Tesi realitzada al Centre de Recerca en Salut Internacional de Barcelona (CRESIB) - Hospital Clínic / La diarrea és la segona causa de mortalitat infantil a nivell mundial, essent també una de les afectacions més freqüent en viatgers després d’un viatge a zones tropicals. Els patògens implicats de manera més freqüent són d'origen bacterià, destacant per la seva rellevància soques diarreogèniques d'Escherichia coli i Shigella spp. Aquesta patologia usualment sol ser de caràcter autolimitant, però a vegades requereix de l'ús d'antimicrobians, ja sigui per la seva durada o severitat. Lamentablement al llarg dels últims anys els nivells de resistència a antimicrobians no han fet més que incrementar, dificultant els tractaments i fent precís la introducció de noves alternatives de tractament. En la present tesi s'analitzen tant els nivells com els mecanismes de resistència a antimicrobians en soques bacterianes causants de diarrea infantil en zones periurbanes de Lima (Perú), així com de mostres causants de diarrea en viatgers. Els resultats mostren elevats nivells de resistència als antimicrobians que s’usen actualment en el tractament d’aquesta patologia, especialment a ampicil·lina, cotrimoxazol i les quinolones. En aquest últim cas, el resultats obtinguts en analitzar les mostres d'origen infantil van mostrar uns nivells inusualment elevats de resistència, donat el fet que les quinolones no s'usen en aquest segment d'edat. Aquest fet indica que les soques han estat en contacte amb formes residuals, el que fa suposar que l'adquisició de la resistència s’ha produït de manera exògena, potser com a conseqüència d’un ús elevat de quinolones en altres ambients. Així en aquestes soques es constatà una elevada proporció de mutacions als gens gyrA i parC, així com la presència d'elements de resistència transferibles: qnrB o aac (6 ') Ib-cr. Es determina l’us potencial de la rifaximina com una alternativa als tractaments actuals, tant les dades obtingudes in vitro, com la seva baixa capacitat de desenvolupar mutants in vitro resistents als antimicrobians van mostrar la seva potencial utilitat en el tractament de la diarrea d’origen bacterià. A més a més es va observar que les soques que esdevenien resistents, aquesta selecció perdurava en el temps, essent de caràcter estable. No obstant els resultats obtinguts en analitzar les soques comensals i diarreogèniques d'E coli aïllades de nens menors de 2 anys de la zona de Chorrillos (Lima) es va veure que presentaven elevades proporcions de resistència a antimicrobians, associats sobretot a sobreexpressió de bombes d’expulsió inhibibles per Phenyl-Argynil-beta- Naphtylamyda (un inhibidor de bombes), fet que suggereix la presència de factors ambientals que afavoreixin la desregulació d'aquestes bombes fent que els bacteris esdevinguin resistents. / Diarrhea is the second leading cause of child mortality worldwide, being also the most common of the effects on travelers after trip to the tropics. The most frequent pathogen isolated are bacteria, and among these diarrheogenic Escherichia coli and Shigella spp are relevant. Usually diarrhoea is a self-limiting disease, but sometimes depending of the duration or severity, the use of antimicrobials is required. Unfortunately, over in the last years, the levels of antimicrobial resistance have been increased and the introduction of alternatives of treatment are necessary. In this thesis both the levels and mechanisms of antimicrobial resistance in bacterial strains causing childhood diarrhea in peri-urban areas of Lima (Peru) are analyzed, as well as samples causing diarrhea in travelers. The results show high levels of antimicrobial resistance in use, especially ampicillin, co-trimoxazole and quinolones. In the latter case, the obtained results showed unusual high levels of resistance because quinolones are not used in this age, which suggests the acquisition of resistant strains was exogenously, perhaps due to the high use of quinolones is done in other environments. In these strains the high frequency of mutations in genes gyrA and parC as well as the presence of transferable mechanisms as qnrB or aac (6 ') Ib-cr was verified. The potential of rifaximin as an alternative to current treatments are evaluated. The data from in vitro development of antimicrobial resistant mutants showed its potential usefulness, although the selected strains the resistance was stable. However the results obtained by analyzing diarrheogenic and commensal strains of E. coli isolated from children under 2 years in the area of Chorrillos (Lima) showed elevated levels of antimicrobial resistance associated with efflux pumps overexpression (inhibitable by Argynil-Phenyl-beta- Naphtylamyda). This fact suggests the presence of environmental factors such as toxic, that favoring deregulation of these efflux pumps.

