Introduction: Chronic wounds are a great burden to care-givers and patients alike and are the main cause of many preventable amputations. Such wounds are treated with wound dressings but providing a wound environment that is conducive to proper wound healing is not always possible with such dressings. Absorbatox™ is a natural zeolite that has been manipulated to increase its cationic exchange capacity and has its main functionality as a potential wound healing agent in its strong capillary action. This quality enables the zeolite to absorb excess wound exudate and thus prevent wound infection and maceration. Absorbatox™ was characterised to determine its effects on wound healing. Methods: The physical characterisation of two grades of Absorbatox™ - granular and micronised - was conducted using nitrogen adsorption to determine pore size and surface area, and laser particle sizing to determine the particle sizes of the Absorbatox™ particles. Full-thickness wounds of 8 x 8 mm were created on the backs of pigs and treated with Absorbatox™, a positive and a negative control. The wound dimensions were measured and recorded. The wounds were then excised on selected days of each phase of wound healing and fixed in formalin. The wound sections were analysed by mass spectrometry imaging and abundant wound proteins were identified from the tryptic digests using BLAST against the Swiss-Prot database. Results: The surface areas of the micronised and granular Absorbatox™ were 14.43 and 11.23 m2/g, respectively. The micronised Absorbatox™ particle sizes ranged between 0.8 µm to approximately 300 µm with an average pore diameter of 28.2 nm. The granular Absorbatox™ particle sizes ranged between 2 µm and 875 µm with average pore diameters of 43.8 nm. Absorbatox™ showed better wound healing by delaying wound contraction and causing more rapid shallowing of the wound depths compared to the negative control. The difference observed in the wound healing rates of the Absorbatox™-treated and positive control groups were statistically significant and the histological evaluations of the wounds treated with Absorbatox™ showed wound closures that were associated with qualities that more closely resembled normal, healthy tissue than the positive control wounds. The protein activity in the trypsin-digested tissue including within the wound area and the surrounding healthy tissue was successfully imaged using MALDI-MSI. BLAST software was used at an e-value of 30 to identify possible proteins from the tryptic digests and were identified as proteins involved in wound healing. Discussion: Micronised Absorbatox™ treated wounds showed more rapid healing than the other treatments most likely due to the smaller particles and pores which results in strong capillary action to absorb excess exudate. Mass spectrometry imaging allowed monitoring of the protein fluctuations that occur during wound healing. The proteins detected were then identified using BLAST and MASCOT database comparison tools which identified that the abundant proteins detected by mass spectrometry were not those typically observed in wound healing but rather those involved in molecular aspects of wound healing like nerve regeneration, cell proliferation, survival, and migration. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria / Pharmacology / unrestricted

Microarrays on gold have been used to develop new methodologies for biocatalysis and proteomic applications. The technology applies the logic of solid phase supported chemistry using self-assembled monolayers (SAMs) on a gold chip. The advantages of this technology are: i) an easy to handle platform, ii) parallel screening (64 reactions at once), iii) microliter scale reactions (1µL per sample), iv the use of mild conditions (buffers and t=37 °C), v) the absence of purification steps (only chip washing is required), vi) quick and accurate analysis by MALDI ToF MS.The metallopeptidase thermolysin was studied in peptide-coupling reactions to profile reactivity and specificity (Chapter 2). Reactivity was further investigated in transpeptidation reactions. Comparing the serine peptidase chymotrypsin with the zinc dependent thermolysin, it was found that transpeptidations proceed via N-transacylation reactions independent of a specific enzymatic catalytic mechanism (Chapter 3). These transacylations may be exploited for modifications of biocompatible and selective surfaces in ‘bottom-up’ bionanofabrication technologies. Selected peptidases with different catalytic mechanism were also arrayed to investigate polymerisation ability of dipeptides (Chapter 4). It was shown that oligomerisation can be obtained under mild conditions and a set of peptides was synthesised. Chapter 5 describes a new chemical methodology by which crude tryptic peptide digests can be trapped on chip and analysed by MALDI ToF MS without further purification steps. This dramatically improves time and cost efficiency.Finally, a new stepwise native chemical ligation methodology is proposed for amino acids, and peptides containing N-terminal cysteine residues (Chapter 6).

