mutations generated by a process of genetic instability affecting mostly DNA tandem repeats (known as microsatellites). These mutations contribute to tumorigenesis when they disrupt the function of oncogenes or tumor suppressor genes. As a phenotypic trait, MSI is the consequence of DNA mismatch repair inactivation (MMR). This work focused on the role microRNAs might play in MSI tumorigenesis. MicroRNAs regulate the expression of numerous genes and are deregulated in cancer. I have hypothesized a role of theses microRNAs during the various stages of the MSI tumorigenic process, choosing colorectal cancers (CRC) as a working model. First we demonstrated that overexpression of miR-155 (targeting core MMR proteins) in the non-transformed colonic mucosa of patients with Inflammatory Bowel Disease, might constitute a pre-tumoral event promoting the emergence of MMR-deficient clones (a concept known as ?field effect?). In a second part, we were able to identify the first somatic mutation affecting a mature microRNA sequence. A DNA microsatellite repeat is indeed fully embedded within the mature sequence of miR-3613. Instability at this DNA repeat leads to sequence modifications at the 3?end of miR-3613-5p (IsomiRs). IsomiRs display a signature among which some mRNA targets are common to the wild form, while others are specific to each variant.

Introduction : L’inflammation intestinale observée dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) est essentiellement située au niveau du côlon et peut sur le long terme provoquer l’apparition du cancer colorectal (CCR). Cette inflammation est étroitement régulée par les cellules immunitaires de la muqueuse intestinale qui sont majoritairement représentées par les macrophages. Ces derniers jouent un rôle clé dans la pathogenèse des MICI et contribuent au maintien de l’inflammation intestinale. A l’heure actuelle, les traitements disponibles proposés pour traiter ces pathologies visent surtout à diminuer l’inflammation. Les travaux menés au cours de cette thèse, s’inscrivent dans ce contexte. En effet, des expériences précédentes réalisées par notre laboratoire avaient montré que des surnageants de biofilms du probiotique Lactobacillus induisaient une réponse anti-inflammatoire chez les macrophages humains. Il avait également été remarqué que l’immunodéplétion de GroEL (une protéine de choc thermique) du surnageant bactérien abrogeait de manière dose-dépendante ces propriétés anti-inflammatoires. Méthodes : Par conséquent, au cours de ce travail de thèse nous nous sommes intéressés aux effets bénéfiques que pourrait exercer GroEL sur l’inflammation intestinale via son action au niveau des macrophages. Pour ce faire, nous avons étudié les effets de GroEL provenant de la souche Lactobacillus reuteri sur des modèles in vitro (macrophages humains), ex vivo (explants tissulaires de côlon) et in vivo (modèles murins d’inflammation intestinale et de polypose). Résultats : Nous avons démontré que la protéine GroEL provenant de la souche L. reuteri prévient la polarisation des macrophages vers un phénotype M1 (pro-inflammatoire) tout en favorisant la polarisation des macrophages vers un phénotype M2 (anti-inflammatoire). De façon similaire, le traitement des macrophages par cette protéine a permis de diminuer l’inflammation et le stress oxydant induits par le LPS. Ces expériences ont été confirmées sur des explants tissulaires de côlon, où le traitement par GroEL a permis de réduire l’inflammation, l’apoptose et le stress oxydant provoqués par le LPS. Par ailleurs, l’effet anti-inflammatoire de GroEL de L. reuteri a pu être démontré sur un modèle murin d’inflammation intestinale induite par le DSS. Dans ce modèle, l’administration intra-rectale de GroEL de L. reuteri a permis de prévenir le raccourcissement du côlon, la dégradation de la muqueuse intestinale et la perte de poids provoqués par le DSS. Enfin, nous avons également remarqué que GroEL de L. reuteri pouvait agir comme un agent prophylactique étant donné que les souris APCMin/+ traitées avec cette protéine présentaient une diminution significative du nombre de polypes sporadiques situés au niveau du côlon. Conclusion : La protéine GroEL de L. reuteri, par ses propriétés anti-inflammatoires, pourrait être un complément thérapeutique intéressant aux traitements disponibles dans la prise en charge des MICI et la prévention du CCR.Mots clés : GroEL, inflammation du côlon, probiotiques, MICI et CCR. / Introduction : Intestinal inflammation observed in inflammatory bowel disease (IBD) is mainly located in the colon and could lead to the onset of colorectal cancer (CRC). This inflammation is tightly regulated by the immune cells of the intestinal mucosa which are predominantly represented by macrophages. These cells play a key role in the pathogenesis of IBD and contribute to the maintenance of intestinal inflammation. Currently, available treatments proposed to treat these pathologies are aimed primarily at reducing inflammation. The work carried out during this thesis is part of this context. Indeed, previous experiments performed by our laboratory showed that supernatants of probiotic Lactobacillus biofilms induced an anti-inflammatory response in human macrophages. It was also noted that this effect was abrogated upon immunodepletion of the stress protein GroEL (a heat shock protein). Methods : Therefore, during this thesis work we have been interested in the beneficial effects that GroEL could exert on intestinal inflammation via its action on human macrophages. In order to do this, we used GroEL from the Lactobacillus reuteri strain and its effect in vitro (in human macrophages isolated from buffy coats), ex vivo in colon human explants and in vivo in two different models was analyzed (murine models of intestinal inflammation and polyposis). Results : We found that Lactobacillus reuteri GroEL inhibited the polarization of macrophages towards a M1-like phenotype (pro-inflammatory) while facilitating the polarization of macrophages towards an M2-like phenotype (anti-inflammatory). As a consequence, macrophages treated with L. reuteri GroEL presented a decrease in inflammation and oxidative stress induced by LPS. This was confirmed in colon tissues from biopsies, where L. reuteri GroEL was able to decrease inflammation, apoptosis and oxidative stress induced by LPS. Besides, the beneficial anti-inflammatory effect of Lactobacillus GroEL was demonstrated in a mice model of DSS-induced intestinal inflammation. Rectal administration of L. reuteri GroEL prevented colon shortening and degradation of intestinal mucosa. Further, it abrogated the drastic weight loss induced by DSS. We also showed the potential role of GroEL as a prophylactic agent since APCMin/+ mice treated with L. reuteri GroEL exhibited a significant decrease in the number of sporadic colonic polyps. Conclusion : L. reuteri GroEL protein, by its anti-inflammatory properties, could be an interesting adjunct therapy to the available treatments in the care of IBD and the prevention of CRC.Keywords : GroEL, colonic inflammation, probiotics, IBD and CRC.