Los Papilomavirus Humanos (VPHs) son virus que causan enfermedades proliferativas en el epitelio de piel y mucosas. Su relación con el cáncer de cuello de útero se conoce desde la década de los 70 y actualmente está ampliamente aceptado que los papilomavirus humanos son el único agente etiológico causante del cáncer cervical. Constituyen un grupo de virus muy heterogéneo, dentro del cual destacan por cuestiones de tipo clínico algunos genotipos que presentan un alto potencial oncogénico y que son los causantes de la mayoría de los carcinomas invasores de cérvix. Se han desarrollado vacunas contra algunos de estos genotipos, y actualmente se están incluyendo en los programas nacionales de vacunación de un gran número de países. La tesis describe un trabajo de investigación que ha aportado tres aspectos novedosos que se presentan en los tres capítulos en los que está estructurada. En el primer capítulo se describe un nuevo sistema de detección e identificación de papilomavirus humanos de amplio espectro. El método está basado en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y en RFLPs (análisis de fragmentos de restricción). Permite la identificación de los genotipos víricos presentes en las muestras clínicas con lesiones precursoras de cáncer de cuello de útero. De esta forma permite valorar el potencial evolutivo de las lesiones pre-cancerosas, ya que cada genotipo vírico presenta un nivel de riesgo específico. Asimismo, el método incorpora un mecanismo molecular desarrollado especialmente para el presente trabajo que permite detectar las eventuales inhibiciones de las reacciones de amplificación. En el segundo capítulo se describe la utilización del método presentado, para el estudio de 9.734 muestras clínicas procedentes de varios hospitales y centros sanitarios españoles. Se esta forma se consiguió detectar e identificar el genotipo vírico en un gran número de muestras y obtener información estadísticamente significativa respecto a la distribución de los diferentes genotipos en la población. También se estudió la relación entre la gravedad de la lesión y la edad con el genotipo presente en la muestra. En el tercer capítulo se describe el trabajo de caracterización de dos nuevas variantes detectadas con el método presentado en el primer capítulo. Este sistema de identificación permite la detección de un gran número de genotipos conocidos de papilomavirus, así como de variantes no descritas previamente. Esto permitió la detección de dos nuevos genotipos, que fueron secuenciados completamente y clasificados taxonómicamente como dos nuevos subtipos de tipos actualmente conocidos. En la presente tesis se ha desarrollado un sistema de detección e identificación de papilomavirus que ha sido comercializado como un producto para diagnóstico in vitro. Por otro lado, este sistema también ha sido comercializado como un servicio de laboratorio, consistente en la realización de una prueba y la emisión de un informe clínico. En total se han podido analizar aproximadamente unas 26.000 muestras clínicas utilizando este sistema El aspecto más destacado de este trabajo de tesis es el desarrollo de un sistema de detección e identificación de papilomavirus y su demostrada aplicabilidad clínica, así como su utilidad como método para la realización de estudios estadísticos sobre la distribución de genotipos víricos. / The Human Papillomaviruses (HPVs) cause proliferative diseases in the epithelium of skin and mucous membranes. The relationship between them and cervical cancer has been known since the early ‘70s and now is widely accepted that human papillomaviruses are the only etiologic agent of cervical cancer. They are a very heterogeneous group of viruses. Some of them are very important so have a high oncogenic potential and they are responsible for most invasive cervical carcinomas. It has been developed vaccines against some of these genotypes, and currently are used in national immunization programs of many countries. The thesis describes a research project which has provided three new issues that arise in the three chapters in which it is structured. In the first chapter it is described a new system of detection and identification of human papillomavirus of broad spectrum. The system is based on PCR (polymerase chain reaction) and RFLPs (restriction fragment length polymorphism). It allows the identification of the viral genotypes present in clinical samples with precursor lesions of cervical cancer. Thus, it allows to assess the potential of the evolution of pre-cancerous lesions, because each viral genotype has a specific level of risk. Further, the method includes a molecular mechanism specially developed for this project to detect the eventual inhibition of the amplification reactions. In the second chapter it is described the utilization of the presented method to the analysis of 9.734 clinical samples from several hospitals and Spanish health centers. Thus, it was possible to detect and identify the viral genotype of a large number of samples and to obtain statistically significant information regarding the distribution of the different genotypes in the population. It was also studied the relation between the severity of the lesion and the age with the genotype present in the sample. In the third chapter it is described the project of the characterization of two new variants detected with the method presented in the first chapter. This identification method allows the detection of many papillomavirus of known genotype as well as variants not described previuosly. This allowed the detection of two new genotypes, which were completely sequenced and taxonomically classified as two new subtypes of the currently known types. In the present thesis it has been developed an identification and detection system of papillomavirus which has been commercialized as an in vitro diagnostic product. On the other hand, this system has also been commercialized as a laboratory service, consisting in the realization of a test and the emission of a clinical report. In total, it has been able to analyze about 26.000 clinical samples using this system. The highlight of this thesis is the development of an identification and detection system of papillomavirus and its proved clinical applicability, as well as its utility as a method for the realization of statistics studies about the distribution of viral genotypes.