L’adénocarcinome pancréatique ductal (PDAC) est une des tumeurs solides les plus malignes retrouvées dans la population humaine actuelle. Plusieurs chercheurs s’intéressent donc à trouver un nouveau traitement efficace pour ce type de cancer. Les biguanides, souvent utilisés comme antidiabétiques, intéressent de plus en plus les chercheurs par la découverte de leurs propriétés antiprolifératives. Dans notre groupe, une variété de nouveaux biguanides a été synthétisée et étudiée pour leurs propriétés antiprolifératives des cellules cancéreuses du pancréas. Nous avons identifié un biguanide avec une chaîne de phényléthynylbenzyle, appelé composé A, comme un composé de choix par son activité 800 fois plus élevée que celle de la metformine et 10 fois plus élevée que celle de la phenformine, deux biguanides commercialement disponibles. Des études in vivo ont été effectuées en greffant des cellules PDAC humaines dans l’espace sous-cutané de souris et laissées croître pendant 28 jours jusqu’à une taille de 100 mm3. Différents groupes de souris ont reçu des doses quotidiennes de 50 mg/kg de metformine, phenformine ou du composé A. Par la suite, les souris ont été sacrifiées afin de recueillir les organes et les tumeurs pour des analyses par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Le développement d’une méthode d’analyse par MALDI-TOF a permis de localiser et quantifier les biguanides dans les organes et tumeurs. Différents paramètres, tels que le choix de matrice et la méthode de dépôt, ont été optimisés afin d’obtenir des courbes d’étalonnage par IMS des trois composés biguanides. Une accumulation du composé A est observée dans le foie et le rein. Avec une régression linéaire, les concentrations approximatives du composé A dans le rein et le foie sont de 16,8 µg/mL et 4,1 µg/mL respectivement. De plus, pour en apprendre davantage sur le mécanisme d’action des biguanides dans le traitement du cancer, une étude différentielle d’expression de certaines biomolécules a été effectuée sur les foies des différents groupes de souris traitées. Des différences d’expression de certaines biomolécules ont été observées par rapport aux foies des animaux non-traités, notamment pour le signal à m/z 558 qui montre une grande abondance de ce phospholipide seulement dans les foies traités au composé A. Bref, le mécanisme d’action des biguanides dans le traitement du cancer demeure à l’étude pour de futurs travaux et développements. / The development of new therapies against pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), one of the most malignant and deadly tumors, has become of great interest for finding effective treatment. Many research groups have studied different types of biguanides in cancer treatment which inspired our group to synthesize a library of biguanide analogs. These new compounds can inhibit the tumor growth and show a great selectivity. We identified a biguanide with a phenylethynylbenzyl side chain as our hit compound, designated as compound A, which is 800 times more active than metformin and 10 times more active than phenformin, two commercial biguanide compounds used as antidiabetics. In vivo studies have been performed where human PDAC cells have been grafted in the subcutaneous space of mice and let to grow for 28 days to about 100 mm3. Different groups of mice were exposed to daily doses of 50mg/kg of metformin, phenformin or compound A. The tumors and organs of the treated mice were recovered to analyze their mechanism of action by MALDI-TOF mass spectrometry. A method of analysis by MALDI-TOF was developed in order to locate and quantify the biguanide compounds in the treated organs and tumors. Various parameters, such as the choice of matrix and the deposition method were optimized to obtain IMS calibration curves for each biguanide compound. The analyzed organs and tumors showed accumulation of compound A in the liver and kidney. With linear regression, this semi-quantitative method allowed to determine a concentration of 16.8 µg/mL in the kidney and 4.1 µg/mL in the liver. Another objective to understand the mechanism of action of biguanides in cancer therapy is to detect molecular patterns of biomolecules that correlate with the diagnostic, the prognostic and to the response of the therapy. The livers from mice treated with compound A showed differences of expression of certain phospholipids compared to the other livers, namely at m/z 558. In short, the mechanism of action of biguanides in cancer therapy is still a work in progress for future developments.

