Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.

A mastite bovina apresenta alta prevalência nos rebanhos leiteiros e a antibioticoterapia é o procedimento mais utilizado no tratamento da mesma. O Staphylococcus aureus, agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de mastite, tem demonstrado em diversos estudos aumento crescente no padrão de resistência aos antimicrobianos. O desenvolvimento de bactérias resistentes e a presença de resíduos de antimicrobianos no leite estimulam o desenvolvimento de novos tratamentos que solucionem estes problemas. O muco dos moluscos Achatina fulica é composto por uma glicoproteína, denominada achacin, com atividade antimicrobiana sobre bactérias Gram positivas. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do muco de A. fulica sobre S. aureus, bem como determinar e avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) do muco de A. fulica purificado sobre S. aureus ATCC 25923 e isolados de S. aureus provenientes de infecções intramamárias bovina. O muco foi purificado mediante cromatografia líquida de alta eficiência e a fração com atividade antimicrobiana foi submetida à quantificação protéica e microdiluição em caldo. A CIM do muco purificado determinada para a cepa ATCC 25923 correspondeu a 50 µg/mL e para os isolados de S. aureus, variou entre 12,5 e 100 µg/mL. Sendo que destes, dois isolados (6,7 %) apresentaram CIM de 12,5 µg/mL, três (10 %) CIM de 25µg/mL, vinte e três (76,6 %) CIM de 50 µg/mL e dois (6,7 %) apresentaram CIM de 100 µg/mL. A CIM50 para os isolados correspondeu a 50 µg/mL e a CIM90 a 100 µg/mL. No presente estudo observou-se que o muco purificado apresentou atividade antimicrobiana com ação bactericida. Estes resultados proporcionam perspectivas para a compreensão e otimização de protocolos microbiológicos deste potencial biofármaco com a finalidade de empregá-lo futuramente na terapêutica veterinária para o controle de infecções intramamárias causadas por S. aureus. / The bovine mastitis is highly prevalent in dairy herds and antibiotic therapy is the procedure most commonly used to treat it. Staphylococcus aureus is the most frequently isolated etiologic agent in cases of mastitis and it has been shown in several studies the pattern of increasing antimicrobial resistance. Due to the development of resistant bacterias and the presence of antimicrobial residues in the milk the development of new treatments to solve those problems are required. The mucus of the molluscs Achatina fulica contains a glycoprotein called achacin that presents antimicrobial activity against Gram positive bacteria. The aim of this study was the evaluation of the in vitro antimicrobial activity of the A. fulica mucus of on S. aureus, as well the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of A. fulica mucus purified on S. aureus ATCC 25923 and isolates of S. aureus from bovine intramammary infections. The mucus was purified by high performance liquid chromatography. The protein content in portion presenting the was quantified and microdiluted. The MIC determined for the purified mucus strain ATCC 25923 was 50 µg/mL and for the isolates of S. aureus ranged between 12,5 and 100 µg/mL. Among these samples, two isolates (6,7 %) showed MIC of 12,5 µg/mL, three (10 %) of MIC 25 µg/mL, twenty-three (76,6 %) MIC of 50 µg/mL and two (6,7 %) had an MIC of 100 µg/mL. The MIC50 for isolates was 50 µg/mL and MIC90 to100 µg/mL. It was found that the purified mucus showed bactericidal activity. The results showed in the present work improved the understanding and optimization of the biopharmaceutical microbiological potential that could be applied in new protocols in future veterinary therapy for the control of intramammary infections caused by S. aureus.