El càncer colorectal és la segona causa de mort per càncer al món i el tumor més freqüent a l’Estat Espanyol englobant ambdós sexes. El tractament de la malaltia avançada es basa en la combinació de fàrmacs citotòxics, citostàtics i noves molècules anti-diana, assolint-se medianes de supervivència al voltant dels 2 anys. Encara que les darreres tendències de tractament del càncer estan enfocades principalment cap al desenvolupament de molècules anti-diana, l’administració d’oxaliplatí continua essent clau i essencial en el tractament en el CCR avançat. Malgrat els grans avenços que s’han donat en el tractament del càncer de còlon metastàtic, tots ells estan al voltant de la introducció de nous medicaments i seguim indefensos pel que fa a l’aparició de resistències, que són la causa fonamental del fracàs del tractament. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral és conèixer millor els mecanismes de resistència adquirida a oxaliplatí mitjançant l’estudi de perfils d’expressió proteica en models cel·lulars in vitro per després traslladar els resultats a la selecció del tractament de primera línia en pacients amb càncer colorectal avançat. Així, a partir d’una aproximació de proteòmica comparativa, s’ha identificat la proteïna piruvat quinasa M2 (PKM2) en relació amb el procés d’adquisició de resistència a oxaliplatí en el nostre model cel·lular. PKM2 catalitza l’últim pas de la glicòlisi i regula de manera clau la glicòlisi aeròbica o efecte Warburg en les cèl·lules canceroses. Recentment, se li han atribuït altres funcions no-glicolítiques; així, pot translocar al nucli i activar la transcripció gènica interaccionant i modificant proteïnes nuclears participant en funcions tant dispars com la supervivència o la mort cel·lular. Els nostres resultats demostren que PKM2 es troba infraexpressada en les línies resistents, també a nivell d’ARNm i que després del tractament amb oxaliplatí, els nivells d’expressió disminueixen. Mitjançant tècniques d’ARN d’interferència hem demostrat que la inhibició de l’expressió de PKM2 augmenta la viabilitat de les cèl·lules sensibles, amb p53 mutada, quan es tracten amb el fàrmac en un 50% mentre que l’efecte és oposat en un model amb p53 salvatge. Tanmateix no hem pogut demostrar que aquest augment en la viabilitat sigui conseqüència d’una disminució en la mort cel·lular. D’altra banda, hem pogut observar un canvi en la compartimentació de la proteïna que només es dona en les cèl·lules sensibles a oxaliplatí, donat que PKM2 és capaç de translocar al nucli de les cèl·lules sensibles al llarg de 72 hores de tractament continu però no en les cèl·lules derivades resistents. En tercer lloc, a partir d’una aproximació de silenciament gènic i proteòmica comparativa en 2 dimensions, s’han pogut establir els perfils proteics associats a la presència/absència de PKM2 i determinar possibles proteïnes vinculades a l’expressió d’aquesta com son, FKBP4 i HSC70. Finalment, pel que fa a l’estudi en pacients, hem demostrat que el grup de pacients amb els nivells més baixos de PKM2 presenten pitjors ràtios de resposta a la quimioteràpia basada en oxaliplatí i que aquest fet també pot tenir relació amb l’estat mutacional de p53 en aquests pacients, correlacionant aquests resultats amb els obtinguts a l’estudi in vitro. Així doncs, en aquesta tesi doctoral es descriu un nou mecanisme d’adquisició de resistència a oxaliplatí i se li atribueix un nou paper a la proteïna PKM2. Tanmateix, s’obren noves vies d’investigació, tant a nivell de funcionalitat de dita proteïna com també de noves vies d’intervenir en la resistència adquirida a aquest fàrmac platinat. / Colorectal cancer is the second most common cause of cancer death in the world and the most frequent tumor in Spain including both genders. Survival of the advanced disease has increased from 12 months with monotherapy to roughly 2 years with the addition of cytotoxic and cytostatic drugs combined with targeted drugs. Despite the state of the art in cancer treatment is mainly focused on the development of target molecules, oxaliplatin administration remains essential in the treatment of advanced CRC. Regardless of the great improvements achieved in the treatment of metastatic CRC, all of them are focused in the introduction of new drugs and we are still defenseless in front of resistance appearance, which is the main cause of treatment failure. According to this, the main objective of this doctoral thesis is to better know and understand oxaliplatin acquired resistance mechanisms by studying protein expression profiles in in vitro models in order to translate these results in a better selection of first line treatment in advanced CRC patients. Thus, from a comparative proteomic study, we have identified the protein M2 pyruvate kinase (PKM2) related to the oxaliplatin resistance acquisition process in our cellular model. PKM2 catalyzes the last step of glycolysis and is a key enzyme in the regulation of aerobic glycolysis (known as a Warburg effect) in cancer cells. Recently, other non-glycolytic functions have been assigned to PKM2. It has been shown this protein can translocate to the nucleus and, consequently, it activates transcription of several genes. PKM2 can also interact and modify nuclear proteins taking part in different and opposed cellular processes such as proliferation or death. Our results have demonstrated that PKM2 expression is down-regulated in oxaliplatin resistant cells as compared to sensitive cells, also at mRNA level. Moreover, we have shown that oxaliplatin treatment decreases PKM2 levels. By using RNA interference techniques, we have shown that PKM2 gene silencing increases cell proliferation of sensitive cells harboring p53 mutation in about 50% when those cells are treated with the drug, while PKM2 silencing in sensitive and wild type p53 cells has the opposite result. The effect in increased cell proliferation was not related to a cell death decrease, though. On the other hand, we could observe a change in the subcellular localization of PKM2 only in treated sensitive cells, done by the fact that this protein is able to translocate to the nucleus of these cells in response to the drug and this is not observed in oxaliplatin resistant cells. Moreover, by using gene silencing and a 2-D DIGE approach, we obtained protein profiles associated to PKM2 presence/absence and we have determined possible proteins whose expression depends on that of PKM2 such as FKBP4 and HSC70. Finally, we have demonstrated that patients with the lowest PKM2 mRNA levels showed the worst response ratios to oxaliplatin-based first line treatment. Tumors from these patients presented more frequently p53 mutations linking these results with our in vitro study. To conclude, in this doctoral thesis we describe a new mechanism of oxaliplatin resistance acquisition in which PKM2 is an important player. Further investigations are guaranteed to elucidate molecular mechanisms underlying PKM2 functionality as well as to discover new pathways to interfere in acquired resistance to this platinum agent.