Abstrakt: Sepsis (blodförgiftning) är ett livshotande tillstånd som innebär att bakterier eller svampar tar sig in i blodbanan. Det sker ofta genom njurarna, lungorna eller sår i skadad hud. Symptom innefattar feber och allmän sjukdomskänsla. Positiva blododlingar prepareras och analyseras med Matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight (MALDI-TOF MS) där blandas preparerade prov med matrix och bestrålas sedan med en laser. Bestrålningen medför att proteinerna i provet joniseras och rör sig mot en detektor. Proteinerna detekteras som ett spektrum som i sin tur jämförs med ett referensspektrum av en känd bakterie/svamp som finns lagrat i en databas. Dessutom erhålls ett score-värde över hur väl provet liknar ett referensprov. Arbetets syfte var att se vilken provberedningsmetod som gav ett tillförlitligt resultat i MALDI-TOF och ett bra score-värde för identifiering av bakterier till art-nivå på kortast tid. Preparationsmetoderna innefattar rening av blod från röda blodkroppar och andra partiklar som stör MALDI TOF-instrument. Metoderna jämfördes med nuvarande Saponinmetod. Två av metoderna (Ferroni och Huang) gav dåliga resultat och jämförelsen avbröts efter två försök. Ett kommersiellt kit Sepsityper extraktion gav bra resultat där 79 % av analyserna gav identifiering till art-nivå. Motsvarande resultat med saponin-metoden var 33 %. Slutsatsen är att Sepsityper-extraktion-metoden gav betydligt bättre resultat än nuvarande Saponin-metod. Metoden var robust, användarvänlig, snabb och gav bra resultat både för gramnegativa och grampositiva bakterier. / Abstract: Sepsis (blood poisoning) is a life-threatening condition caused by bacteria or fungi entering the bloodstream. Pathogens often again access through the kidneys, lungs or wounds in damaged skin. Symptoms include fever, chills and general feeling of illness. Positive blood cultures are prepared and analyzed with Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF MS) prepared samples are mixed with matrix and then irradiated with laser beam. The laser beam will be directed to each position in the MALDI plate that causes the proteins in the sample to ionize and move towards a detector. The protein pattern is presented in a spectrum that is compared with a reference spectrum of known bacteria / fungi, stored in a database. In addition, a score value was obtained on how well the sample is aligned to the reference sample. The aim of this study was to compare three methods in order to achieve the best score value for identification to species level. The time factor was also important. The preparation methods include purification of blood removing red blood cells and other particles that interfere with MALDI analysis. The methods were compared with the current Saponinmethod. The results of two methods (Ferroni and Huang) were not satisfactory and further comparison was interrupted after two experiments. A commercial kit Sepsityper with extraction gave good results with 79 % identification to species level. Corresponding results for the current Saponin-method was 33 %. In conclusion, the Sepsityper-extraction-method was superior to the current Saponin-method. The method was robust, user-friendly, rapid and gave good results from both gramnegative and grampositive bacteria.

Differenzierung aviärer Brachyspiren mit PCR-basierten Methoden und MALDI-TOF-MS

Das Glioblastom ist eine hochmaligne Tumorerkrankung des zentralen Nervensystems und geht trotz intensiver Forschungsbemühungen mit einer eingeschränkten Prognose und einer Überlebenszeit im Rahmen von einigen Monaten nach Diagnosestellung einher. Cerebrale Metastasen maligner Tumoren treten in Abhängigkeit vom Primärtumor auf, und beschränken nach Erreichen des ZNS die Überlebenszeit ebenfalls auf wenige Monate. Etwa 10% der Glioblastome weisen zystische Veränderungen auf, cerebrale Metastasen maligner Tumoren präsentieren sich ebenfalls nicht selten mit einer zystischen Konfiguration. Streng histologisch gesehen handelt es sich hierbei um Pseudozysten, in denen sich eine zellarme Flüssigkeit befindet, die tumorzellassoziierte Proteine in einer geringen Konzentration enthält. Aufgrund der engen Beziehung der Zysten zu den Tumorzellen gibt die Proteinanalyse der Zystenflüssigkeit über Tumorgenese und Metabolismus Aufschluss. Bereits in einer vorangegangenen Promotionsarbeit der neuroonkologischen Arbeitsgruppe war es gelungen, Proben zystischer Glioblastome und Metastasen im Vergleich zu Liquorproben tumorfreier Patienten