Plasmodium vivax agente etiológico de la malaria, exhibe una gran variabilidad genética durante episodios recurrentes de la enfermedad. Esta recurrencia es informada como de baja prevalencia asociada con la malaria asintomática. Así mismo los episodios recurrentes (reinfecciones o relapsos) a menudo pueden ser confundidos por resistencia a fármacos como la cloroquina. Por lo tanto el objetivo principal de este estudio fue relacionar los patrones de recurrencia y la resistencia con la variabilidad genética de P. vivax. En este estudio se evaluaron las muestras secuenciales de individuos provenientes de una región endémica del Perú (Mazán-Iquitos), diagnosticados previamente con malaria, por microscopía, durante seguimientos activos y sometidos a un régimen de tratamiento estándar con cloroquina. La genotipificación realizada en base al gen pvmsp3-α, utilizando el Nested PCR y la digestión enzimática, permitió identificar una alta variabilidad genética de P. vivax, a partir de la cual, se identificaron los patrones de recurrencia, establecidos como relapsos, a partir de estadios latentes o hipnozoitos homólogos (con haplotipos idénticos) y reinfecciones (con haplotipos diferentes). Los rangos de tiempo permitieron una identificación más precisa, observándose mayores frecuencias de relapsos por hipnozoitos homólogos antes de los 90 días post-primera evaluación y mayores frecuencias de reinfecciones después de este periodo. Así mismo las recurrencias en el primer periodo de tiempo, por haplotipos diferentes, pueden deberse también a hipnozoitos heterólogos. Complementando el estudio, el análisis de secuenciamiento del gen pvmdr1, permitió identificar SNPs, codificantes de mutaciones no sinónimas, relacionadas con resistencia a cloroquina. Estos SNPs, a través del software U-Melt (análisis in sílico), presentaron variaciones en las temperaturas de fusión. Finalmente los resultados de cuantificación relativa con qPCR Real Time no mostraron diferencias significativas en el número de copias del gen pvmdr1. Palabras clave: Cloroquina, Genotipificación, Haplotipos, Hipnozoito, Malaria Asintomática, Recurrencia, Variabilidad. / --- Plasmodium vivax etiologic agent of malaria has a large genetic variability during recurrent episodes of the disease. This recurrence is reported as low prevalence associated with asymptomatic malaria. Also recurrent episodes (reinfection or relapse) can often be mistaken for drug resistance as chloroquine. Therefore the main objective of this study was to correlate the patterns of recurrence and resistance to the genetic variability of P. vivax. In this study, we evaluated the sequential samples of individuals from an endemic region of Peru (Mazán-Iquitos), previously diagnosed with malaria microscopy during active follows and subjected to a standard treatment regimen with chloroquine. Genotyping based on the pvmsp3-α gene, using Nested PCR and enzymatic digestion, identified high genetic variability of P. vivax, from which were identified recurrence patterns established as relapse, from latent stages or homologous hypnozoites (with identical haplotypes) and reinfections (with different haplotypes). The time ranges allow more accurate identification, with higher frequency of relapses by homologous hypnozoites before 90 days post-first evaluation and higher frequencies of reinfection after this period. Also recurrences in the first period of time, for different haplotypes may also be due to heterologous hypnozoites. Complementing the study, the sequencing analysis of the gene pvmdr1, identified SNPs, encoding nonsynonymous mutations related to resistance to chloroquine. These SNPs, through U-Melt software (in sílico analysis), showed variations in the melting temperatures. Finally the results of relative cuantification with Real Time qPCR no showed significant differences in copy number of the pvmdr1 gene.} Keywords: Chloroquine, Genotyping, Haplotypes, Hipnozoite, Recurrence, Asymptomatic Malaria, Variability. / Tesis

Plasmodium vivax agente etiológico de la malaria, exhibe una gran variabilidad genética durante episodios recurrentes de la enfermedad. Esta recurrencia es informada como de baja prevalencia asociada con la malaria asintomática. Así mismo los episodios recurrentes (reinfecciones o relapsos) a menudo pueden ser confundidos por resistencia a fármacos como la cloroquina. Por lo tanto el objetivo principal de este estudio fue relacionar los patrones de recurrencia y la resistencia con la variabilidad genética de P. vivax. En este estudio se evaluaron las muestras secuenciales de individuos provenientes de una región endémica del Perú (Mazán-Iquitos), diagnosticados previamente con malaria, por microscopía, durante seguimientos activos y sometidos a un régimen de tratamiento estándar con cloroquina. La genotipificación realizada en base al gen pvmsp3-α, utilizando el Nested PCR y la digestión enzimática, permitió identificar una alta variabilidad genética de P. vivax, a partir de la cual, se identificaron los patrones de recurrencia, establecidos como relapsos, a partir de estadios latentes o hipnozoitos homólogos (con haplotipos idénticos) y reinfecciones (con haplotipos diferentes). Los rangos de tiempo permitieron una identificación más precisa, observándose mayores frecuencias de relapsos por hipnozoitos homólogos antes de los 90 días post-primera evaluación y