El manejo de la leishmaniosis visceral sigue siendo un desafío sobre todo en los casos de coinfección con el VIH. El principal reto aparece una vez el paciente ha sido diagnosticado y tratado por primera vez de leishmaniosis visceral. La evolución natural de la enfermedad en estos pacientes, va a estar determinada por las recidivas clínicas en mayor o menor medida. La escasez de trabajos y por tanto de evidencia científica deja desamparados a los clínicos que han de hacer frente a esta realidad. El TARGA únicamente va a espaciar los periodos entre recidiva y recidiva, ya que no será hasta que el paciente adquiera una inmunidad protectora suficiente y mantenida (que se ha establecido en 200 linfocitos CD4/mL mantenidos durante un mínimo de 6 meses) que puede estar en riesgo de desarrollar un nuevo episodio. Por ese motivo parece razonable que hasta que no se alcance ese umbral los pacientes van a necesitar en primer lugar, la instauración de una quimioprofilaxis secundaria seguido de un estrecho seguimiento para así poder detectar los futuros nuevos episodios. En nuestro medio, los medicamentos que tenemos disponibles con esta indicación son la Amfotericina B Liposomal y las sales de antimonio, en concreto el Antimoniato de meglumina. Estos medicamentos son diferentes tanto en mecanismo de acción, perfil de seguridad y sobre todo precio. No existen datos sobre la efectividad de Amfotericina B Liposomal como quimioprofilaxis secundaria para prevenir nuevos episodios de LV. Los argumentos para la elección de cualquiera de ellos se basan en experiencias marginales y comentarios de expertos. Por otra parte, el seguimiento de los pacientes y por tanto el diagnóstico de las nuevas recidivas se basa actualmente en la repetición de los procedimientos diagnósticos utilizados en el diagnóstico inicial (aspirado de médula ósea, cultivo de tejidos o diagnóstico histológico de biopsias). Estos métodos son cruentos, molestos para el paciente y no exentos de complicaciones. Desafortunadamente, técnicas menos invasivas como la serología no han demostrado su utilidad en este contexto. Incorporar técnicas de biología molecular como lo es la PCR ha demostrado ser muy útil en el diagnóstico inicial de estos pacientes. El problema surge al interpretar los resultados en pacientes que habitan en zonas endémicas del parásito, dónde la población general está naturalmente expuesta a través de la picadura del phlebotomo. Conocer la cinética del parásito y por tanto una cuantificación del mismo una vez tratado el paciente, sería de gran utilidad para hacer un enfoque adecuado de su seguimiento. / The management of visceral leishmaniasis remains a challenge especially in cases of co-infection with HIV. The main challenge appears once the patient has been diagnosed of visceral leishmaniasis and treated for the first time. The natural history of the disease in these patients will be determined by clinical relapses greater or lesser extent. The scarcity of clinical trials and therefore an adequate level of evidence left clinicians helpless, when they have to face this reality. The TARGA only will space the periods between relapse and recurrence, and it will not be until the patient acquires a sustained sufficient protective immunity (which is set to 200 lymphocytes CD4 / mL maintained for at least 6 months) which may be at risk of developing a new episode. Therefore, it seems reasonable that until that threshold is reached patients will need first, the establishment of a secondary chemoprophylaxis followed by a closed monitor in order to identify future new episodes. In our environment, we have available drugs for this indication are Liposomal Amphotericin B and antimony salts (meglumine antimoniate). These drugs are different in mechanism of action, safety profile and especially price. There are no data on the effectiveness of Liposomal Amphotericin B as secondary chemoprophylaxis to prevent new episodes of LV. The arguments for choosing any of them are based on marginal experiences and opinions of experts. Moreover, monitoring of patients and therefore the diagnosis of new relapses is currently based on the repetition of diagnostic procedures used in the initial diagnosis (bone marrow aspirate, tissue culture or histologic diagnosis of biopsies). These methods are invasive, uncomfortable for the patient and not without complications. Unfortunately, less invasive techniques such as serology have not proven useful in this context. Incorporating molecular biology techniques such as the PCR has been proved to be very useful in the initial diagnosis of these patients. The problem arises when interpreting results in patients living in endemic areas of the parasite, where the general population is naturally exposed through the bite of phlebotomus. To understand the kinetics of the parasite and therefore a quantification of that once treated the patient, it would be useful to make a suitable approach monitoring.

L'hepatitis E es presenta de forma esporàdica als països industrialitzats i es creu que el porc és el seu principal reservori. La possibilitat que l'origen de l'infecció o el seu manteniment en una regió sigui la població animal cal estudiar-la més a fons a causa que no es coneix de forma clara el risc de transmissió del porc a les persones. D'altra banda, encara no es coneixen exactament els mecanismes d'infecció del virus de l'hepatitis E (VHE) tan a les persones com en els animals. Així doncs, els objectius principals d'aquesta tesi s'han centrat a conèixer els aspectes epidemiològics d'aquesta infecció a la població porcina espanyola i a desenvolupar un model animal que permeti estudiar millor la infecció natural del virus en el porc. Per tal d'assolir els objectius anteriors, es varen dissenyar quatre estudis. En primer lloc, es va dur a terme un estudi serològic retrospectiu amb l'objectiu de conèixer la prevalença de la infecció del VHE en el porc i poder determinar el moment d'aparició de la infecció a Espanya (Estudi I). S'analitzaren un total de 2871 mostres de sèrum corresponents a 208 granges porcines espanyoles des de l'any 1985 fins el 1996. Els resultats demostraren que l'infecció pel VHE ha estat present a la població porcina espanyola almenys des de l'any 1985. El fet que no hi haguessin diferències significatives entre les prevalences al llarg dels anys analitzats, indicava probablement que la circulació del VHE ha estat endèmica a les explotacions porcines des de fa dècades. En segon lloc, per tal de conèixer millor la dinàmica d'infecció i mode de manteniment del VHE a les granges porcines es realitzà un estudi longitudinal prospectiu en sis granges de cicle tancat, amb sistemes de producció i densitats d'animals semblants (Estudi II). Els animals se seguiren fins a escorxador per determinar-ne el percentatge d'infectats i poder valorar el possible risc del VHE per a les persones. Els resultats mostraren que les granges podien tenir dinàmiques d'infecció diferents i que en alguns casos els animals podien arribar a l'edat de sacrifici sent seronegatius però havent-se infectat al final de l'engreix. A l'escorxador, es va detectar el virus en un 12% dels animals, dels quals un 6% eren fetges i l'altre 6% eren bilis. La presència del VHE en aquests òrgans podria representar un risc per a les persones especialment durant la seva manipulació i per la possible contaminació creuada amb altres aliments frescos. En tercer lloc, es comparà l'utilització del suc de diafragma i el sèrum per la detecció d'anticossos, amb l'objectiu d'investigar mètodes de diagnòstic immunològic alternatius pel VHE a l'escorxador (Estudi III). L'anàlisi de les mostres per ELISA anti-IgG demostrà que el sèrum i el suc muscular tenien resultats comparables i que per tant, ambdues podien ser utilitzades pel control serològic del VHE a les granges porcines. La simplicitat de la recollida de la mostra de diafragma a l'escorxador, podria facilitar en un futur el monitoratge de l'estatus de les granges en relació a la infecció pel VHE. Finalment, es dugué a terme una infecció experimental amb l'objectiu d'estudiar la via de transmissió natural en el porc per inoculació oral d'un nombre significatiu d'animals i alhora investigar la possibilitat d'infecció per contacte directe amb animals sentinella (Estudi IV). Els resultats demostraren la dificultat de reproduir la infecció