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Alziro Vasconcelos Carneiro.pdf: 455403 bytes, checksum: 96b519d909bc30f30ddc42546978acfb (MD5) Previous issue date: 2006-07-31 / There are several pathogens causing bovine mastitis, but only Streptococcus agalactiae is feasible to be eradicated from a herd. Two herd data ( A and B ) were used to evaluate the economic and technical viability of the eradication of this pathogen, based on this pathogen attack program. It was used a 24 month period data from production; somatic cells count (SCC), clinical mastitis and expenditures. A cost-benefit analysis was carried out through mathematical models. It was identified 16 infected cows with S. agalactiae in herd A , and in herd B , there were 42, from which 31 associated with Staphylococcus aureus. The therapy effectiveness in eliminating S. agalactiae was about 100% in both herds. However, 18 cows kept the infection of S. aureus after the therapy (42% of effectiveness). The number of cases and cows with mastitis decrease was about 18% and 21%, respectively. For herd B it was found a SCC growing tendency on infected group and on total milk, 12 months before the therapy (980x10P 3 P and 968x10P 3 P cells/ml averages, respectively) and stabilization after treatment (577x10P 3 P cells/ml and 563x10P 3 P cells/ml averages, respectively). Treatment cost was about R$ 175.95 per cow considering the following higher cost items: laboratory exams (39%); milk discard (31%); veterinary medicaments and labor for additional operations (20%); and veterinary fees (10%). Payment due to quality and to the decrease in clinical mastitis cases represented about 55% e 34% of total benefit. However, it was not found significant milk production increase for treatment program (p>0.05), in treated group, nor in herd B . It was estimated about 11.67; 6.45 and 2.61 monetary unit return for each unit invested. Prophylactic procedures were important to eradicate and maintain the herd free from S. agalactiae, they have also contributed for lower incidence of clinical mastitis, decreasing SCC and discard/precocious mortality, so its adoption is recommended. Considering Brazilian requirements relative to somatic cells and milk total bacterial as well as S. agalactiae role in increasing these parameters, it is suggested an eradication program of this pathogen, which may help farmers to maintain production under standard requirements, as well as the consumers reducing risk and Government income loss due to taxes collection. / Entre os v?rios pat?genos causadores de mastite, o ?nico que pode ser erradicado do rebanho ? Streptococcus agalactiae. Dados de dois rebanhos, 'A' e 'B', foram utilizados para avaliar a viabilidade t?cnica e econ?mica de um programa de erradica??o deste pat?geno. Foram utilizados dados de produ??o, contagem de c?lulas som?ticas (CCS), mastite cl?nica e financeiros, de 24 meses. An?lise custo/benef?cio foi realizada com aux?lio de modelos matem?ticos. Identificaram-se 16 vacas infectadas com S. agalactiae no rebanho 'A' e 42 no rebanho 'B', sendo que destas ?ltimas, 31 apresentaram infec??o associada com Staphylococcus aureus. A efic?cia da terapia de ataque foi de 100% nos dois rebanhos. Entretanto, 18 vacas no rebanho B mantiveram a infec??o por S. aureus ap?s a terapia (42% de efic?cia). No rebanho 'B', a redu??o do n?mero de casos e de vacas com mastite cl?nica foi de 18 e 21%, respectivamente. A CCS apresentou tend?ncia crescente no grupo infectado e no leite total, nos 12 meses antecedentes ? terapia, com as m?dias de 980x103 e 968x103 c?l/ml, respectivamente. Ap?s o tratamento, as m?dias estabilizaram-se em 541x103 e 563x103 c?l/ml, respectivamente. O custo do tratamento foi de R$ 175,95 por vaca/tratada, sendo 39% deste com exames laboratoriais, 31% descarte de leite, 20% medicamentos e m?o-de-obra devido a opera??es adicionais e 10% honor?rios do m?dico veterin?rio. O pagamento por qualidade e a redu??o dos custos com a mastite cl?nica representaram 55% e 34% do benef?cio. Aumento significativo n?o foi observado (p>0,05) na produ??o m?dia de leite dos grupos tratados e do rebanho 'B'. Estimaram-se retornos de 11,67, 6,45 e 2,63 unidades monet?rias para cada unidade investida no programa de erradica??o de S. agalactiae. As medidas terap?uticas e profil?ticas foram eficazes para erradicar e manter o rebanho livre de S. agalactiae, al?m de contribu?rem para reduzir a CCS do leite, a incid?ncia de mastite cl?nica, o descarte/mortalidade precoce e proporcionou ganhos em programa de pagamento por qualidade, sendo sua ado??o recomend?vel. Considerando as exig?ncias brasileiras com rela??o ao limite de c?lulas som?ticas e de bact?rias totais no leite e o papel de S. agalactiae no aumento desses par?metros, o programa de erradica??o deste pat?geno pode significar a perman?ncia do produtor na atividade formal, al?m de reduzir risco para os consumidores e perdas de receitas do Governo com recolhimento de impostos.