mittels SELDI (surface enhanced laser desorption / ionisation) TOF (time of flight) MS (Massenspektrometrie) zu vermessen. Hierbei wurden Alleinstellungsmerkmale im Sinne von isoliert auftretenden Protein-Massenpeaks sowohl in den neoplastischen Proben, als auch in den Liquorproben detektiert. Der theoretische Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich der Charakterisierung möglicher Tumorsuppressorproteine, mittels einer Evidenzanalyse / Literaturrecherche unter Verwendung der SELDI-TOF-MS Daten. Da mittlerweile mehrere Bestandteile der SELDI-TOF Hardware kommerziell nicht mehr verfügbar sind, bestand die Notwendigkeit, ein Alternativverfahren zur Proteinbestimmung von Zystenflüssigkeiten zu etablieren. Hierzu wurde in dieser Dissertation die Methode der MALDI (matrix assisted laser desorption / ionisation) TOF-MS zur Messung eines Sets neuer Proben angewendet. Die MALDI-TOF-MS war bereits in mehreren Publikationen zur Massenspektroskopie von Liquorproben beschrieben worden, wohingegen zur Untersuchung cerebraler Zystenflüssigkeiten bisher keine Berichte zu finden sind. Dementsprechend wurde im praktischen Teil ein Aufbereitungs- und Untersuchungsprotokoll eigenständig etabliert. Hiermit konnten Massenspektren der Proben abgeleitet werden, welche in den drei Diagnosegruppen (GBM, Metastasen, Liquorproben) untereinander verglichen wurden. Ergebnisse: Anhand von 20 Massenpeaks aus der SELDI-TOF Untersuchung wurden mittels Datenbanksuche in Expasy Tagident (UniProt) initial 792 Kandidatenproteine ermittelt, welche in Vergleichsliquorproben gesunder Probanden nachweisbar, in Glioblastomzysten aber absent waren, und somit eine tumorsuppressive Aktivität besitzen können. Mittels Evidenzanalyse und erweiterter Literaturrecherche wurde ein Bewertungsalgorithmus erstellt, und es konnte die Anzahl auf 54 Kandidaten reduziert werden. Unter diesen befinden sich bereits bekannte Tumorsuppressoren wie Tumor-Nekrose-Faktoren und Kinase-Inhibitoren, aber auch beispielsweise Ciliary neurotrophic factor und Inhibitor of growth protein als mögliche Tumorsuppressoren, deren Bezug zu Glioblastomen in aktuellen Veröffentlichungen diskutiert wird. Im experimentellen Teil wurde festgestellt, dass die massenspektrometrische MALDI-TOF Messung von nativer Hirntumorzystenflüssigkeit oder nativem Liquor keine verlässlichen Spektren liefert, sodass ein standardisiertes Aufarbeitungsprotokoll notwendig wurde. Nach Einsatz verschiedener Aufreinigungsverfahren, Verdünnungsreihen und Matrices erwiesen sich die Aufreinigung per magnetic beads mit schwachem Kationen-Austausch (WCX) und die Verwendung von 4mg/ml HCCA-Matrix als reliabel. Zusätzlich erfolgte eine 1:5 Vorverdünnung der neoplastischen Proben mit TRIS Puffer pH 6,8, während Liquorproben unverdünnt blieben. Insgesamt wurden 62 Proben untersucht, 25 aus Glioblastomzysten, 15 aus zystischen Hirnmetastasen und 22 Liquorproben als Kontrollgruppe. Im Schnitt konnten 20 Peaks pro Probe abgebildet werden; die jeweils 10 intensitätsstärksten hiervon wurden zur statistischen Aufarbeitung innerhalb der jeweiligen Diagnosegruppe herangezogen. Hierbei zeigten sich signifikante Unterschiede des Auftretens bestimmter Proteinbanden im Vergleich von Tumorproben zu Liquor, zum Teil auch zwischen Metastasen und Glioblastomen. Besonders hervorzuheben sind: - Der in Glioblastomproben signifikant häufig auftretende Peak bei 6433 Dalton entspricht dem Protein LuzP6 oder einer Splice-Variante des Apo-C1. o Für LuzP6 werden in der Literatur Assoziationen mit Neoplasien wie myeloproliferative Erkrankungen und Prostatakarzinom beschrieben. Das Gen für LuzP6 befindet sich auf Chromosom 7q33 und sein Translationsprodukt ist als Self-Tumor-Antigen beschrieben worden. o Apo-C1 wird als Mediator des Lipidstoffwechsels in der Leber synthetisiert und kann immunhistochemisch in Liquor und Gehirngewebe nachgewiesen werden. Eine weitere Splicevariante besitzt eine Größe von 6632 Dalton, dieser Peak liegt ebenfalls signifikant häufiger in Glioblastomen als in Liquor vor. - Der Peak 4303 Dalton wird in Metastasen signifikant häufig nachgewiesen. Als Kandidat findet sich unter anderen der angiogenetische Faktor Adrenomedullin 2, dessen protoonkogene Funktion in mehreren Publikationen beschrieben wird. - In über 95% der Vergleichsliquorproben und in unter 10% der neoplastischen Diagnosegruppen findet sich die Bande 3513 Dalton. In der UniProt Datenbank gibt es hierfür jedoch keine Entsprechung. Auch für ein möglicherweise doppelt geladenes Protein mit 7026 Dalton sind bis dato keine bekannt tumorsuppressiv wirkenden Kandidaten hinterlegt. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten besteht somit in der Identifizierung des zugrundeliegenden Proteins. - Als ubiquitäre Bande in allen drei Diagnosegruppen lässt sich 11725 Dalton beispielsweise dem beta-2-Mikroglobulin zuordnen, das auf allen Körperzellen vorhanden ist und die Antigenpräsentation an das Immunsystem vermittelt. Aufgrund einer Vielzahl weiterer möglicher Kandidatenproteine dieser Größe steht auch hier die eindeutige Identifizierung aus. Antworten auf die Problemstellung 1. Sowohl MALDI, als auch SELDI TOF MS sind geeignet um Flüssigkeiten aus Glioblastomzysten massenspektrometrisch zu analysieren. Um eine verlässliche Messung per MALDI-TOF zu erreichen, müssen die Proben zuvor eine Aufreinigung erfahren. Die Ergebnisse innerhalb der Diagnosegruppen sind reproduzierbar; die MALDI-TOF MS bildet insbesondere niedrige m/z (1.500Da - 20.000Da) ab, und verschiebt somit im Vergleich zur SELDI-TOF MS (4.000Da - 145.000Da) den Messbereich in Richtung kleinerer Molekulargewichte. 2. Unter Anwendung des Aufreinigungsprotokolls gelingt die Abbildung aussagekräftiger Spektren auch bei Proben zystischer Hirnmetastasen. 3. Für lediglich in den Liquor-Vergleichsproben nachweisbare Massenpeaks lassen sich in den verfügbaren Datenbanken sowohl Proteine finden, welche nachgewiesenermaßen tumorsuppressive Aktivität besitzen, als auch solche, bei denen diese noch diskutiert wird. Eine eindeutige Zuordnung eines Peaks zu einem Protein ist mittels MALDI-TOF MS nicht möglich. Hierzu müssen weitere proteomische Methoden wie Proteinsequenzierung, Immunhistochemie oder mRNA-Analysen eingesetzt werden. 4. Aufgrund der Heterogenität der Messergebnisse und der geringen Fallzahl untersuchter Proben lässt sich eine Massenpeak-Tumorsignatur nicht erstellen. Dies betrifft die Glioblastomsubtypisierung und die Primärtumorbestimmung bei Metastasen, aber auch die Unterscheidung von Tumor- und Liquorprobe. Aus heutiger Sicht steht die eindeutige Identifizierung der zu den Peaks korrespondierenden Proteine mittels supplementärer proteomischer, histologischer und molekularbiologischer Verfahren an. Somit kann, ausgehend von dem hier vorgestellten „discovery oriented approach“ als langfristiges Ziel die Beschreibung von Tumormetabolismus und Proteinregulation verbunden mit der Etablierung von Biomarkern angestrebt werden, um neue therapeutische Ansätze zu ermöglichen.:Inhaltsverzeichnis 2 Tabellenverzeichnis 4 Abbildungsverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis 6 1. Einleitung 8 1.1 Hirneigene Tumore 8 1.1.1 Diagnostik 10 1.1.2 Operatives Vorgehen 11 1.1.3 Postoperative Weiterbehandlung – Adjuvante Therapie 12 1.2 Metastasen 14 1.3 Zystische Tumore 16 1.4 Proteomik 20 1.4.1 Proteomanalyse 21 1.4.2 Protein-Analyseverfahren 21 1.4.3 MALDI TOF 23 1.4.4 SELDI TOF 25 2. Problemstellung 26 3. Material und Methoden 27 3.1 Materialliste 27 3.2 Internetbasierte Recherche möglicher Tumorsuppressorgene 27 3.2.1 Evidenzlevel (gemäß der Internet Datenbank UniProt) 30 3.2.2 Proteincharakteristika 30 3.2.3 Schlagwortbezogene Literatursuche 31 3.3 Massenspektrometrische Untersuchungen 31 3.3.1 Probengewinnung und Aufbewahrung 31 3.3.2 Verwendung und Aufreinigung der Proben 32 3.3.3 Messverfahren 36 4. Ergebnisse 41 4.1 Recherche möglicher Tumorsuppressoren 41 4.2 Probenaufbereitung 48 4.2.1 Ergebnisse der verschiedenen Adaptationsversuche Probe / Matrix ohne weitere Aufreinigung 48 4.2.2 Kit-basierte Aufreinigung 50 4.3 Messergebnisse 52 4.3.1 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks bei Glioblastomen 54 4.3.2 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks bei Metastasen 55 4.3.3 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks der Liquorproben 56 4.3.4 Automatisierte Kontrolle 56 4.3.5 Entitätenvergleich 57 4.4 statistische Aufarbeitung 60 4.4.1 Glioblastom 60 4.4.2 Metastasen 60 4.4.3 Liquor 60 4.5 Nachbetrachtung ausgewählter Peaks (Top 3 jeder Entität) 61 4.5.1 Glioblastom 61 4.5.2 Metastasen 61 4.5.3 Vergleichsproben 62 4.5.4 Exemplarische Vorstellung möglicher Proteinkandidaten 62 5. Diskussion 66 5.1 Diskussion möglicher Tumorsuppressoren 66 5.2 Diskussion der Probenaufbereitung und des Messverfahrens 68 5.3 Diskussion der Messergebnisse 72 5.4 Antworten auf die Problemstellung 76 6. Zusammenfassung 79 Literaturverzeichnis 84 Anlagen 94 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 101 Lebenslauf 102 Danksagung 104