oral del VHE ja que només 4 de 16 animals inoculats desenvoluparen infecció. Per altra banda, els animals que es varen infectar van ser capaços de transmetre amb èxit la infecció per contacte directe a porcs sentinella. / Hepatitis E is a human infection which is thought to have the pig as the main animal reservoir. The possibility that swine might be the responsible of hepatitis E virus (HEV) circulation in these regions and what is more, the potential zoonotic transmission from pigs to humans, has to be further studied. On the other hand, the lack of a practical animal model has hindered a better knowledge of human and animal HEV infection mechanisms. Thus, the main objectives of the present thesis were to go in depth in the epidemiological situation of HEV in the Spanish pig livestock and to develop an animal model that would allow a better study of the natural HEV infection in swine. To achieve these goals four studies were designed. Firstly, a retrospective serological study was developed to determine the HEV infection prevalence in swine in order to elucidate when HEV appeared in Spain (Study I). A total of 2871 serum samples corresponding to 208 farms of Spain gathered between 1985 and 1997 were tested. The results showed that HEV was widespread in Spanish swine farms at least since 1985. The infection within the farms seems stable throughout years, thus HEV infection in swine should be considered enzootic in Spain. In a second part, a longitudinal study was carried out in six Spanish farrow-to-finish swine herds, with similar production systems and size, in order to determine the infection dynamics and the persistence way of HEV in swine farms (Study II). Animals were followed until the slaughterhouse to know the proportion of HEV infected animals and evaluate the possibility of human transmission. Slight differences in antibody dynamics of HEV infection were found in the 6 studied farms and in some cases, animals infected at the latest production stage could arrive seronegative at the abattoir. The virus was detected in a total of 12% of slaughter pigs where 6% corresponded to positive livers and the other 6% to positive biles. Manipulation and cross-contamination of these infected organs with other fresh food may represent a risk for human population. A third study (Study III) was carried out to investigate the use of the diaphragm muscle fluid sample as an alternative to serum for detecting anti-HEV antibodies by ELISA in slaughter pigs. The study showed that both tests had global agreement of results; therefore, muscle fluid can be used as an alternative to serum for serologic detection of HEV antibodies in slaughter pigs. The simplicity of sample collection of this method offers new possibilities which will facilitate monitoring of pig herds regarding HEV infection. Finally, an experimental infection was performed to explore the most likely natural route of infection by oral inoculation of a larger group of pigs and to investigate the possibility of infection by direct contact to sentinel animals (Study IV). The results from this study demonstrated the difficulty to reproduce the oral HEV infection since only 4 out of 16 inoculated animals got infection. Although few animals had evidence of infection, those animals were able to successfully transmit the virus to direct contact exposure sentinels.

Los metales son ubicuos y su acumulación cada vez mayor en el ambiente conduce a serias preocupaciones en términos de seguridad ambiental, ocupacional y del consumidor. Entre otros efectos potenciales sobre la salud, la carcinogenicidad y la neurotoxicidad inducidas por los metales representan un riesgo importante para la sociedad humana y, por lo tanto, merecen ser determinadas completamente. En este contexto, se necesita llevar a cabo un amplio proyecto de investigación in vitro en estas áreas en compuestos metálicos seleccionados. El trabajo se refiere a investigaciones en metalómica destinadas a estudiar las rutas metabólicas de compuestos caracterizados de As, Cd, Cr, Pt, Mn y V mediante modelos experimentales desarrollados en ECVAM, como las líneas celulares de fibroblasto de ratón (Balb/3T3), las variedades de células del feocromocitoma de la rata (PC12) y reagregados de cerebro de rata y sus tipos celulares individuales. Los estudios se han realizado usando técnicas nucleares y radioanalíticas (análisis por activación de neutrones (NAA), radiotrazadores con alta radiactividad específica) y técnicas espectrométricas avanzadas (HPLC-ICPMS y GFAAS). Incluyen la especiación en relación al comportamiento de los compuestos metálicos en los medios de cultivo celular, su absorción, distribución intracelular del metal, y unión con los componentes celulares.Etapas del proyecto de investigación:(i) preparación de los radiotrazadores para etiquetar las diferentes concentraciones de los compuestos metálicos(ii) exposición de modelos in vitro estandardizados a los compuestos estables y/o metales marcados radioactivamente para diferentes periodos de tiempo y rango de concentración(iii) estudios mecanísticos que permitan establecer la relación dosis-efecto en cuanto a la absorción del metal estudiado por todos los compartimentos celulares, como se obtiene por centrifugación diferencial y por técnicas de filtración de gel. Determinación del estado de oxidación del metaloma en los compartimentos de la célula (iv) tratamiento estadístico de los datos y desarrollo de modelos metabólicos. / Metals are ubiquitous and increasing accumulation in the environment raises serious concerns in terms of environmental, occupational and consumer safety. Among other potential health effects, metal-induced carcinogenicity and neurotoxicity represent a major risk to the human society and therefore deserves to be fully assessed. In this context, a comprehensive in vitro research project in these areas needs to be conducted on selected metal compounds.The work concern in vitro metallomics investigations concerning metabolic pathways of chemically-characterized As, Cd, Cr, Pt, Mn and V compounds by experimental models developed at ECVAM, such as mouse fibroblast (Balb/3T3), rat pheochromocytoma (PC12) cell lines and rat brain re-aggregates and their individual cell types. The studies will be carried out by using nuclear, radioanalytical (neutron activation analysis (NAA) and use of radiotracers with high specific radioactivity) and advanced spectrochemical (HPLC-ICPMS and GFAAS) techniques. They will include metal speciation concerning behaviour of test metal compounds in cell culture media, uptake, intracellular distribution, binding with cell components.Steps of the research project:(i) preparation of radiotracers for labelling of different concentrations of metal compounds(ii) exposure of standardised in vitro models to stable and/or radiolabelled metal compounds for different time periods and range of concentration(iii) mechanistic studies involving the establishment of dose-effect relationship in relation to uptake of metal tested by whole cell compartments as obtained by differential centrifugation as well as gel filtration techniques. Determination of the oxidation state of metallome in cell compartments(iv) statistical treatment of the data and development of metabolic models.