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA087.pdf: 1147805 bytes, checksum: 749e6e38b1399033aef2801d2ef1b25f (MD5) Previous issue date: 2012-03-09 / The bovine mastitis is a disease that causes more losses in dairy farming, significantly reducing the production and milk quality. A causative agent of mastitis is the Corynebacterium sp. , especially the specie Corynebacterium bovis, but their role in intramammary infection is not yet defined, since some studies consider this agent, a minor pathogen of the mammary gland, causing no change in production and composition milk, though others, realize the large capacity of Corynebacterium sp. in causing mastitis, placing it as a risk factor for the development of the activity. Meet the microbiological profile of milk samples, the specific action of the agents in the mammary gland and its effect on milk quality, are of great importance in mastitis control programs. This study aimed to determine the prevalence of Corynebacterium sp. n the milk of cows from dairy herds located in five Brazilian states and to correlate the presence of this agent with the management of the milking herd and the somatic cell count of bulk tank milk and milk of individual cows. We conducted a longitudinal study from January 2010 to July 2011, in dairy herds located in the states of SC, PR, RS, MG and PE, which were performed in four colletions (at six months intervals) of milk samples in each herd. A questionnaire was applied in each farm to obtain data and information on the practices of milking herds, such as teat disinfection and teat drying, which may influence the occurrence of mastitis by Corynebacterium sp. Of the 4949 milk samples analyzed, submitted to microbiological culture, 666 (13,46%) had isolation of Corynebacterium sp. Minas Gerais was the state with the highest pravelence off this agent (21,07%) compared to others states. Risk factors associated with the management of milking, such as teat disinfection before and after milking and dry cow treatment showed no statistically significant influence on the prevalence of Corynebacterium sp. in milk samples analyzed. The isolation of Corynebacterium sp. in milk samples did not affect the SCC of bulk tank milk of the herds, but in the CMT, the presence of this agent caused variations in the number of positive mammary quarters and the degree of score in their test. Therefore Corynebacterium sp. is a causative agent of mastitis of great relevance not only by the frequency of isolation observed in this study, but also by the effect of CMT in individual cows and consequently in the herd SCC / A mastite bovina é a enfermidade que mais causa prejuízos na pecuária leiteira, reduzindo, significativamente, a produção e qualidade do leite. Um dos agentes causadores da mastite é o Corynebacterium sp., principalmente a espécie Corynebacterium bovis, porém seu papel na infecção intramamária ainda não é definido, pois alguns estudos consideram este agente, um patógeno menor da glândula mamária, sem causar alteração da produção e composição do leite, entretanto outros, constatam a grande capacidade do Corynebacterium sp. em causar mastite, colocando-o como um fator restritivo para o desenvolvimento da atividade leiteira. Conhecer o perfil microbiológico de amostras de leite, a ação específica dos agentes na glândula mamária e seu efeito na qualidade do leite, são de grande relevância em programas de controle da mastite. Este estudo teve como objetivos determinar a prevalência de Corynebacterium sp. no leite de vacas de rebanhos leiteiros localizados em cinco estados brasileiros e, correlacionar a presença deste agente com o manejo de ordenha dos rebanhos e com a contagem de células somáticas do leite do tanque e do leite individual das vacas. Foi realizado um estudo longitudinal, de janeiro de 2010 