mayores frecuencias de reinfecciones después de este periodo. Así mismo las recurrencias en el primer periodo de tiempo, por haplotipos diferentes, pueden deberse también a hipnozoitos heterólogos. Complementando el estudio, el análisis de secuenciamiento del gen pvmdr1, permitió identificar SNPs, codificantes de mutaciones no sinónimas, relacionadas con resistencia a cloroquina. Estos SNPs, a través del software U-Melt (análisis in sílico), presentaron variaciones en las temperaturas de fusión. Finalmente los resultados de cuantificación relativa con qPCR Real Time no mostraron diferencias significativas en el número de copias del gen pvmdr1. Palabras clave: Cloroquina, Genotipificación, Haplotipos, Hipnozoito, Malaria Asintomática, Recurrencia, Variabilidad. / --- Plasmodium vivax etiologic agent of malaria has a large genetic variability during recurrent episodes of the disease. This recurrence is reported as low prevalence associated with asymptomatic malaria. Also recurrent episodes (reinfection or relapse) can often be mistaken for drug resistance as chloroquine. Therefore the main objective of this study was to correlate the patterns of recurrence and resistance to the genetic variability of P. vivax. In this study, we evaluated the sequential samples of individuals from an endemic region of Peru (Mazán-Iquitos), previously diagnosed with malaria microscopy during active follows and subjected to a standard treatment regimen with chloroquine. Genotyping based on the pvmsp3-α gene, using Nested PCR and enzymatic digestion, identified high genetic variability of P. vivax, from which were identified recurrence patterns established as relapse, from latent stages or homologous hypnozoites (with identical haplotypes) and reinfections (with different haplotypes). The time ranges allow more accurate identification, with higher frequency of relapses by homologous hypnozoites before 90 days post-first evaluation and higher frequencies of reinfection after this period. Also recurrences in the first period of time, for different haplotypes may also be due to heterologous hypnozoites. Complementing the study, the sequencing analysis of the gene pvmdr1, identified SNPs, encoding nonsynonymous mutations related to resistance to chloroquine. These SNPs, through U-Melt software (in sílico analysis), showed variations in the melting temperatures. Finally the results of relative cuantification with Real Time qPCR no showed significant differences in copy number of the pvmdr1 gene. Keywords: Chloroquine, Genotyping, Haplotypes, Hipnozoite, Recurrence, Asymptomatic Malaria, Variability.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-04-09T12:47:32Z : No. of bitstreams: 1 000812646.pdf: 3278478 bytes, checksum: eebfd378cb8c54ce9d512fd14c333c5e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A malária é uma das principais causas de morbidade e mortalidade nas áreas tropicais e subtropicais do mundo. O desenvolvimento de uma resposta imune eficaz é capaz de reduzir a mortalidade e os sintomas clínicos da doença. No entanto, este é um processo complexo, e um dos objetivos dos imunologistas é entender as razões pelas quais os indivíduos diferem em suas respostas imunes contra o parasito. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência de polimorfismos em genes coestimulatórios do sistema imune na resposta imune humoral contra proteínas de estágio sanguíneo do Plasmodium vivax, principal espécie causadora de malária no Brasil. Para tanto, nós genotipamos, pelo método de PCR-RFLP, nove SNPs em sete genes (CD28, CTLA4, ICOS, CD86, CD40, CD40L e BLYS). A amostra foi constituída por 227 indivíduos infectados com P. vivax no município de Goianésia do Pará, no Estado do Pará. As respostas de anticorpos IgG específicos contra as proteínas N- (ICB2-5) e C-terminal (MSP-119) da MSP-1, da DBP e da AMA-1 do P. vivax foram determinadas por ELISA. IgM e as subclasses de IgG contra a ICB2-5 também foram avaliadas. Para estudar os polimorfismos dos genes coestimulatórios, nós primeiramente investigamos o impacto da estratificação da população na distribuição dos polimorfismos com o auxilio de marcadores informativos de ancestralidade e demonstramos que a frequência dos SNPs ICOS +1564T>C, CD40L -726T>C e CD86 +1057G>A varia de acordo com a ancestralidade. Polimorfismos em genes coestimulatórios foram associados com a resposta de anticorpos contra proteínas do estágio sanguíneo do P. vivax, mais especificamente contra a DBP, e as porções N- e C-terminal da MSP-1. Além disso, haplótipos formados pelos genes CD28, CTLA4 e ICOS foram associados com a resposta de anticorpos IgG4 contra a região N-terminal da MSP-1. Este é o primeiro estudo de associação genética envolvendo polimorfismos em genes ... / Malaria is one of the main causes of morbidity and mortality in the tropics and subtropics areas of the world. Although the immunity is only partial, it is important in reducing the amount of illness and death caused by malaria. However, the immunity against malaria is complex, and one of the main goals of vaccine developers is to understand why people differ in their immune response to the parasite. The present research aims to investigate the genetic mechanisms related to humoral immune response against P. vivax blood stages antigens, predominant malaria species in Brazil. Nine single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 