OBJETIVOS:1. Caracterizar la epidemiología molecular del VIH&#8208;1 en mujeres embarazadas en Manhiça, Mozambique, y analizar la evolución genética entre 1999 y 2004.2. Evaluar el impacto del tratamiento intermitente antimalárico (IPTp) con dos dosis de sulfadoxina&#8208;pirimetamina (SP) durante el 2º y 3º trimestre del embarazo en la transmisión vertical del VIH&#8208;1.3. Evaluar la relación entre la infección materna por P. falciparum y la activación del sistema inmunitario en el momento del parto en mujeres embarazadas VIH&#8208;positivas.CONCLUSIONES:4. Todos los secuencias analizadas tanto de 1999 como del 2004 pertenecían al subtipo C y presentaban gran variación genética con la existencia de diferentes sublinajes circulantes del subtipo C.5. Los resultados del análisis de divergencia genética de estas secuencias sugieren que en la diversificación viral estuvieron implicadas fuerzas de selección positivas (mutaciones en aminoácidos que mejoran la aptitud del virus).6. No observamos diferencias significativas en la carga viral o en el riesgo de MTCT del VIH&#8208;1 entre el grupo SP y el placebo, a pesar de que el SP consiguió reducir significativamente la malaria periférica y la malaria placentaria activa.7. La carga viral plasmática del VIH&#8208;1 estaba asociada con un incremento del riesgo de MTCT del VIH&#8208;1.8. Las mujeres con anemia (hematocrito<33%) en este estudio tenían un riesgo hasta 4 veces mayor de MTCT de VIH&#8208;1 que las mujeres sin anemia y está relación era independiente de la carga viral plasmática del VIH &#8208;1, del grupo de tratamiento y de la infección por P. falciparum.9. La malaria placentaria (tanto activa como pasada) estaba asociada con un menor riesgo de MTCT del VIH&#8208;1 en el análisis multivariado.10. Las mujeres VIH&#8208;positivas con malaria periférica tenían niveles significativamente mayores de IL&#8208;10 y MIP&#8208;1&#946; que las mujeres sin malaria periférica.11. No se observó ninguna diferencia significativa entre las mujeres con y sin malaria placentaria para ninguna de las citoquinas placentarias analizadas.PALABRAS CLAVE: VIH&#8208;1, Plasmodium falciparum, transmisión vertical, África, anemia, subtipos VIH&#8208;1, citoquinas. / TEXT:A) OBJECTIVES: 1. To characterize the molecular epidemiology of HIV&#8208;1 in pregnant women from Manhiça, Mozambique, as well as to analyze the genetic evolution from 1999 to 2004.2. To evaluate the impact of intermittent preventive treatment during pregnancy (IPTp) with two doses of sulphadoxine&#8208;pyrimethamine during the second and third quarter of pregnancy in the mother&#8208;to&#8208;child transmission (MTCT) of HIV&#8208;1.3. To evaluate the relationship between maternal "P. falciparum" infection and the activation of the immune system at delivery in HIV&#8208;positive pregnant women.B) CONCLUSIONS:1. All sequences analyzed were subtype C and showed great genetic variability with the existence of different circulating sublinages of subtype C.2. The results of the analysis of genetic divergence on these sequences suggest that positive selection forces were involved in the viral diversification.3. We did not observe statistically significant differences in the HIV&#8208;1 viral load or in the risk of MTCT of HIV&#8208;1 between the SP and the placebo group, although the SP did significantly reduce both peripheral and placental malaria.4. HIV&#8208;1 viral load was associated with an increase in the risk of MTCT of HIV&#8208;1.5. Women with anemia (hematocrit<33%) in this study had 4 times the risk of MTCT of HIV&#8208;1 as compared to women without anemia and this association was independent of the HIV&#8208;1 viral load, the treatment group and the "P. falciparum" infection.6. Placental malaria (both active and past) was associated with a reduced risk of MTCT of HIV&#8208;1 en the multivariate analysis.7. HIV&#8208;positive women with peripheral malaria had significantly higher levels of IL&#8208;10 and MIP&#8208;1&#946; than women without peripheral malaria.8. No significant difference was observed between women with and without placental malaria for none of the placental cytokines analyzed.

Malaria has a high toll on the lives of infants and children under the age of five in endemic areas. Control, and more recently, elimination agendas consist on implementing several measures simultaneously, including vector control, vaccines and drugs. The current Millenium Development Goals aim at reducing malaria mortality and morbidity in the two most vulnerable groups: pregnant women and children. Intermittent Preventive Treatment in Infants with Sulphadoxine‐Pyrimethamine (IPTi-SP) delivered through routine EPI vaccination programs has shown to be efficacious in different transmission settings and the WHO has recently recommended its implementation as a malaria control tool. However, one of the main concerns has been the potential impairment of acquisition of naturally acquired immunity, and this could be a concern regarding IPTi. This thesis reports on a series of studies conducted in a malaria endemic area of Manhiça, Mozambique, to assess the impact of IPTi‐SP on the development of immune responses to the Plasmodium falciparum parasite. In this work, we measured antibody and cellular immune parameters considered to be the most appropriate markers of protective immunity against malaria identified to date. The most consistent finding was that IPTi-SP does not modify the magnitude of the immune responses acquired over the first two years of age in Mozambican children. In addition, we described the factors that affect the antibody and cellular immune responses, and reported those that correlated with prospective malaria incidence. Based on the studies presented herein, we can conclude that IPTi‐SP does not interfere with immune responses that are considered major contributors to the acquisition of protective immunity to malaria in early infancy. In summary, this thesis contributes to a more complete assessment of IPTi as a control measure that will possibly be implemented in the near future in malaria endemic areas of Africa and of the world. In addition, it aims to contribute to advance the knowledge on the acquisition of natural immunity in infancy which is poorly understood. Furthermore, this information will help to understand the factors that should be taken into account when designing and deploying other control measures for this age group.