a julho de 2011, em rebanhos leiteiros localizados nos estados de SC, PR, RS, MG e PE, nos quais foram realizadas quatro coletas (semestrais) de amostras de leite em cada rebanho. Foi aplicado um questionário, em cada propriedade, para obter dados e informações sobre o manejo de ordenha dos rebanhos, como a desinfecção pré e pós-ordenha, secagem dos tetos, que possam influenciar na ocorrência de mastite por Corynebacterium sp. Do total de 4949 amostras de leite analisadas, submetidas a cultura microbiológica, 666 (13,46%) apresentaram isolamento de Corynebacterium sp. Minas Gerais foi o estado que apresentou a maior prevalência deste agente (21,07%) comparado aos demais estados. Os fatores de risco associados ao manejo de ordenha das propriedades, como a desinfecção dos tetos pré e pós-ordenha e o tratamento de vaca seca não apresentaram influência estatística significativa na prevalência de Corynebacterium sp. nas amostras de leite analisadas. O isolamento de Corynebacterium sp nas amostras de leite não afetou a CCS do leite do tanque dos rebanhos, porém no CMT, a presença deste agente causou variações no número de quartos positivos e no grau de escore no respectivo teste. Portanto, Corynebacterium sp. é um agente causador de mastite de grande relevância, não só pela freqüência de isolamento observada no presente estudo, mas também pelo efeito no CMT individual das vacas e consequentemente na CCS do rebanho

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA017.pdf: 1501268 bytes, checksum: 0c5a0b4d77bc053bc7b71daf56488e43 (MD5) Previous issue date: 2007-02-05 / Staphylococcal mastitis causes considerable economic losses to the producer, the milk industry and to the consumers. Staphylococcus aureus is an important cause of bovine mastitis worldwide, and effective preventive or therapeutic alternatives are lacking. The predominance of staphylococcal capsular polysaccharide types 5 and 8 among human isolates from many sources is well documented, but there seems to be a greater variation in the distribution of capsular serotypes among isolates from cattle. This information is important for the rational design of a vaccine for the prevention of staphylococcal mastitis, because surface antigens capsular polysacharides of S. aureus are sorotype-specific immunogens and antibodies to these antigens should be present so that it happens the opsonophagocytic. Of the 256 samples of bovine staphylococci and 56 samples bubaline included in this study, isolated of mastitis milk in Brazil, between 1995 and 2006. They were identified as S. aureus 164 strains of bovine and 27 of bubaline, the other samples were identified as Staphylococcus coagulase-negatives. Sorotyping of the 164 samples of S. aureus isolated of bovine and 27 of bubalino for the technique of colony immunoblot. Capsular types 5 and 8 accounted approximately 70% of the bovine isolates and 85% of the bubaline isolates. Type 8 was significantly more frequent (51,83%), type 5 was less frequent, accounting for 17,07% of the isolates and rest were non-typeables (31,1%). Sorotype 5 was predominant in strains from bubaline sources (62,96%), among which the frequency of the sorotype 8 was of 22,22% and the smallest occurrence it was of non-typeables (14,81%). These results underscore the variability in capsule production by bovine isolates of S. aureus from different geographic regions. Therefore, was observed prevalence antigenic of CP5 and CP8 and that should be considered when of the development of capsular-vaccines for bovine and bubaline mastitis for S. aureus, to be used at national level, because it has direct influence on the efficiency of the same ones / A mastite estafilocócica ocasiona prejuízos consideráveis aos produtores, à indústria leiteira e aos consumidores. O Staphylococcus aureus é a mais importante causa de mastite bovina em todo o mundo, e inexistem alternativas preventivas e terapêuticas efetivamente eficientes para seu controle. A predominância de polissacarídeos capsulares estafilocócicos tipos 5 e 8 em amostras humanas isoladas de diversas origens geográficas é bem documentada, porém, em relação a isso parece existir uma grande variação na distribuição