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Resumo: O estreitamento da relação entre tutores e animais de companhia, nas últimas décadas, aumentou consideravelmente o risco de transmissão de patógenos dos animais para os humanos. A microbiota da cavidade oral de animais de companhia é polimicrobiana e estes agentes podem potencialmente infectar humanos pelas mordeduras ou contato direto com mucosas ou feridas de pele. No entanto, são escassas as informações sobre a identificação destes micro-organismos por técnicas moleculares (microbioma, proteômica). Ainda, o perfil de sensibilidade microbiana in vitro da microbiota bacteriana bucal de cães e a etiologia dos agentes envolvidos em mordeduras em humanos não são completamente elucidados, posto que muitos cães são errantes e evadem após a agressão. Com efeito, o presente estudo investigou a presença de agentes de origem bacteriana e fúngica na cavidade oral de 100 cães hígidos por técnicas de cultivo microbiano convencional, sequenciamento genético em larga escala (microbioma) e espectrometria de massas (MALDI-TOF MS), bem como investigou o perfil de sensibilidade/resistência in vitro dos isolados. Foram identificados 213 micro-organismos de origem bacteriana e 20 de origem fúngica. Os agentes bacterianos mais prevalentes no diagnóstico microbiológico e espectrometria de massas foram Staphylococcus pseudintermedius (40/100=40%), Streptococcus α-hemolítico (37/100=37%) e Pasteurella stomatis (22/100=22%). O gênero de fungo mais prevalente foi Aspergillus (10/100=10%). Imipenem (2... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The close relationship between humans and companion animals in recent decades has strongly increased the risk of transmission of pathogens from pets-to-humans. The microbiota of the oral cavity from companion animals is polymicrobial and these agents may potentially infect humans through bites or by direct contact with mucous membranes or cutaneous lesions. Nonetheless, the identification of these microorganisms by molecular techniques (microbiome, proteomics) is scarce. Besides, the in vitro microbial susceptibility pattern of oral bacterial microbiota from dogs and the etiology of agents involved in human bites are not fully understood, since many dogs are homeless and/or evade after aggression. The present study investigated the presence of bacterial and fungal agents in the oral cavity of 100 healthy dogs based on conventional microbiological culture, large-scale DNA sequencing (microbiome), and matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). In vitro antimicrobial susceptibility profile of the isolates was assessed as well. A total of 213 bacterial and 20 fungal microorganisms were identified. The most prevalent bacterial agents diagnosed by microbiological culture and mass spectrometry were Staphylococcus pseudintermedius (40/100=40%), α-hemolytic Streptococcus (37/100=37%), and Pasteurella stomatis (22/100=22%), whereas the most common genus of fungi was Aspergillus (10/100=10%). Imipenem (207/213=97.2%), ceftiofur (196/213=... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

ANA-buljongen är utvecklad för att kunna anrika både aeroba och anaeroba bakterier vid inkubering i aerob miljö. Odlingsbuljongen innehåller antioxidanter som skyddar anaeroberna mot reaktiva syreradikaler, vilket främjar anaerob anrikning. Syftet med arbetet var att utvärdera om ANA-buljongen kan ersätta de två befintliga odlingsbuljongerna som idag används vid anrikning av bakterier på avdelningen för klinisk mikrobiologi, Kronoberg Blekingesjukhuset. Elva bakteriearter och fyra blandfloror användes i utvärderingen av ANA-buljongen. En mikroliter (µl) inokulat som innehöll ca 100 colony forming units tillsattes till ANA-buljong samt aeroba buljongen Brain Heart Infusion (BHI) eller den anaerobbuljongen Fastidious Anaerobe Broth (FAB). Prov från buljongerna odlades ut efter två, fyra och sju dygns inkubering. Tillväxtsgrad vid olika inkubationstider jämfördes mellan ANA-buljongen och BHI-buljongen/FAB. ANA-buljongen utvärderades även för odling av kliniska prov. De kliniska proven odlades ut på agarplattor samt inokulerades till ANA-, BHI-buljong och FAB. Vid utodling från buljongerna jämfördes fynden från BHI-buljongen och FAB med fynden från ANA-buljongen. Tillväxten verkade vara snabbare i ANA-buljongen jämfört med BHI-buljong och FAB. Vissa arter, exempelvis Cutibacterium acnes, uppvisade en betydligt snabbare tillväxt i