En 1977 iniciamos un proyecto de investigación clínica en torno a las infecciones del SNC, parte del cual consistió en la elaboración de un protocolo de estudio de las meningitis bacterianas. Trece años después, a finales de 1989, habían sido incluidos definitivamente en el protocolo 797 episodios de meningitis, entre los cuales se hallaban 132 episodios de meningitis neumocócica, objeto del presente estudio.La meningitis neumocócica del adulto despertó desde el principio nuestro interés debido a su especial gravedad y a las dificultades existentes en su tratamiento. Nos preocupó fundamentalmente que su pronóstico, en cuanto a mortalidad y desarrollo de secuelas neurológicas en los supervivientes, apenas hubiese mejorado en los últimos treinta años, a pesar de la introducción de nuevos antibióticos con gran actividad bactericida. La ulterior aparición y aumento progresivo del número de cepas de neumococo resistentes a la penicilina y a otros antibióticos supuso otra complicación adicional para el manejo adecuado de estos pacientes.Los objetivos concretos de nuestro estudio fueron:l. - Delimitar la situación actual de la meningitis neumocócica en el contexto de la meningitis bacteriana del adulto.2.- Conocer la actividad "in vitro" de los antimicrobianos frente a las cepas de "S. pneumoniae" causantes de meningitis.3. - Determinar la epidemiología y las características clínicas y evolutivas de la meningitis causada por neumococos resistentes a la penicilina en nuestro medio.4.- Establecer el papel de la penicilina G, cefalosporinas de tercera generación y vancomicina en el tratamiento de la meningitis causada por neumococos resistentes.5.- Determinar los factores pronósticos de la meningitis neumocócica.6. - Evaluar la influencia del tratamiento asociado en la evolución de la meningitis neumocócica.Los datos de los pacientes, tanto clínicos como de laboratorio, fueron recogidos en un protocolo informatizado de 115 variables, definidas previamente, rellenado una vez que el paciente era dado de alta y completado tras el seguimiento en consultas externas. Con posterioridad los datos se incluyeron en una base de datos (DBase III plus) y fueron explotados estadísticamente.Se realizó un análisis multivariado de la mortalidad global y de la atribuible directamente a la infección.Las intervenciones más importantes efectuadas fueron la introducción de las cefalosporinas de 3ª generación, como tratamiento antibiótico inicial en 1986 y la administración precoz y sistemática de manitol, dexametasona y difenilhidantoina, como tratamiento asociado a los antibióticos.Se realizó un estudio caso-control "matched" para analizar la influencia del tratamiento asociado a los antibióticos en la reducción de la mortalidad. Los cálculos estadísticos se realizaron en un microordenador mediante los paquetes SPSS y BMOP.Las principales conclusiones del estudio fueron:En nuestra comunidad, el neumococo es causa de una cuarta parte del total de casos de meningitis bacteriana, y de la mitad de aquellos casos que cursan sin púrpura. .En un 80-85% de pacientes con meningitis neumocócica puede detectarse el foco de origen de la infección, hecho que ocurre con mucha menor frecuencia en el resto de etiologías. En consecuencia, alrededor de las tres cuartas partes de casos de meningitis de la comunidad asociados a otitis media aguda, sinusitis, neumonía ó fístula de LCR, van a ser de etiología neumocócica.El neumococo es causa poco frecuente de meningitis nosocomial, habiendo originado un 7% de nuestros casos.La meningitis neumocócica sigue siendo una enfermedad muy grave, de peor pronóstico que la ocasionada por otros patógenos meníngeos clásicos como meningococo ó hemofilus. En nuestra serie, su tasa de mortalidad específica fue del 29%, sólo superada por la de los bacilos Gram negativos. Asimismo, en cifras absolutas, fue la etiología que ocasionó un mayor número de fallecimientos.La resistencia del neumococo a la penicilina ha aumentado de forma progresiva durante el período de estudio, tanto en frecuencia como en grado.El porcentaje global de resistencia en nuestra serie ha sido del 27,5%.En la actualidad, estimamos que la probabilidad de que una meningitis neumocócica sea causada por una cepa con sensibilidad disminuida a la penicilina es el 50%, y que la mitad de las cepas con sensibilidad disminuida son altamente resistentes.Asimismo, la probabilidad de resistencia al cloramfenicol y al cotrimoxazol es de 35 % y 50 %, respectivamente.El 75 % de las cepas resistentes a penicilina muestran resistencia múltiple. La cefotaxima, la ceftriaxona y el imipeném son los antibióticos betalactámicos más activos frente a los neumococos resistentes a la penicilina. No hemos hallado cepas de neumococo resistentes a la vancomicina ni a la rifampicina.No observamos diferencias importantes (epidemiológicas, clínicas y evolutivas), entre los casos de meningitis causados por neumococos sensibles ó resistentes a la penicilina. Sin embargo, los casos resistentes con mayor frecuencia fueron ocasionados por el serotipo 23, eran de adquisición nosocomial, y habían recibido antibióticos previos.La penicilina debe reservarse exclusivamente para el tratamiento de las meningitis causadas por neumococos sensibles, puesto que ni con la utilización de dosis masivas puede garantizarse la curación bacteriológica de los casos con resistencia moderada.La cefotaxima y la ceftriaxona constituyen el tratamiento de elección de la meningitis neumocócica, antes de conocer la sensibilidad de la cepa causal. Ambas se han mostrado eficaces en los casos causados por neumococos con CBMs a la penicilina de hasta 4 mcg/ml.La vancomicina no debe ser utilizada como tratamiento de rutina de la meningitis causada por neumococos resistentes r debido a su alto índice de recaídas.Debe reservarse para casos de alta resistencia que no hayan respondido a la cefotaxima y para casos seleccionados de alergia a betalactámicos, siempre que sean resistentes al cloramfenicol.Los factores que se asociaron de forma independiente con una mayor mortalidad global fueron: la presencia de shock al ingreso (RR 8.1), la edad superior a 65 años (RR 4.6), el desarrollo de complicaciones pulmonares durante el ingreso (RR 4.6) y el que la infección hubiese tenido un foco de origen distante del SNC (RR 3.3).Los factores que se asociaron de forma independiente con una mayor mortalidad por la propia infección fueron: la presencia de shock al ingreso (RR 4.73) y el que la infección hubiese tenido un foco de origen distante del SNC (RR 4.4).En el subgrupo de pacientes con meningitis de foco de origen contiguo al SNC, sólo el desarrollo de convulsiones tras el ingreso (RR 4.9) se asoció de forma independiente con una mayor mortalidad por la propia infección.Mediante la administración sistemática y precoz de manital, dexametasona y difenilhidantoina, como tratamiento asociado a los antibióticos, conseguimos reducir muy significativamente la mortalidad de nuestros pacientes.Así pues, concluimos que la utilización de dicho tratamiento asociado parece constituir un gran avance en el manejo de los pacientes con meningitis neumocócica. / We studied 132 episodes of adult pneumococcal meningitis (PM) as a part of a prospective study involving 797 cases of' bacterial meningitis observed from 1977 to 1989. The main objectives were: l) to know the "in vitro" activity of' different antimicrobial agents against the strains of pneumococci in our area, 2) to know the epidemiology, characteristics and outcome of the PM due to resistant strains, 3) to determine the best therapy for such infections, 4): to determine the prognostic factors of PM, and 5) to evaluate the effects of an adjunctive therapy on the outcome.We observed a sustained tendency towards increasing resistance of pneumococci to peniciline, cloramphenicol and cotrimoxazol. The current penicillin and cloranphenicol resistances approach 50%. The recommended initial therapy for a PM in our area is Cefrotaxime in doses of 300 mg/Kg/day. The major independent factors influencing mortality are the age of patients, the presence of shock on admission and the source of the infection. The early administration of manitol, dexamethasone and phenytoin as an adjunctive therapy to antibiotics, reduced significantly the mortality (from 30 to 5%) and thus appears to be a major advance in the therapy of PM.