de sorotipos capsulares entre as amostras isoladas de bovinos. Esta informação é importante num projeto racional de uma vacina para prevenção da mastite estafilocócica, pois antígenos polissacarídeos de superfície do S. aureus são imunógenos sorotipo-específicos e, anticorpos para estes antígenos, devem estar presentes para que ocorra a opsonofagocitose. Das 256 amostras de estafilococos bovinas e 56 amostras bubalinas incluídas neste estudo, isoladas de leite mastítico no Brasil, entre 1995 e 2006, foram identificados como S. aureus 164 isolados de bovinos e 27 de bubalinos, as demais amostras foram identificadas como Staphylococcus coagulasenegativos. Foram sorotipificadas as 164 amostras de S. aureus isoladas de bovino e 27 de bubalinos pela técnica de colony immunoblot. Cápsulas tipo 5 e 8 foram encontradas em aproximadamente 70% dos isolados de bovino e 85% dos isolados bubalinos. O tipo 8 foi significativamente mais freqüente (51,83%), o tipo 5 foi o menos freqüente, encontrado 17,07% dos isolados e o restante foram nãotipificáveis (31,1%). O sorotipo 5 foi predominante nas cepas de origem bubalina (62,96%), entre as quais a freqüência do sorotipo 8 foi de 22,22% e a menor ocorrência foi de não-tipificáveis (14,81%). Os resultados ressaltam a variabilidade na produção de cápsula por isolados de S. aureus bovinos de diferentes regiões geográficas. Portanto, observou-se uma prevalência antigênica de CP5 e CP8 e isso deve ser considerado quando do desenvolvimento de vacinas-capsulares contra mastite bovina e bubalina por S. aureus, a ser utilizada a nível nacional, pois tem influência direta sobre a eficiência das mesmas

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Juliana Dias Martins.pdf: 1294689 bytes, checksum: c255ebaebb32633087fe7f7d358cd8e8 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / The bovine mastitis consists of an inflammation of the mammary gland, with acute to chronic evolution, which occurs when an infectious agent attacks the mammary gland. It is characterized by physical, chemical and sensory alterations of the milk, caused by microorganisms that invade the mammary gland and cause pathological changes in the glandular tissue. Mastitis can be classified according to the form of presentation as clinical or subclinical. Several symptoms are observed in the clinical form of the disease such as the secretion of milk with lumps, pus or watery aspect, and edemaciated stiff and febrile teats and udder. On the other hand, no symptoms can be observed in the mammary gland and milk in subclinical cases. Mastitis is a major cause of economic losses in dairy cattle farms, mainly due to reduced milk production, changes in the composition and increased somatic cell count (CCS). The objective of this study was to evaluate the prevalence of the main bacteria that cause (clinical and subclinical) bovine mastitis, and to check the sensitivity to various antimicrobial agents of clinical mastitis. The agents most frequently isolated from clinical mastitis were Streptococcus uberis and Staphylococcus aureus and the antibiogram demonstrated greater sensitivity and efficacy of the active principles linezolid, amikacin, gentamicin and imipenen regarding the isolated agents. In subclinical mastitis Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis and Staphylococcus sp. Were the agents most frequently identified and that determined the highest mean values of CCS. The average CCS of cows with subclinical mastitis was approximately 743 x 103 cs/mL. The study was conducted in eight dairy farms in the State of Goiás. The results were obtained by frequency analysis. In conclusion, that the results emphasize the importance of assessing the sensitivity profile of microorganisms that cause clinical mastitis in each herd studied allowing greater precision in medication prescription for future cases of clinical mastitis and for dry cow therapy. The use of other techniques such as real time PCR is also important for the detection of the main microorganisms causin subclinical mastitis, which can be indicated as a routine method, due to its specificity, providing a precise bacteriological diagnosis. / A mastite bovina