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation sévère de l'intestin grêle et du côlon et comprennent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Les MICI sont des maladies complexes faisant intervenir des facteurs génétiques : certains senseurs bactériens, l'autophagie et le stress du réticulum endoplasmique. Un défaut de barrière de l'épithélium digestif est également fortement impliqué dans la physiopathologie du processus inflammatoire. La fonction barrière de l'épithélium digestif est assurée par plusieurs types cellulaires, synthétisant entre autres, des peptides antimicrobiens (PAM) et des mucines. Dans les MICI, une augmentation de la perméabilité intestinale et une perte de muco-sécrétion ont été décrites. Les protéases jouent un rôle fondamental dans la digestion du bol alimentaire mais également dans le maintien de l'homéostasie intestinale en activant ou dégradant divers motifs moléculaires, ou in induisant des signaux spécifiques aux cellules par l'activation de quatre récepteurs : les PARs (Protease-Activated Receptor). Dans les MICI, un excès d'activité protéolytique de type trypsine est observé. L'origine de cette activité est théoriquement attribuée aux cellules immunitaires, à une surproduction pancréatique ou au microbiote, mais les cellules épithéliales intestinales semblent également être une source majeure de protéases. L'objectif de mon projet de thèse visait à étudier l'impact des principales voies impliquées dans les MICI sur l'homéostasie des protéases épithéliales et le rôle de celles-ci dans la déstabilisation de la fonction de barrière. Nos résultats ont confirmé un excès de protéases à sérine dans les cellules épithéliales de patients atteint de MC ou de RCH. In vitro, sur des monocouches de cellules Caco-2, l'induction de l'autophagie diminuait la libération apicale de protéase de type trypsine, alors que le senseur bactériens NOD2 n'avait aucun effet. A l'inverse, une stimulation du Stress du réticulum endoplasmique (SRE) par la Thapsigargin, induisait une libération accrue de protéases actives de type trypsine au pôle apical des cellules. [...] / Crohn's disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are two forms of Inflammatory Bowel Disease (IBD), a chronic inflammatory pathology affecting the digestive tract. Patients suffer from relapsing flares, diarrhea, abdominal pain and bleeding. Although the molecular mechanisms of IBD are poorly understood, recent data suggest that IBD occurs in genetically predisposed individuals developing an abnormal immune response to intestinal microbes after, being exposed to specific environmental triggers. Genetic studies have reported more than 170 polymorphisms susceptible to be involved in IBD pathogenesis. The strongest associations have highlighted three main pathways altered in IBD including bacterial sensing (NOD2, CD), autophagy (ATG16L1 and IRGM, CD) and endoplasmic reticulum stress (ER-Stress) (XBP1, UC). The role of intestinal barrier function is also strongly implicated in IBD pathogenesis, and is modulated by factors present in the lumen derived from microbiota, food or at a molecular level, by factors such as proteases. In IBD pathophysiology, the inflammatory process is characterized by impaired intestinal biology including disruption of tight junctions and leaky gut, decreased amount of Paneth and Goblet cells, and translocation of luminal antigens triggering inflammation. Previous studies have demonstrated an increased level of active serine proteases in the stools and tissues of IBD patients, supposing that proteases originate from infiltrated immune cells, pancreatic secretion or microbiota. However, our team has reported that intestinal epithelial cells are a major source of serine proteases, in particular trypsin-like enzymes, are released by a stressed epithelium in pathogenic context such as irritable bowel syndrome. In this project, we aimed at better understanding whether the three main pathways involved in IBD (Nod2, autophagy, ER-stress) could be linked to an epithelial release of trypsin and reciprocally, if epithelial trypsin is able to induce or modulate these three IBD pathways. We confirmed that trypsin-like activity was significantly higher in biopsies from UC and CD patients compared to healthy controls. In Caco-2 monolayers cultured in transwells, secreted trypsin-like proteolytic activity remained stable upon NOD2 stimulation but decreased under autophagy induction. Thapsigargin (Tg) stimulation a well-known ER-stress inducer, enhanced the apical release of trypsin-like activity in Caco2 cells. [...]