7 genes (CD28, CTLA4, ICOS, CD86, CD40, CD40L e BLYS) were determined by PCR-RFLP. A total of unrelated 227 individuals infected with P. vivax from the Goianésia do Pará, Pará state, participated in this study. Level and prevalence of IgG antibodies against N-terminal (ICB2-5) and C-terminal (MSP-119) regions of MSP-1, DBP and AMA-1 of P. vivax were measured by ELISA. First, we evaluate the influence of genomic ancestry on distributions of co-stimulatory genes polymorphisms in an admixed Brazilian population using ancestry informative markers. ICOS, CD40L and CD86 polymorphisms were associated with genomic ancestry. There were significant association between CD28 -372G>A, ICOS +1564T>C, and CD40L -726T>C SNPs with antibodies anti-DBP prevalence. Moreover, CD40 -1C>T and CD86 +1057G>A SNPs were associated with antibody levels anti-PvMSP-119. The CD28 -372G>A and CD40 -1C>T SNPs were associated with IgM prevalence against ICB2-5. Haplotypes formed by polymorphisms in CD28, CTLA4, and ICOS genes were associated with IgG4 antibodies against ICB2-5. This is the first study to associate polymorphisms in costimulatory genes with humoral immune response against P. vivax. These data may add important information for understanding the immunological aspects involved in vivax malaria

La malaria causada por Plasmodium vivax es la más predominante en los diferentes casos reportados en el Perú, siendo característico las infecciones asintomáticas y las muestras con baja parasitemia. La poca cantidad de ADN parasitario que se recupera de muestras de baja parasitemia de P. vivax (sub-microscópicas) limita la inclusión de esta población parasitaria en estudios de genética y genómica de poblaciones. La subestimación de la diversidad genética sesga el entendimiento de la transmisión de P. vivax, especialmente en condiciones de baja endemicidad, donde las infecciones sub-microscópicas son predominantes. Diferentes métodos han sido desarrollados para sobrellevar este problema, siendo la Amplificación selectiva del genoma completo (SWGA) una herramienta promisoria. Sin embargo, su efectividad aún no ha sido reportada en muestras de baja parasitemia de P. vivax. El objetivo de la tesis fue optimizar y estandarizar preliminarmente el método SWGA en muestras sub-microscópicas o de baja concentración de ADN de P. vivax. Para ello, se modificaron las condiciones del ciclado y componentes del método propuesto por Cowell et al. (2017) para mejorar el enriquecimiento de ADN parasitario, se calculó la cantidad mínima de ADN para una amplificación genómica exitosa, se evaluó la fidelidad del SWGA y se aplicó el método optimizado en ADN almacenado (-20°C) de 20 muestras de campo. Primero se modificaron diferentes componentes y parámetros del método SWGA, se cuantificó el ADN parasitario y humano por PCR tiempo real antes y después de la amplificación genómica; así se calculó el enriquecimiento del ADN parasitario. El método optimizado permitió que las muestras del panel (muestras simuladas) incrementaran su concentración de ADN parasitario (>805 veces) y porcentaje de ADN parasitario (>218 veces) en comparación a su estado inicial. La concentración mínima de ADN parasitario, para generar una amplificación genómica exitosa de más 1200 moléculas/µL, fue 1.29 moléculas/µL. Luego de la aplicación del método SWGA optimizado, el 97.22% de todos los alelos no presentaron diferencias en sus tamaños y solo hubo una pérdida de datos del 3.57%. El 80% de la muestras de campo tuvieron una amplificación genómica exitosa. Se demostró que el método optimizado mejoró su desempeño en el enriquecimiento del ADN de P. vivax a partir de ADN total, provenientes de muestras de baja densidad parasitaria, y así permitió una mayor cobertura de las muestras para ser incluidas en los análisis genéticos. / International Center of Excellence for Malaria Research / VLIR-UOS / Universidad Peruana Cayetano Heredia (Lima) / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Identifica genéticamente a especies de Plasmodium en base al gen que codifica la subunidad 18S ARNr en muestras de sangre de primates no humanos en cautiverio. El diseño de este estudio es observacional y transversal. Esta investigación es un estudio secundario en el que se usa muestras biológicas e información de un grupo de primates no humanos entre adultos, jóvenes y crías de ambos sexos pertenecientes al género Saimiri y Lagothrix evaluados durante los años 2011 y 2012 en algunas ciudades de Perú. El análisis es realizado mediante el software MEGA v6.0 y el programa Excel. Se realiza análisis descriptivo de las variables de las pruebas ensayadas usando los siguientes métodos: evaluación microscópica por gota gruesa, técnicas moleculares de PCR para confirmar la infección y secuenciamiento del gen 18S ARNr. Se encuentra que el 7.05 % (6/85) de primates no humanos están infectados con Plasmodium spp. En base al secuenciamiento y análisis filogenético molecular del gen 18S ARNr se observa infección por Plasmodium brasilianum en una muestra de primate Lagothrix lagotricha y por Plasmodium malariae en cuatro muestras de primates Saimiri sciureus. Concluye que los parásitos identificados en las muestras de estudio son Plasmodium malariae y Plasmodium brasilianum, este último previamente reportado como especie que infecta a primates no humanos del Nuevo Mundo. / Tesis