constitui-se num processo inflamatório da glândula mamária, com evolução aguda a crônica; ocorre quando um agente infeccioso agride a glândula mamária. Caracteriza-se por alterações físicas, químicas e sensoriais do leite, provocadas por microrganismo que invadem a glândula mamária e provocam modificações patológicas no tecido glandular. A mastite pode ser classificada quanto à forma de apresentação, em clínica ou subclínica. A forma clínica observa-se vários sintomas como secreção de leite com grumos, pus ou de aspecto aquoso, tetos e úbere apresentando edemaciados, rígidos e febris. Na forma subclínica os sinais na glândula mamária e no leite são inaparentes. A mastite constitui uma das principais causas de perdas econômicas nas explorações de bovinos leiteiros, devido principalmente à redução na produção de leite, alterações na composição e aumento da contagem de células somáticas (CCS). Objetivou-se neste trabalho, avaliar a prevalência das principais bactérias causadoras da mastite bovina (clínica e subclínica), e verificar o perfil de sensibilidade dos agentes a diversos antimicrobianos da mastite clínica. Os agentes mais isolados da mastite clínica foram Streptococcus uberis e Staphylococcus aureus e o antibiograma demonstrou uma maior eficácia dos principios ativos linezolid, amikacina, gentamicina e imipenene, frente aos agentes isolados. Na mastite subclínica Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis e Staphylococcus sp foram os agentes mais frequentemente identificados e que determinaram maiores valores médios de CCS. A CCS média dos rebanhos com mastite subclínica foi de aproximadamente 743 x 103cel/mL. O estudo foi realizado em oito propriedades leiteiras, localizadas no Estado de Goiás. Os resultados encontrados foram analizados pela análise de frequência. Conclui-se que os resultados obtidos ressaltam a importância da avaliação do perfil de sensibilidade de microrganismos causadores de mastite clínica em cada rebanho estudado, possibilitando maior precisão na prescrição medicamentosa para os futuros casos de mastite clínica e a terapia da vaca seca. É importante também a utilização de outras técnicas como a de PCR em tempo real para a detecção dos principais microrganismos causadores de mastite subclínica, a qual pode ser indicada como método a ser utilizado na rotina, devido a sua especificidade, fornecendo um diagnóstico bacteriológico preciso.

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.

A mastite bovina apresenta alta prevalência nos rebanhos leiteiros e a antibioticoterapia é o procedimento mais utilizado no tratamento da mesma. O Staphylococcus aureus, agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de mastite, tem demonstrado em diversos estudos aumento crescente no padrão de resistência aos antimicrobianos. O desenvolvimento de bactérias resistentes e a presença de resíduos de antimicrobianos no leite estimulam o desenvolvimento de novos tratamentos que solucionem estes problemas. O muco dos moluscos Achatina fulica é composto por uma glicoproteína, denominada achacin, com atividade antimicrobiana sobre bactérias Gram positivas. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do muco de A. fulica sobre S. aureus, bem como determinar e avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) do muco de A. fulica purificado sobre S. aureus ATCC 25923 e isolados de S. aureus provenientes de infecções intramamárias bovina. O muco foi purificado mediante cromatografia líquida de alta eficiência e a fração com atividade antimicrobiana foi submetida à quantificação protéica e microdiluição em caldo. A CIM do muco purificado determinada para a cepa ATCC 25923 correspondeu a 50 µg/mL e para os isolados de S. aureus, variou entre 12,5 e 100 µg/mL. Sendo que destes, dois isolados (6,7 %) apresentaram CIM de 12,5 µg/mL, três (10 %) CIM de 25µg/mL, vinte e três (76,6 %) CIM de 50 µg/mL e dois (6,7 %) apresentaram CIM de 100 µg/mL. A CIM50 para os isolados correspondeu a 50 µg/mL e a CIM90 a 100 µg/mL. No presente estudo observou-se que o muco purificado apresentou atividade antimicrobiana com ação bactericida. Estes resultados proporcionam perspectivas para a compreensão e