1) INTRODUCCIÓN:El valor de los exámenes microbiológicos (EM) que se obtienen durante la AC es motivo de controversia. La forma de obtención de las muestras y el tiempo transcurrido entre el fallecimiento y la realización de la AC, podrían ser factores que explicarían la alta frecuencia de contaminación postmortem. Así, la realización de una PAAF (técnica de alta rentabilidad diagnóstica en procesos infecciosos) en el PI podría contribuir a aumentar la fiabilidad de los cultivos.2) OBJETIVOS:Valorar los resultados de los cultivos obtenidos en la AC, en el PI, comparación entre ambos y con los cultivos realizados en vida. Evaluación de los aislamientos de "Candida spp".3) PACIENTES Y MÉTODOS:Se incluyeron, de forma prospectiva, 94 pacientes fallecidos en el Hospital General de Granollers desde Abril 1991 hasta Abril 1994. Se incluyeron los pacientes > 14 años, en los que se indicó la realización de AC, no se movilizó el cadáver y las punciones del PI se realizaron en las primeras 3 horas tras el fallecimiento. Se obtenían muestras de hígado y bazo (bajo control ecográfico), hemocultivo por punción cardíaca y lóbulo inferior del pulmón derecho. También de muestras donde se sospechase infección. Las muestras se cultivaron de forma inmediata (cultivos para bacterias, micobacterias y hongos). Durante la AC se obtenían muestras de las mismas localizaciones para cultivo. Se registraron los tiempos desde el exitus hasta la toma de las muestras.Posteriormente se analizó cada caso (datos clínicos, autópsicos y microbiológicos constituyeron el gold-standard) decidiéndose si existía o no infección. El análisis de los datos se realizó mediante la gamma-2 y la "t" de Student. Se estimaron los índices de sensibilidad (S), especificidad (E) y valores predictivos (VP).4) RESULTADOS:Se evaluaron 92 pacientes (59 hombres y 33 mujeres) con una edad media de 67.7 años. En 47 pacientes de consideró que existía una enfermedad infecciosa. Se aislaron 403 microorganismos, valorándose 223 como colonizantes (73.5 % obtenidos durante la AC).En la AC la S fue del 87.2 % la E 44.4 %. En el PPI la S fue del 80.9 % y la E del 66.7 %.Se contabilizaron 45 aislamientos de "Candida spp" que correspondieron a 29 pacientes, no relacionándose con enfermedad de base o toma de antibióticos.5) CONCLUSIONES:La S de los EM obtenidos en la AC es del 87.2% y la E del 44%.La S de los EM obtenidos en el PPI es del 80.9 % y la E del 66.7%De los 223 microorganismos valorados como contaminantes, el 73.5% se aislaron en los cultivos obtenidos en la autopsia. El aislamiento de microorganismos valorados como colonizantes se relacionó con el tiempo en que se realizó la AC: a mayor tiempo, mayor número de gérmenes. Los cultivos del LID fueron los que mostraron mayor rentabilidad.La correlación de los cultivos obtenidos en vida se correlacionó mejor con los obtenidos en el PPI que con los obtenidos en la AC."Candida spp." se aisló en 29 pacientes, considerándose patógeno sólo en 4. Fue el microorganismo, valorado como colonizante, que se aisló con mayor frecuencia. Las enfermedades de base y la toma de antibióticos no se relacionaron con el aislamiento de "Candida spp".La PAAF realizada en el PPI es una exploración complementaria útil para el diagnóstico de procesos infecciosos no diagnosticados en vida. Puede aportar información adicional a los cultivos realizados en la AC o, puede ser de utilidad cuando exista sospecha de infección y la autopsia no pueda realizarse. / 1) Background:The real usefulness and clinical relevance of postmortem microbiologic studies has been largely discussed, but it still remains controversial. Results obtained in some studies have pointed out a discrepancy between positive post-mortem cultures and clinical data in the same patient.2) Objetives:Make some comparative analysis between FNAP cultures obtained in the immediate post-mortem period (IPP) and those obtained by conventional autopsy.3) Methods:All adult autopsied patients who died at a general teaching hospital in a 3-year period were included. Clinical data, microbiological cultures before death and pathologic data from autopsies were recorded, as were results of FNAP performed after death (first three hours) from the heart, right lower lung, liver spleen and other areas suspicious for infection. Cultures from the same sites were made at autopsy. Microorganisms were isolated and defined as infectious, colonizers or contaminants agents according to standard criteria.4) Results:Ninety-two patients (59 men, 33 women) were included. Patients had a mean age of 67.7 years. Infection was suspected in 47 patients. Autopsy was performed 12 hours after death or later in 61 % of patients. The sensitivity of FNAP and autopsy was similar (80.9% vs 87 %), but FNAP was more specific (66.7% vs 44.4%).5) Conclusions:Fine-needle aspiration puncture performed in the immediate post-mortem period adds relevant microbiological information to the clinico-pathologic picture and provides higher specificity than autopsy cultures. When difficulties are associated with autopsy examination or in cases of selected clinical conditions, FNAP can be an effective tool for the post-mortem diagnosis of infection.