ANA-buljongen. Vissa bakteriearter tillväxte men överlevde inte längre inkubationstider och kunde efter dessa inte detekteras. Anrikningen av blandfloror i ANA-buljongen resulterade i överväxt av en art vilken konkurrerade ut de övriga arterna. Detta fenomen uppstod inte i FAB. Att ersätta de två kliniska buljongerna med ANA-buljongen hade varit fördelaktigt både praktiskt, ekonomiskt och ur ett hållbarhetsperspektiv. Eftersom ANA-buljongen enbart visade sig användbar vid odling av renkulturer men inte vid odling av blandfloror är den inte optimal för klinisk diagnostik. Men den skulle eventuellt kunna nyttjas vid ortopediska Kamme-Lindberg-odlingar då det oftast är fråga om renkulturer. / ANA-broth is developed to enrich both aerobic and anaerobic bacteria by incubation in an aerobic environment. The broth contains antioxidants that protect anaerobic bacteria from reactive oxygen species and make it possible for anaerobic bacteria to grow in an oxygenated environment. The purpose of the study was to evaluate the ANA-broth and see if the broth could replace the two broths that are being used clinically today.  Eleven bacterial species and four mixed floras were used to evaluate the ANA-broth. One microliter (µl) inoculum with about 100 colony forming units was used to inoculate ANA-broth, Brain Heart Infusion (BHI) broth and Fastidious Anaerobe Broth (FAB), respectively. Samples from the broths were then used to inoculate agar plates after two, four and seven days of incubation, to evaluate the difference in enrichment effectiveness at different incubation times in relation to the clinically used broths. The ANA-broth was also evaluated by using clinical samples from patients. The findings from the ANA-broth were compared with the findings from the BHI-broth and FAB. The growth in the ANA-broth was quicker compared to the BHI-broth and FAB. Some bacterial species grew but became non-viable in the ANA-broth after a longer period of incubation. Bacterial species within mixed floras were not able to grow in coexistence in the ANA-broth. One bacterial species took over and competed out the residual bacteria. This phenomenon did not occur in FAB. If the ANA-broth could replace the broths now used clinically then that would be advantageous both in terms of practicality, economy and from a sustainability perspective. Though, the ANA-broth is not optimal for clinical use considering that only one bacterial species within a mixed flora was able to grow. As the broth has greater potential for cultures containing only one bacterial species it could possibly be suited for orthopaedic Kamme-Lindberg cultivation.

Eine traumatische Läsion am artikulären Knorpel stellt eine noch ungelöste Herausforderung für den behandelnden Arzt dar. Bei den betroffenen Patienten handelt es sich häufig um junge, sportlich aktive Menschen im Arbeitsprozess {Hjelle et al. 2002}, bei denen eine längerfristige Belastungs- und Bewegungseinschränkung oder sogar eine Verminderung der Erwerbsfähigkeit zwingend vermieden werden muss. Jedoch existiert für den traumatischen Gelenkknorpelschaden derzeit noch keine Therapie mit sehr gutem, funktionellem Langzeitergebnis {Richter 2005}. Die konservativen Therapieformen haben immer eine narbige Ausheilung zur Folge. Aber auch mit der chirurgischen Basisversorgung, bestehend aus Debridement und Lavage des betroffenen Gelenks, kann keine Ausheilung erreicht werden. Regenerierende Verfahren, die auf der Grundlage der Penetration des subchondralen Knochens basieren, sollen durch das Einspülen von körpereigenen Stammzellen in den Defekt eine autologe Regeneration induzieren. Langzeitstudien zeigen, dass trotz der oft erreichten, guten funktionellen Ergebnisse histomorphologisch keine Wiederherstellung von intaktem, hyalinem Gelenkknorpel erreicht werden kann {Gaissmaier et al. 2003, Bernholt/Höher 2003}. Vielversprechende neue Therapiekonzepte liefert derzeit das „Tissue Engineering“ am Gelenkknorpel. Vor allem die Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) eröffnet vollkommen neue Behandlungsstrategien. Bei der ACT werden arthroskopisch patienteneigene Chondrozyten gewonnen, die in dreidimensionale Gele eingesät und in Zellkultur gebracht werden. Durch verschiedene Stimulationstechniken werden die Zellen zur Proliferation und Produktion von Extrazellulärer Matrix (ECM), insbesondere Kollagen und Proteoglykan, angeregt. Nach drei bis sechs Wochen Kultivierung erfolgt die Implantation in den aufbereiteten Knorpeldefekt des Patienten. Aktuelle