otimização de protocolos microbiológicos deste potencial biofármaco com a finalidade de empregá-lo futuramente na terapêutica veterinária para o controle de infecções intramamárias causadas por S. aureus. / The bovine mastitis is highly prevalent in dairy herds and antibiotic therapy is the procedure most commonly used to treat it. Staphylococcus aureus is the most frequently isolated etiologic agent in cases of mastitis and it has been shown in several studies the pattern of increasing antimicrobial resistance. Due to the development of resistant bacterias and the presence of antimicrobial residues in the milk the development of new treatments to solve those problems are required. The mucus of the molluscs Achatina fulica contains a glycoprotein called achacin that presents antimicrobial activity against Gram positive bacteria. The aim of this study was the evaluation of the in vitro antimicrobial activity of the A. fulica mucus of on S. aureus, as well the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of A. fulica mucus purified on S. aureus ATCC 25923 and isolates of S. aureus from bovine intramammary infections. The mucus was purified by high performance liquid chromatography. The protein content in portion presenting the was quantified and microdiluted. The MIC determined for the purified mucus strain ATCC 25923 was 50 µg/mL and for the isolates of S. aureus ranged between 12,5 and 100 µg/mL. Among these samples, two isolates (6,7 %) showed MIC of 12,5 µg/mL, three (10 %) of MIC 25 µg/mL, twenty-three (76,6 %) MIC of 50 µg/mL and two (6,7 %) had an MIC of 100 µg/mL. The MIC50 for isolates was 50 µg/mL and MIC90 to100 µg/mL. It was found that the purified mucus showed bactericidal activity. The results showed in the present work improved the understanding and optimization of the biopharmaceutical microbiological potential that could be applied in new protocols in future veterinary therapy for the control of intramammary infections caused by S. aureus.

Um total de 107 S. aureus isolados de casos de mastite, glândulas portadoras, pele do úbere, ordenhadores e insufladores, em rebanhos de São Paulo e Pernambuco, foram tipados por técnicas moleculares PCR-RFLP do gene coa e PCR de spa distinguiram seis perfis. Todas as amostras amplificaram genes coa, spa, icaA e 69% produziram biofilme glicose-induzido in vitro. PFGE identificou 31 perfis e 12 linhagens. Uma linhagem foi predominante (P < 0,0001) e amplamente disseminada em ambas as regiões. Um mesmo perfil foi isolado de mastite clínica, subclínica e portadoras. Houve heterogeneidade genética entre isolados de fazenda. Isolados de origem humana e animal constituíram populações distintas. Poucos isolados de leite, insufladores e pele do úbere tiveram igual perfil. Uma amostra extramamária, 77% dos isolados de leite e. 99% de S. aureus de portadoras produziram biofilme. Não foi detectada correlação entre produção de biofilme e CCS. O isolamento sucessivo do mesmo perfil de PFGE de glândulas assintomáticas por mais de 16 dias caracterizou o estágio de portador. / A total of 107 S. aureus isolated from bovine milk, udder skin, milkers and milking machine, from São Paulo and Pernambuco herds was typed by molecular techniques. PCR-RFLP coa gene and PCR spa gene distinguished six amplicons. All strains amplified coa, spa, icaA genes and, 69% produced in vitro glucose-induced biofilm. PFGE identified 31 pulsotypes, 12 lineages. One of the lineages was predominantly isolated (P<0.0001) and widely disseminated. A same pulsotype was isolated from clinical and, subclinical mastitis as well as from carriers. There was genetic heterogeneity among isolates from the herds. Strains from human and animal origin were genetically different. Few isolates from milk, milking machine and udder skin showed similar pulsotype. An extramammary strain, 77% of the milk isolates and, 99% of the S. aureus isolated from carriers produced biofilm. It was not detected any correlation between SCC and biofilm production. The successive isolation during more than 16 days of a same pulsotype from the asymptomatic glands characterized the carrier status.

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