Studien konnten zeigen, dass das Transplantat mittelfristig ohne Narbenbildung in den bestehenden Gelenkknorpel einwächst und so die Inkongruenz des Gelenks, welche präarthrotisch wirkt, aufhebt {Brittberg et al. 1996, Peterson et al. 2000, Horas et al. 2000}. Um dieses neuartige Verfahren schnell im klinischen Alltag zu etablieren, bedarf es ausgereifter analytischer Methoden, die eine Qualitätsprüfung des biotechnologisch hergestellten Knorpels ermöglichen. MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) ist eine schnelle und sehr sensitive Methode, um die molaren Massen von Stoffen genau zu bestimmen und komplex zusammengesetzte Proben zu analysieren. Ziel dieser Arbeit war es, MALDI-TOF Massenspektrometrie als Analyseverfahren zu nutzen, um die Zusammensetzung des natürlichen Knorpels zu bestimmen und die hier gewonnenen Erkenntnisse auf biotechnologisch hergestellten Knorpel anzuwenden. Somit war die Überprüfung der Anwendbarkeit dieser massenspektrometrischen Untersuchungsmethode auf das komplexe biologische System Knorpel die erste Fragestellung in dieser Arbeit. Es erfolgte daher zunächst die Anpassung und Optimierung der Präparations- und Messmethoden mit dem Ziel, standardisierte Protokolle festzulegen, welche zu reproduzierbaren Spektren führen. Es schloss sich die Analyse der kommerziell verfügbaren Hauptbestandteile der ECM - Proteoglykane und Kollagene – mittels MADI-TOF MS an. Hierzu wurden Chondroitinsulfat und Kollagen verschiedener Typen enzymatisch verdaut und analysiert. So konnten Referenzspektren erstellt werden, welche die Grundlage für die Analyse des wesentlich komplexeren Systems des natürlichen Knorpels bildeten. Durch den Einsatz von Trypsin zur Hydrolyse nach thermischer Denaturierung des Kollagens wurde die Differenzierung zwischen den verschiedenen Kollagentypen ermöglicht. Es schlossen sich Studien zur Quantifizierung der enzymatischen Verdauungsprodukte der ECM an, welche das Ziel verfolgten, neben der stofflichen Zusammensetzung Aussagen zu den relativen Anteilen der einzelnen Bestandteile zu erlauben. Nachdem die grundsätzliche Eignung der Methode gezeigt werden konnte, diente der zweite Teil der hier dargelegten Forschungsarbeit der Beantwortung der Frage, ob die Erkenntnisse, welche bei der Analyse der Einzelbestandteile gewonnen wurden, auf natürliches Knorpelgewebe anwendbar sind. Der artikuläre Schweineknorpel ähnelt im Aufbau und den biomechanischen Eigenschaften dem menschlichen Knorpel. Da er zudem noch günstig und in adäquaten Mengen zur Verfügung gestellt werden kann, wurde der Gelenkknorpel des Schweins als Modellgewebe für die Anwendbarkeit der Methode auf natürlichen Knorpel genutzt. Ziel war es, die Hauptbestandteile der ECM einwandfrei zu identifizieren, Untersuchungen zur Quantifizierung anzustellen und Unterschiede zwischen den Knorpeltypen verschiedener Spezies nachzuweisen. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit erfolgte die Analyse von biotechnologisch hergestelltem Knorpel und somit die Anwendung der bisher erworbenen, vor allem einem theoretisch-wissenschaftlichem Interesse folgenden Erkenntnisse auf eine praktisch-klinische Fragestellung nach der tatsächlichen Beschaffenheit des zu transplantierenden Konstrukts. Dazu wurden Konstrukte, welche zum einem aus dreidimensionalen Agarosegele bestückt mit Chondrozyten, zum anderen aus Kollagengel mit eingesäten Stammzellen oder Chondrozyten bestanden, untersucht. Dieser Schritt erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Biotechnologisch-Biomedizinischen Zentrum Leipzig. Ziel war es, die bis dahin etablierten Probenpräparations- und Messbedingungen auf den künstlichen Knorpel anzuwenden und mit Referenzspektren von Bestandteilen der ECM sowie des natürlichen Schweineknorpels zu vergleichen. Durch die Analyse des Materials zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten sollte eine Aussage über die Qualität und die Menge der de novo synthetisierten ECM erreicht werden. Mit dieser Arbeit wurde die Grundlage geschaffen, die MALDI-TOF MS als geeignetes analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konstruktqualität einzuführen. Perspektivisch sollte es so möglich sein, die Qualität der Konstrukte, welche für die Autologe Chondrozytentransplantation bestimmt sind, zu bewerten und zu überwachen.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20240号 / 医博第4199号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 安達 泰治, 教授 小西 靖彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM