O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo com sua produção baseada, predominantemente, em animais de origem zebuína (Bos indicus), com níveis do potencial genético de produção inferiores aos animais Bos taurus. Com a possibilidade de emprego de técnicas de genética molecular, a seleção de indivíduos melhoradores para acasalamento e multiplicação repercutem nos índices de produtividade e produção. A utilização de melhores métodos de estudo da variação genética no nível mole cular representa benefícios especialmente nos casos de resistência a doenças, já que essas características apresentam baixa herdabilidade e são afetadas pelo ambiente. O estudo da genética molecular visando o aumento da saúde da glândula mamária de bovinos apresenta a vantagem de poder selecionar animais em idades precoces, antes da produção, para ambos os sexos e, no caso dos machos reprodutores, sem a necessidade de aguardar por informações da saúde da glândula mamária observada somente na descendência dos animais. Para identificar genes com responsabilidade de conferir resistência à mastite bovina, a doença mais importante da bovinocultura, foram realizados diversos experimentos que envolveram um gene do complexo principal de histocompatibilidade (MHC – Major Histocompatibility Complex). Os experimentos com o gene BoLA-DRB3, do MHC, permitiram identificar um alelo novo, desenvolver uma técnica mais eficiente de genotipagem de animais e verificar a distribuição dos alelos em animais da raça Gir Leiteira. Foram também construídas biliotecas de cDNA utilizando a metodologia de ORESTES e tecido de glândula mamária de animais europeus e zebuínos infectados com Staphylococcus aureus . 6.481 sequências expressas (ESTs), obtidas por meio da metodologia de ORESTES, foram depositadas em bases públicas como o GenBank (http://www.ncbi.nih.nlm.gov/) e TIGR (http://www.tigr.org), sendo 5.950 provenientes de animais Bos indicus, o que significou um aumento de vinte vezes no volume de informações disponíveis sobre o transcriptoma de bovinos zebuínos ao tempo deste estudo. / Brazil is the largest cattle commercial herd in the world, mainly based in zebu (Bos indicus) with lower genetic potential than taurus-derived animals. Molecular genetics brought the possibility of better selection of animals for breeding, which increases production levels. The use of molecular methods for studying genetic variation is especially advantageous for disease resistance because of low herdability and envir onment effects. Selection by means of molecular genetics in dairy cattle can be done before production, for males and females. To identify genes responsible for conferring resistance to Mastitis, the most important cattle disease, we studied one gene from the MHC (Major Histocompatibility Complex). The experiments with this MHC gene (BoLA-DRB3) identified a new allele in cattle, developed a genotyping technique, and estimate allelic frequencies for Dairy Gir cows (Bos indicus). CDNA libraries from mammary gland tissues infected with Staphylococcus aureus were also constructed and characterized. 6,481 ESTs (Expressed Sequence Tags) were deposited in GenBank (http://www.ncbi.nih.nlm.gov/) and TIGR (http://www.tigr.org), being 5,950 from Bos indicus cows, which increased by 20-fold the volume of sequence data from the zebu transcriptome, at the time when this study was conducted.

The general objectives of this thesis were: (i) to determine the etiological and molecular profile of clinical mastitis (CM) in 20 dairy herds of Southeast, Brazil; and (ii) to quantify antimicrobial used for treatment of CM in the study population. To achieve this goals, four studies were performed. In the Study 1, we characterized the pathogen frequency and severity of CM in dairy herds. In addition, we determined the incidence rate of clinical mastitis (IRCM) and its association with the following herd-level descriptors: bulk milk somatic cell count (BMSCC), bulk milk total bacterial count (BMTBC), herd size (number of lactating cows), milk yield, housing system and season. The association between herd-level descriptors and IRCM were determined by two groups of mixed regression models: one based on the overall IRCM, and five based on the following specific-pathogen groups: contagious, other Gram-positive, Gram-negative, other (composed of yeast and Prototheca spp), and negative culture. A total of 5,957 quarter-cases of CM were recorded and the most frequently isolated pathogens were Escherichia coli (6.6% of total cultures), Streptococcus uberis (6.1%), and Streptococcus agalactiae (5.9%). The majority of CM cases were mild (60.3%), while 34.1% were moderate and 5.6% severe. Overall, the IRCM was 9.7 quarter-cases per 10,000 quarter-days at risk (QDAR), and the only herd-level parameter associated with overall IRCM was BMSCC, in which the highest IRCM was observed for herds with BMSCC >600.000 × 103 cells/mL. In the models evaluating the specific-pathogen groups, IRCM with isolation of major contagious pathogens was associated with BMSCC, milk yield and housing system. For the evaluation of other Gram-positive pathogens, the IRCM was higher in the rainy season of 2015 in comparison with the other seasonal categories. In addition, for the model evaluating the Gram-negative group, the IRCM was highest in herds with BMTBC >30 × 103 cfu/mL. The Study 2 aimed to characterize the treatment profile and quantify the antimicrobial consumption for treatment of CM in dairy herds; and to determine the association of antimicrobial use (AMU) and the same herd-level descriptors as described in the Study 1. Data on treatment practices and AMU were obtained from 19 dairy herds for a period of 12 months per herd. The AMU for treatment of CM was quantified monthly in units of defined daily dose (DDD) and expressed as antimicrobial treatment incidence (ATI; number of DDD per 1,000 lactating cows-day). The overall monthly mean ATI was 17.7 DDD per 1,000 lactating cow-days (15.4 for intramammary compounds, and 2.2 for systematically administered antimicrobials). Among intramammary drugs, aminoglycosides had the highest ATI (11.7 DDD per 1,000 lactating cow-days), while for systematically administrated antimicrobials, fluoroquinolones (4.2 DDD per 1,000 lactating cow-days) were the most frequently used antimicrobials. Herd size and BMSCC were positively associated with ATI. In addition, herd-level ATI was higher in freestall herds than in compost bedded-pack barns. In the Study 3, we determined the phylogeny of E. coli strains isolated from CM in dairy cows and the association of most frequent phylogroups with antimicrobial susceptibility. A total of 100 E. coli isolates recovered from CM cases described in the Study 1 were categorized according to their phylogenetic group using a quadruplex PCR method; antimicrobial susceptibility pattern was also evaluated. Most isolates were assigned to phylogenetic group A (52%), followed by B1 (38%), B2 (2%), C (4%), D (3%), and E (1%). Resistant isolates were observed for all evaluated antimicrobials. Overall, more than 96% of E. coli isolates were resistant to ampicillin, and more than 23% were resistant to cephalothin, sulphadimethoxine or tetracycline. High levels of resistance (>70%) were also found to erythromycin, oxacillin, penicillin, penicillin associated with novobiocin, and pirlimycin. In contrary, high susceptibility was observed to ceftiofur (96.8%) among E. coli isolates. Difference in the antimicrobial susceptibility among phylogenetic groups was observed only for cephalothin, in which E. coli strains belonging to the phylogroup A were inhibited at lower antimicrobial concentrations than strains assigned to the phylogroup B1. In Study 4, we evaluated the genotypic diversity among Strep. agalactiae and Strep. uberis isolates recovered from CM in dairy cows; in addition, the study evaluated the association of genotypes clustered by genetic similarity with antimicrobial susceptibility pattern. Isolates were subtyped using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. A great genotypic diversity was found for both Strep. agalactiae (45 subtypes out of 89 isolates) and Strep. uberis (56 subtypes out of 88 isolates). For evaluation of antimicrobial susceptibility, subtypes of Strep. agalactiae were clustered into three groups (Ia, Ib and II), while Strep. uberis subtypes were clustered into two groups (I and II) according to their genetic similarity. Overall, Strep. agalactiae isolates showed high susceptibility to most antimicrobials, except to tetracycline and erythromycin. Differences in the antimicrobial susceptibility among clusters of Strep. agalactiae were observed for ampicillin, ceftiofur, erythromycin, pirlimycin, sulphadimethoxine and tetracycline. In contrary, Strep. uberis isolates were categorized as resistant to most antimicrobials, except to cephalothin and penicillin+novobiocin. No differences were observed among clusters for all antimicrobials in the analysis of Strep. uberis. In conclusion, the results of this thesis indicated a high IRCM in the evaluated herds, and although environmental pathogens were the most common cause of CM in these herds, contagious pathogens such as Strep. agalactiae and Staph. aureus, are still a concern in some dairy herds of Brazil. Furthermore, high frequencies of AMU and off-label protocols were observed among the evaluated herds. The non-judicious use of antimicrobials can become a risk factor for the development of antimicrobial resistance, which was even observed for isolates belonging to the three most prevalent bacterial species identified from CM cases in our study (E. coli, Strep. agalactiae and Strep. uberis). Finally, because there were some herd-level descriptors associated with the IRCM and AMU in our study, there may be opportunity for management strategies aiming to improve the control of CM in dairy herds of southeastern Brazil. / Os objetivos gerais desta tese foram: (i) determinar o perfil etiológico e molecular da mastite clínica (MC) em 20 rebanhos leiteiros do Sudeste do Brasil; e, (ii) quantificar os antimicrobianos usados para tratamento da MC na população estudada. Para alcançar esses objetivos, quatro estudos foram realizados. No Estudo 1, foi caracterizada a frequência de patógenos causadores de MC e a gravidade das infecções nos rebanhos leiteiros. Além disso, foi determinada a taxa de incidência de mastite clínica (TIMC) e sua associação com as seguintes variáveis em nível de rebanho: contagem de células somáticas em leite de tanque (CCSLT), contagem bacteriana total em leite de tanque (CBTLT), tamanho (número de vacas em lactação), produção de leite, sistema de alojamento e estação do ano. A associação entre as variáveis em nível de rebanho e a TIMC foi determinada por dois grupos de modelos de regressão logística multivariada: um baseado na TIMC geral, e cinco baseados nos seguintes grupos específicos de patógenos: contagiosos, outros Gram-positivos, Gram-negativos, outros patógenos (composto de leveduras e Prototheca spp.), e cultura negativa. Um total de 5.957 casos de MC em nível de quarto mamário foi registrado e os patógenos mais prevalentes foram Escherichia coli (6,6% de todas as culturas), Streptococcus uberis (6,1%), e Streptococcus agalactiae (5,9%). A maioria dos casos de MC foi de gravidade leve (60,3%), enquanto 34,1% dos casos foram moderados e 5,6% foram graves. A TIMC geral foi de 9,7 casos por 10.000 quartos-dia em risco (QDR), e o único parâmetro em nível de rebanho associado com a TIMC geral foi a CCSLT, em que a TIMC mais alta foi observada em rebanhos com CCSLT >600.000 × 103 células/mL. Nos modelos que avaliaram os grupos específicos de patógenos, a TIMC de patógenos contagiosos foi associada com a CCSLT, produção de leite e sistema de alojamento. Na avaliação de outros patógenos Gram-positivos, a TIMC foi maior na estação chuvosa de 2015 em comparação com as outras categorias referentes à estação do ano. Adicionalmente, para o modelo avaliando o grupo de patógenos Gram-negativos, a TIMC foi mais alta em rebanhos com CBTLT >30.000 × 103 ufc/mL. O Estudo 2 teve como objetivo caracterizar o perfil de tratamento e o consumo de antimicrobianos em rebanhos leiteiros; e determinar a associação de uso de antimicrobianos (UAM) e as mesmas variáveis em nível de rebanho descritas no Estudo 1. Dados sobre as práticas terapêuticas e UAM foram obtidos de 19 rebanhos leiteiros durante um período de 12 meses por rebanho. A frequência de UAM para tratamento da MC foi quantificada mensalmente em unidades de doses definidas diárias (DDD) e expressa como incidência de tratamento antimicrobiano (ITA: número de DDD por 1.000 vacas em lactação-dia). A média de ITA mensal foi de 17,7 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia (15,4 para compostos intramamários, e 2,2 para compostos sistêmicos). Entre os produtos intramamários, os aminoglicosídeos tiveram a ITA mais alta (11,7 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia), enquanto que para os compostos administrados pela via sistêmica, as fluoroquinolonas (4,2 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia) foram os antimicrobianos mais frequentemente usados. O tamanho do rebanho e CCSLT foram positivamente associados com a ITA. Além disso, a ITA foi mais alta em rebanhos com freestall do que em rebanhos com sistema tipo compost barn. No Estudo 3, determinou-se a filogenia de cepas de E. coli isoladas de casos de MC em vacas leiteiras, e a associação dos filogrupos mais frequentes com a susceptibilidade aos antimicrobianos. Um total de 100 isolados de E. coli identificados nos casos de MC descritos no Estudo 1 foram categorizados de acordo com os grupos filogenéticos por meio de um método de PCR quadruplex; o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos também foi avaliado. A maioria dos isolados pertenceram ao grupo A (52%), seguido dos grupos B1 (38%), B2 (2%), C (4%), D (3%), e E (1%). Foram encontrados isolados resistentes para todos os antimicrobianos avaliados. De forma geral, mais de 96% dos isolados de E. coli foram resistentes a ampicilina, e mais de 23% foram resistentes a cefalotina, sulfadimetoxina ou tetraciclina. Altos níveis de resistência (>70%) foram encontrados também para eritromicina, oxacilina, penicilina e penicilina associada a novobiocina. Ao contrário, foi observado alta susceptibilidade ao ceftiofur (96.8%) entre os isolados de E. coli. Diferenças na susceptibilidade entre os grupos filogenéticos foi observada apenas para a cefalotina, em que os isolados de E. coli pertencentes ao filogrupo A foram inibidos em concentrações de antimicrobianas mais baixas que isolados pertencentes ao filogrupo B1. No Estudo 4, avaliou-se a diversidade genotípica entre isolados de Strep. agalactiae e Strep. uberis identificados em casos de MC em vacas leiteiras; adicionalmente, o estudo avaliou a associação dos genótipos agrupados de acordo com a similaridade genética com o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Os isolados foram genotipados por meio do método de amplificação randômica de DNA polimórfico (RAPD). Grande diversidade genotípica foi observada tanto para o Strep. agalactiae (45 subtipos de 89 isolados) quanto para Strep. uberis (56 subtipos de 89 isolados). Para a avaliação de susceptibilidade aos antimicrobianos, os subtipos de Strep. agalactiae foram agrupados em três clusters (Ia, Ib e II), enquanto que os subtipos de Strep. uberis foram agrupados em dois clusters (I e II) de acordo com a similaridade genética. De forma geral, os isolados de Strep. agalactiae apresentaram alta susceptibilidade à maioria dos antimicrobianos, exceto para tetraciclina e eritromicina. Diferenças na susceptibilidade aos antimicrobianos entre os clusters de Strep. agalactiae foram observadas para ampicilina, ceftiofur, eritromicina, pirlimicina, sulfadimetoxina e tetraciclina. Por outro lado, os isolados de Strep. uberis foram resistentes à maioria dos antimicrobianos, exceto para cefalotina e penicilina + novobiocina. Não foram encontradas diferenças entre os clusters para todos os antimicrobianos na análise de Strep. uberis. Em conclusão, os resultados desta tese indicaram alta TIMC nos rebanhos avaliados, e apesar de os patógenos ambientais serem a causa mais comum de MC nestes rebanhos, patógenos contagiosos como Strep. agalactiae e Staph. aureus, ainda são uma preocupação em alguns rebanhos do Brasil. Além disso, observaram-se altas frequências de UAM e de terapias não recomendadas em bula entre os rebanhos avaliados. O uso não judicioso de antimicrobianos pode se tornar um fator de risco para o desenvolvimento da resistência bacteriana aos antimicrobianos, o que foi inclusive observado para isolados pertencentes as três espécies bacterianas mais prevalentes nos casos de MC no nosso estudo (E. coli, Strep. agalactiae e Strep. uberis). Finalmente, pelo fato de algumas variáveis em nível de rebanho terem sido associadas com a TIMC e com o UAM em nosso estudo, é possível que hajam oportunidades para implementação de estratégias de manejo com o objetivo de melhorar o controle da MC em rebanhos leiteiros do sudeste do Brasil.

Os objetivos do presente estudo foram os de verificar a validade do método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para detectar e quantificar o Staphylococcus aureus em amostras de leite conservadas com bronopol oriundas de quartos mamários bovinos subclinicamente infectados, e de avaliar os efeitos da presença e da quantidade de células da bactéria sobre a contagem de células somáticas (CCS), a composição do leite (lactose, gordura, proteína bruta, proteína verdadeira e caseína), e a produção de leite de quartos mamários bovinos subclinicamente infectados pelo patógeno. Para a quantificação do S. aureus e das células somáticas bovinas por meio do qPCR, foi utilizado leite cru bovino para o preparo dos padrões como meio de diluição da inoculação seriada de células somáticas e do S. aureus ATCC 29213, e construídas as equações log10UFC = 37,86 23,54 log10CtSAU e log10CCS = 49,3 - 34,0 log10CtBMCB, com base nos resultados obtidos pelas metodologias de referência para cada procedimento. Para testar a equivalência dessas equações aos respectivos métodos de referência, determinar a sensibilidade e especificidade analíticas e a repetibilidade do método proposto, foram coletadas amostras de leite dos quartos mamários de 60 animais de 2 rebanhos leiteiros da região de Pirassununga dos quais se determinou previamente a ocorrência de casos subclínicos de mastite por S. aureus. Dos quartos mamários também foram mensuradas as produções e coletadas amostras de leite para análise de composição, diagnóstico da mastite, e determinação da sensibilidade e especificidade diagnósticas do procedimento de qPCR estabelecido no estudo. Cada amostra foi submetida à análise de composição, CCS, cultura microbiológica, contagem em placas do S. aureus, processadas para a extração do DNA genômico bovino e do S. aureus, e submetida à reação de qPCR. Para análise da concordância entre os resultados obtidos pelos métodos de referência para o diagnóstico da mastite por S. aureus e o de qPCR foi utilizado o teste Kappa. Para avaliação da equivalência das contagens obtidas pelos métodos de referência do S. aureus e de células somáticas bovinas, foi utilizado o teste das diferenças de Bland-Altman. Para a identificação do efeito da infecção subclínica pelo S. aureus sobre a composição e produção de leite do quarto mamário afetado foi utilizada a análise da variância num delineamento em parcelas subdivididas em faixas. Para estimar o grau de relação entre as contagens de S. aureus, a CCS, produção e composição do leite produzido pelo quarto mamário afetado foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson. A correlação entre os resultados de contagem de células somáticas bovinas determinados pelos métodos de rotina e de qPCR para a quantificação de células somáticas apresentou coeficiente r = - 0,978 (P < 0,001). A correlação entre os resultados da contagem do S. aureus ATCC 29213 determinados pelos métodos de rotina e de qPCR para a quantificação do patógeno apresentou coeficiente r = - 0,989 (P < 0,001). A especificidade analítica do qPCR para a detecção do S. aureus em amostras de leite frente a Escherichia coli, Enterococcus sp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, os estafilococos coagulase-negativa, e as espécies coagulase-positiva Staphylococcus hyicus e Staphylococcus intermedius foi de 100%. O método de qPCR aplicado à detecção de Staphylococcus aureus ATCC 29213 em amostras de leite é replicável e apresentou sensibilidade analítica com limite de detecção para a faixa de 10 UFC/mL à 4,2 x 106 UFC/mL. Em amostras de leite conservadas com bronopol provenientes de quartos mamários subclinicamente infectados, o S. aureus pôde ser detectado, mas não pôde ser quantificado pelo método de qPCR. Nessas amostras, a CCS pôde ser determinada de forma equivalente ao método de rotina. A CCS independe da contagem de S. aureus viáveis, mas foi observada correlação linear e negativa entre o número total de células do patógeno e a CCS. A mastite subclínica pelo S. aureus aumentou a CCS nos quartos mamários, mas não alterou a composição do leite. A doença diminuiu a produção de leite e de gordura dos quartos mamários anteriores acometidos pela infeção, mas não se observou efeito da interação entre o posicionamento da glândula e a infecção sobre a produção de leite. Houve correlação entre as concentrações de lactose (r = 0,42; P = 0,0051), de gordura (r = 0,46; P = 0,0016), de produção de gordura (r = 0,49; P = 0,001), e de leite com produção ajustada para o teor de 3,5% de gordura (r = 0,41; P = 0,006), e o número de S. aureus presentes na amostra de leite. / The objectives of this study were to verify the validity of the real-time polymerase chain reaction (qPCR) to detect and quantify Staphylococcus aureus in bronopol-preserved milk samples from subclinically infected mammary quarters, and to assess the effects of the presence and amount of the pathogen on the somatic cell count (SCC), the composition of milk and milk yield of bovine mammary quarters subclinically infected by the pathogen. In order to quantify S. aureus and bovine somatic cells through qPCR, raw bovine milk was used as a means of serial inoculation media of somatic cells and S. aureus ATCC 29213. From that, equations based on the reference methods for each procedure were built, log10UFC = 37,86 23,54 log10CtSAU and log10CCS = 49,3 - 34,0 log10CtBMCB, respectively. To test their equivalence with the reference methods, determine the analytical sensitivity and specificity, and repeatability of the proposed method, milk was sampled from quarters of 60 animals from two dairy herds in Pirassununga, where subclinical S. aureus mastitis cases had been previously diagnosed. Also, quarter milk yield had been measured and samples collected for milk composition analysis, diagnosis of mastitis, sensitivity and specificity of the procedure established in the study had been determined. Each sample was subjected to composition analysis, SCC, microbiological culture, plate counting of S. aureus, DNA extraction, and subjected to qPCR reaction. Agreement between results from reference methods and qPCR for the diagnosis of mastitis by S. aureus was assessed by Kappa test. Equivalence between S. aureus, SCC scores obtained by reference and qPCR was assessed with Bland-Altman procedures. The effect of S. aureus subclinical infection on milk composition and milk yield of affected quarters was measured using a strip plot design. To estimate the degree of relationship between the counts of S. aureus, SCC, yield and composition of the milk from affected quarters was assessed by the Pearson Correlation. Correlation between SCC determined by routine methods and qPCR was r = - 0.978 (P <0.001). Correlation between S. aureus ATCC 29213 determined by routine methods and qPCR was r = - 0.989 (P <0.001). Analytical specificity of qPCR to detect S. aureus in milk samples against Escherichia coli, Enterococcus sp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, coagulase-negative staphylococci and coagulase-positive species, Staphylococcus hyicus and Staphylococcus intermedius was 100%. The use of the qPCR to detect S. aureus ATCC 29213 in milk samples is replicable. Analytical sensitivity detection limit of the method ranged from 10 CFU/mL to 4.2 x 106 CFU/mL. S. aureus could be detected, but not quantified by qPCR in bronopol-conserved milk samples from subclinically infected quarters. In these samples, SCC could be determined by qPCR as it had been done by routine method. SCC was not dependent on S. aureus viable cells, but a negative linear correlation between the total number of cells of the pathogen and SCC was observed. S. aureus subclinical mastitis increased quarters SCC, but did not change milk composition. The disease decreased quarter milk and fat yield, but no interaction effect was observed between the gland positioning and S. aureus subclinical infection on milk production. Correlations between lactose (r = 0.42, P = 0.0051), fat (r = 0.46, P = 0.0016), fat yield (r = 0.49, P = 0.001), and 3.5% fat adjusted milk yield (r = 0.41, P = 0.006), and the number of S. aureus present in the milk sample were observed.

O uso imprudente de antibióticos para o tratamento da mastite bovina pode levar ao aumento da resistência bacteriana e ao comprometimento da eficácia dos tratamentos atuais. Desta maneira, novas alternativas para o tratamento da mastite devem ser procuradas. As actinobactérias são capazes de produzir extratos brutos que contêm metabólitos secundários ativos, que inibem o crescimento de outras bactérias. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) de extratos brutos de actinobactérias para isolados de Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae e Streptococcus uberis, provenientes de 23 rebanhos leiteiros. Estes isolados foram identificados pela cultura microbiológica e por espectrometria de massas. Assim, foi realizada uma triagem, pelo bioensaio colorimétrico, de 15 extratos brutos, previamente testados e identificados, provenientes de actinobatérias isoladas de diferentes ambientes e plantas (caatinga, áreas de reflorestamento e do eucalipto) para 10 isolados de cada espécie causadora de mastite. Em seguida, os extratos Caat 1-54 e Caat P5-8 foram selecionados para determinação da CIM, a 50% (CIM50) e a 90% (CIM90). Para determinar a CIM dos extratos brutos, foram utilizados 20 isolados de cada espécie, totalizando 80 isolados. Foi utilizada a análise de sobrevivência para avaliação dos resultados. O extrato Caat 1-54 apresentou os menores valores de CIM50 e CIM90 para S. aureus (0,39 µg/mL e 6,25 µg/mL, respectivamente) e S. chromogenes (CIM50 = CIM90 = 0,78 µg/mL). O ceftiofur apresentou os menores valores de CIM tanto para Strep. dysgalactiae (CIM50 &le; 0,048 µg/mL; CIM90 = 100 µg/mL), como para Strep. uberis (CIM50 &le; 0,19 µg/mL; CIM90 = 0,39 µg/mL). Seguido do ceftiofur, o extrato Caat 1-54 foi o que apresentou menores valores CIM, com apenas uma diluição seriada de diferença entre as CIM50 das duas espécies (1,56 e 0,78 µg/mL para Strep. dysgalactiae e Strep. uberis, respectivamente). O extrato Caat P5-8 apresentou os maiores valores de CIM50 e CIM90 para todas as espécies estudadas (CIM &ge; 25 µg/mL). Os resultados obtidos indicam o potencial dos extratos brutos provenientes de actinobactérias para o tratamento da mastite bovina causada por S. aureus, S. chromogenes, Strep. dysgalactiae e Strep. uberis / The reckless use of antibiotics for the treatment of bovine mastitis can increase bacterial resistance and harm the effectiveness of current treatments. Thus, new alternatives for mastitis treatment must be searched. Actinomycetes are capable to produce crude extracts with secondary active metabolites that inhibit the growth of other bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) of crude extracts obtained from actinomycetes for Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis isolated from 23 dairy herds. These bacteria were identified by microbiology culture and mass spectrometry. Thus, the colorimetric bioassay was performed. In this screening 15 crude extracts previously tested and identified, obtained from actinomycetes from different Brazilian environments and plants (caatinga, reforestation areas and eucalyptus) were used for 10 isolates of each mastitis pathogens species. Then the Caat 1-54 and Caat P5-8 extracts were selected to the MIC 50% (MIC50) and 90% (MIC90) determination. Twenty mastitis pathogens isolates of each bacteria species were used. Survival analysis was used to evaluate the results. Caat 1-54 extract presented the lowest values of MIC50 e MIC90 for S. aureus (0.39 µg/mL and 6.25 µg/mL, respectively) and S. chromogenes (MIC50 = MIC90 = 0.78 µg/mL). On the other hand, ceftiofur presented the lowest MIC values for both Strep. dysgalactiae (MIC50 &le; 0.048 µg/mL; MIC90 = 100 µg/mL) and Strep. uberis (MIC50 &le; 0.19 µg/mL; MIC90 = 0.39 µg/mL). After ceftiofur, Caat 1-54 presented the highest efficiency against Strep. dysgalactiae and Strep. uberis and MIC50 for both species differed by only one serial dilution (1.56 e 0.78 µg/mL for Strep. dysgalactiae and Strep. uberis, respectively). Caat P5-8 extract presented the highest MIC50 and MIC90 values for all pathogens (MIC &ge; 25 µg/mL). Results indicated the potential of crude extracts from actinomycetes to treat bovine mastitis caused by S. aureus, S. schromogenes, Strep. dysgalactiae and Strep. uberis

O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da contagem de células somáticas (CCS) sobre características físico-químicas (pH, acidez, composição, cor), microbiológicas, índices de proteólise e lipólise, formação de compostos de Maillard, viscosidade aparente e frações protéicas do leite integral obtido pelo processamento direto de temperatura ultra alta (UAT). O leite cru foi avaliado quanto ao nível de células somáticas (CS) e características físicoquímicas. As amostras de leite foram colhidas em usina de beneficiamento de leite UAT no Estado de São Paulo. O leite cru foi submetido à pasteurização rápida e foi efetuada a esterilização industrial do leite por processo UAT direto, seguido do envase do produto. As análises no leite UAT foram realizadas nos dias 8, 30, 60, 90 e 120 após a fabricação. Quinze lotes de leite UAT foram avaliados para verificar a correlação entre a CCS e as variáveis estudadas. Adicionalmente, os lotes foram categorizados em grupos de baixa, intermediária e alta CCS. No leite cru, houve correlação negativa (r= -0,54, P=0,04) entre CCS e níveis de &alpha;S2 e ß-caseína. No leite UAT, o aumento da CCS foi acompanhado de uma diminuição dos níveis de &alpha;s1-caseína (r= -0,56, P=0,03) e ß-caseína (r= -0,56, P=0,03) aos 8 dias de armazenamento. No 60º dia após a fabricação a CCS foi correlacionada à diminuição de &alpha;S2-caseína (r= -0,69, P=0,005). A CCS exerceu efeito significativo (P=0,02) sobre o componente a*, com maiores (P=0,02) valores para o grupo de alta CCS em relação ao de CCS intermediária, e sobre a ß-caseína (P=0,02), com menores (P=0,03) concentrações no grupo de alta CCS comparado ao de CCS baixa. Os valores de pH, L*, proteína verdadeira e caseína apresentaram diminuição significativa ao longo do armazenamento. Contrariamente, a acidez, o componente a*, os ácidos graxos livres, a viscosidade e a proteólise aumentaram significativamente. A quantidade de caseína em relação à proteína verdadeira foi negativamente correlacionada à CCS no 120º dia de armazenamento. Observou-se redução significativa nas concentrações de frações protéicas durante o armazenamento, com exceção da &alpha;S2-caseína. A CCS no leite cru utilizado para a fabricação de leite UAT pode prejudicar a qualidade do produto por possíveis alterações decorrentes da proteólise no final da vida de prateleira. / The aim of this study was to evaluate the effects of somatic cell counts (SCC) on physicochemical characteristics (pH, acidity, composition, color), microbiology, proteolysis and lipolysis indexes, Maillard compound formation, apparent viscosity and protein fractions of whole milk obtained by direct ultra high temperature (UHT) process. The raw milk was analyzed for somatic cell (SC) levels and physico-chemical characteristics. Milk samples were collected in a dairy plant in São Paulo State. Raw milk was submitted to HT-ST pasteurization and industrial sterilization was taken by direct UHT process, followed by the packing. UHT milk analyses were conducted on days 8, 30, 60, 90 and 120 of storage. Fifteen batches of UHT milk were evaluated for correlations between SCC and the parameters studied. Additionally, UHT milks were categorized in selected groups of low, intermediate and high SCC. Raw milk presented a negative correlation (r= -0.54, P=0.04) between CSS and levels of &alpha;S2 and ß-casein. In UHT milk, SCC increase was followed by a reduction of &alpha;S1-casein (r= -0.56, P=0.03) and ß-casein (r= -0.56, P=0.03) concentrations on the 8th day of storage. On 60th day of storage, SCC was correlated with the reduction (r= -0.69, P=0.005) on &alpha;S2-casein concentration. SCC had significant effect on component a* (P=0.02), which values were higher (P=0.02) on high SCC group compared to the intermediate SCC group, and on ß-casein (P=0.02), with lower (P=0.03) concentrations in high SCC group than in low SCC group. Values of pH, L*, true protein and casein presented significant reduction during storage. Conversely, acidity, component a*, free fatty acids, viscosity and proteolysis increased significantly. Casein in relation to true protein was negatively correlated with SCC on 120th day of storage. It was observed a significant reduction on protein fractions concentrations in UHT milk during storage, except for &alpha;S2-casein. SCC in raw milk used for UHT milk production may prejudice the quality of the product through alterations caused by proteolysis in the end of shelf life.

O trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência do sistema de resfriamento adiabático evaporativo (SRAE), acionado em diferentes horários, em instalação do tipo free-stall e a interação entre o ambiente e a ocorrência de mastite bem como seus reflexos nas respostas produtivas, fisiológicas e comportamentais de vacas em lactação. Foram utilizadas 28 vacas em lactação, multíparas, das raças Holandesa Preta e Branca e Parda Suíça, com produção média diária de 23 kg de leite/animal por dia distribuídas em um delineamento inteiramente casualisado. O período experimental de 56 dias teve início em 20 de janeiro de 2003. Os tratamentos foram: controle (sem SRAE); Dia (SRAE acionado das 7 às 19 h); Noite (SRAE acionado das 19 às 7 h) e 24 horas (SRAE acionado durante 24h). Os equipamentos foram acionados toda vez que a temperatura atingiu 22ºC. A temperatura de bulbo seco (TBS), umidade relativa do ar (UR) e a temperatura de globo negro (TGN) foram mensuradas ao longo das 24 horas. A freqüência respiratória (FR), a temperatura retal (TR) e temperatura do pelame (TP) foram tomadas duas vezes por semana às 7, 13 e 21 h. A ordenha foi realizada às 7 e às 19 h. Amostragens semanais de leite e sangue foram realizadas para análise da composição do leite (gordura, proteína, lactose e contagem de células somáticas) e determinações hormonais de cortisol, tiroxina (T4) e triiodotironina (T3). Para análise comportamental foram observadas, semanalmente, as atividades (ingestão de água, alimento, ruminação e ócio, em pé ou deitada) de cinco animais de cada tratamento, por um período de 24 horas, em intervalos de 10 minutos. Para avaliação da ocorrência de mastite clínica e subclínica foram feitos exames semanais de TAMIS (caneca de fundo preto) e California Mastitis Test (CMT). Foram colhidas amostras de leite de todos os quartos para identificação microbiológica dos agentes causais da mastite. A climatização do free-stall utilizado no tratamento dia conseguiu manter a temperatura dentro da faixa de termoneutralidade até as 12 h, mas a partir da 17 h a TBS do tratamento dia foi significativamente maior que o tratamento controle e 24 horas. As TGN, UR e ITU permaneceram acima da termoneutralidade. Foi observada uma correlação linear positiva entre a temperatura retal e as TP. Nos animais do tratamento controle os níveis de cortisol encontravam-se acima dos níveis normais. O consumo de matéria seca dos animais submetidos ao tratamento noite foi maior (P<0,05), entretanto, isso não refletiu na produção de leite. Os animais do tratamento controle e 24 horas permaneceram o menor tempo se alimentando, gastaram mais tempo em ócio, e levaram menos tempo ruminando. Na fase pré-experimental a maior freqüência de isolamento bacteriano foi para Staphylococcus coagulase negativa. No tratamento noite e dia, houve uma diminuição na proporção de casos positivos de mastite subclínica da fase pré-experimental em relação à última semana da fase experimental. Na última semana da fase experimental houve uma diminuição de Staphylococcus coagulase negativa e aumento da ocorrência de Corynebacterium sp. / The purpose of this research was to compare the efficiency of three different schedule for using an adiabatic evaporative cooling with misting system (AEC) in a free-stall and its influence on the occurrence of clinical and sub clinical mastitis, as well as, on the physiological and milk production parameters on lactating cows. A total of 28 Brown Swiss and Holstein multiparous cows were random allocated in four groups. At starting of the experiment the daily average of milk production was 23 kg per animal. The overall experimental period was of 56 days, starting from January 20th. Treatments were: control group (without AEC); Day (AEC turned on from 7 to 19 h); Night (AEC turned on from 19 to 7 h) and 24 h (AEC turned on during 24h). Every time the temperature reached 22ºC the AEC automatically start functioning. The dry bulb temperature (DBT), relative humidity (RH) and black globe temperature (BGT) were measuread hourly inside and outside of facilities through a period of 24 hours. The respiratory frequency (RF), rectal temperature (RT) and skin temperature (ST) were registered twice a week at 7, 13 e 21 h. The milking was performed at 7 and 19 h. The samples of milk and blood were weekly taken to be performed the milk composition analyses (fat %, protein %, lactose %, somatic cell counts) as well as to hormonal analyses of cortisol, thyroxin (T4) e triiodothyronine(T3) levels. To be performed the behavior analyses five animals, from each group, were weekly observed, each 10 minutes during a 24h period, in respect to the following activities: water and food ingestion, ruminating, and time in resting on foot or lying. The results of the strip cup and California Mastitis Test (CMT) were weekly registered to evaluate the occurrence of clinical and subclinical mastitis. Milk samples were aseptically collected from the quarters of all animals to be submitted to microbiological examination to etiologic mastitis microorganisms identification. The free-stall cooling used in the day group kept the temperature under the thermoneutrality range till 12 h, however from 17 h in the day group the DBT was statistically higher than in control and 24 h groups. It was detected significant difference among the groups (P<0.05) in respect to the following parameters: BGT, RH e temperature-humidity index (THI) that was higher than the thermoneutrality range. It was observed a positive linear correlation between rectal temperature and PT. The cortisol levels among the control group animals were higher than the normal values. In spite of the dry matter consume by the animals of night group were higher (P<005), the same was not observed in respect of milk production. The animals of the control group stayed less time eating stayed longer lazily and less time ruminating. Staphylococcus coagulase negative was the most commonly isolate before the experimental period It was observed a reduction on subclinical mastits frequency in the animals of day and night groups when compared to the last week of the experimental period. It was observed a reduction on Staphylococcus coagulase negative frequency and increased Corynebacterium sp occurrence in the last week of the experimental period.

A mastite subclínica (MS) é a doença mais prevalente em rebanhos leiteiros e pode ser identificada pela contagem de células somáticas (CCS) individual das vacas. A partir disso, indicadores podem ser calculados como, por exemplo, prevalência e incidência. A prevalência diz respeito à proporção do rebanho infectada em determinado momento, enquanto que a incidência estima a taxa de novas infecções intramamárias ao longo do tempo. Altos valores de prevalência e incidência acabam resultando em elevada CCS do tanque de resfriamento (CCST), que por consequência leva a penalizações oriundas dos programas de pagamento por qualidade do leite (PPQL). Desta forma, estimar os valores atuais de prevalência e incidência de MS relacionados com valores futuros de CCST e as perdas financeiras oriundas dos PPQLs se torna importante para estimular a melhoria da qualidade do leite produzido no Brasil. Portando, o objetivo deste trabalho é estimar os indicadores epidemiológicos de MS em rebanhos leiteiros brasileiros, além prever a CCST relacionando-a as perdas financeiras devidas ao PPQL. Para isso, foram utilizados dois bancos de dados, sendo o primeiro com dados de CCS individual de vacas para estimação da prevalência e incidência de MS, e o segundo com dados de CCST para a previsão e cálculo de perdas financeiras devido ao PPQL. Como análise estatística, foi utilizado o modelo linear generalizado misto para comparar a prevalência e incidência de MS entre anos, regiões, tamanho de rebanhos e categorias de número de testes enviados durante o período de estudo, além de modelos de séries temporais para previsão da CCST e regressão linear múltipla para prever a probabilidade de mudança de classe de pagamento por qualidade do leite do PPQL. Os resultados encontrados indicam que, ambos, prevalência e incidência de MS permaneceram elevados e com leve tendência de aumento ao longo dos anos estudados, sendo que não houve diferenças entre regiões e tamanho de rebanhos. Por outro lado, rebanhos que realizaram mais testes ao longo do período estudado apresentaram menor prevalência, mostrando a importância da análise rotineira de CCS individual. Para CCST, os valores tem se mantido altos nos recentes anos e sem tendência de melhora. A probabilidade de mudança de classe foi fortemente afetada pela média e desvio padrão de CCST para as classes 1 e 2 (1.000 a 200.000 e 201.000 a 400.000 céls/mL, respectivamente). Os modelos de séries temporais indicaram que em algum ponto do ano, as fazendas não podiam permanecer na sua classe atual do PPQL e acumulavam perdas financeiras. Por fim, este estudo permite concluir que prevalência e incidência de MS estão elevadas e não melhoram ao longo dos anos, sendo que isto acaba elevando os valores de CCST. Além disso, existem perdas financeiras em todas as classes do PPQL, mostrando que os produtores não tem sido eficientes em captar a bonificação máxima dos PPQLs. Por isso, o desenvolvimento de programas de qualidade do leite deve ser uma prioridade em busca da melhoria da qualidade do leite de rebanhos brasileiros. / Subclinical mastitis (SM) is the most prevalent disease in dairy herds and can be identified by individual somatic cell counts (SCC) of cows. From this, indicators can be calculated as, for example, prevalence and incidence. Prevalence refers to the number of infected cows in a herd at a given time, while the incidence estimates the rate of new intramammary infections over time. High prevalence and incidence values result in high bulk tank SCC (BTSCC), which consequently leads to penalties from payment programs based on milk quality (PPBMQ). In this way, estimating current values of prevalence and incidence of SM related to future values of BTSCC and financial losses from PPBMQs becomes important to stimulate the improvement of the quality of milk produced in Brazil. Therefore, the objective of this study is to estimate the epidemiological indicators of SM in Brazilian dairy herds, besides to predicting the BTSCC and relating it to the financial losses due to the PPBMQ. For this, two databases were used, the first one with individual SCC data from cows to estimate the prevalence and incidence of SM, and the second with BTSCC data for prediction and calculation of financial losses due to PPBMQ. For statistical analysis, the mixed generalized linear model was used to compare the prevalence and incidence of SM between years, regions, herd size and number of test-day categories sent during the studied period, as well as time series models for prediction of BTSCC and multiple linear regressions to predict the probability of changing the current payment class for milk quality. The results indicate that both prevalence and incidence of SM remained high and with a slight tendency to increase over the years studied, and there were no differences between regions and herd sizes. On the other hand, herds that performed more test-day during the studied period presented a lower prevalence, showing the importance of the routine analysis of individual SCC. For BTSCC, values have remained high in recent years and no trend for improvement. The probability of class change was strongly affected by the mean and standard deviation of BTSCC for classes 1 and 2 (1,000 to 200,000 and 201,000 to 400,000 cells/mL, respectively). Time series models indicated that at some point of the year, farms could not remain in their current class and accumulated financial losses due to PPBMQ. Finally, this study allows to conclude that the prevalence and incidence of SM are high and do not improve over the years, and this ends up increasing the BTSCC values. In addition, there are financial losses in all classes of PPBMQ, showing that producers have not been efficient in capturing the maximum PPBMQs bonus. Therefore, the development of milk quality programs should be a priority in order to improve the quality of milk from Brazilian herds.

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.

O uso imprudente de antibióticos para o tratamento da mastite bovina pode levar ao aumento da resistência bacteriana e ao comprometimento da eficácia dos tratamentos atuais. Desta maneira, novas alternativas para o tratamento da mastite devem ser procuradas. As actinobactérias são capazes de produzir extratos brutos que contêm metabólitos secundários ativos, que inibem o crescimento de outras bactérias. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) de extratos brutos de actinobactérias para isolados de Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae e Streptococcus uberis, provenientes de 23 rebanhos leiteiros. Estes isolados foram identificados pela cultura microbiológica e por espectrometria de massas. Assim, foi realizada uma triagem, pelo bioensaio colorimétrico, de 15 extratos brutos, previamente testados e identificados, provenientes de actinobatérias isoladas de diferentes ambientes e plantas (caatinga, áreas de reflorestamento e do eucalipto) para 10 isolados de cada espécie causadora de mastite. Em seguida, os extratos Caat 1-54 e Caat P5-8 foram selecionados para determinação da CIM, a 50% (CIM50) e a 90% (CIM90). Para determinar a CIM dos extratos brutos, foram utilizados 20 isolados de cada espécie, totalizando 80 isolados. Foi utilizada a análise de sobrevivência para avaliação dos resultados. O extrato Caat 1-54 apresentou os menores valores de CIM50 e CIM90 para S. aureus (0,39 µg/mL e 6,25 µg/mL, respectivamente) e S. chromogenes (CIM50 = CIM90 = 0,78 µg/mL). O ceftiofur apresentou os menores valores de CIM tanto para Strep. dysgalactiae (CIM50 &le; 0,048 µg/mL; CIM90 = 100 µg/mL), como para Strep. uberis (CIM50 &le; 0,19 µg/mL; CIM90 = 0,39 µg/mL). Seguido do ceftiofur, o extrato Caat 1-54 foi o que apresentou menores valores CIM, com apenas uma diluição seriada de diferença entre as CIM50 das duas espécies (1,56 e 0,78 µg/mL para Strep. dysgalactiae e Strep. uberis, respectivamente). O extrato Caat P5-8 apresentou os maiores valores de CIM50 e CIM90 para todas as espécies estudadas (CIM &ge; 25 µg/mL). Os resultados obtidos indicam o potencial dos extratos brutos provenientes de actinobactérias para o tratamento da mastite bovina causada por S. aureus, S. chromogenes, Strep. dysgalactiae e Strep. uberis / The reckless use of antibiotics for the treatment of bovine mastitis can increase bacterial resistance and harm the effectiveness of current treatments. Thus, new alternatives for mastitis treatment must be searched. Actinomycetes are capable to produce crude extracts with secondary active metabolites that inhibit the growth of other bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) of crude extracts obtained from actinomycetes for Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis isolated from 23 dairy herds. These bacteria were identified by microbiology culture and mass spectrometry. Thus, the colorimetric bioassay was performed. In this screening 15 crude extracts previously tested and identified, obtained from actinomycetes from different Brazilian environments and plants (caatinga, reforestation areas and eucalyptus) were used for 10 isolates of each mastitis pathogens species. Then the Caat 1-54 and Caat P5-8 extracts were selected to the MIC 50% (MIC50) and 90% (MIC90) determination. Twenty mastitis pathogens isolates of each bacteria species were used. Survival analysis was used to evaluate the results. Caat 1-54 extract presented the lowest values of MIC50 e MIC90 for S. aureus (0.39 µg/mL and 6.25 µg/mL, respectively) and S. chromogenes (MIC50 = MIC90 = 0.78 µg/mL). On the other hand, ceftiofur presented the lowest MIC values for both Strep. dysgalactiae (MIC50 &le; 0.048 µg/mL; MIC90 = 100 µg/mL) and Strep. uberis (MIC50 &le; 0.19 µg/mL; MIC90 = 0.39 µg/mL). After ceftiofur, Caat 1-54 presented the highest efficiency against Strep. dysgalactiae and Strep. uberis and MIC50 for both species differed by only one serial dilution (1.56 e 0.78 µg/mL for Strep. dysgalactiae and Strep. uberis, respectively). Caat P5-8 extract presented the highest MIC50 and MIC90 values for all pathogens (MIC &ge; 25 µg/mL). Results indicated the potential of crude extracts from actinomycetes to treat bovine mastitis caused by S. aureus, S. schromogenes, Strep. dysgalactiae and Strep. uberis

Resumo: Entre agosto de 2005 e dezembro de 2006, foram obtidas 245 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras de leite de vacas com mastite, de óstios papilares da glândula mamária e de insufladores da ordenhadeira, procedentes de um rebanho bovino produtor de leite tipo B. Com a finalidade de monitorar as estirpes de S. aureus envolvidas em casos de mastite bovina por meio da verificação da relação epidemiológica existente entre as estirpes isoladas, especialmente com vistas aos sítios de localização e vias de transmissão, as estirpes foram submetidas à Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE), à amplificação das seqüências codificadoras (sea, seb, sec, sed e tst), por intermédio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), e suas sensibilidades in vitro a 12 antimicrobianos foram determinadas. Os resultados obtidos revelaram 51 diferentes perfis, sendo que a resistência à penicilina foi a predominante entre as 179 (73,1%) estirpes de S. aureus, quando considerada de forma particular (54,8%) ou em conjunto (29,4%). As 66 (26,9%) estirpes restantes foram sensíveis aos 12 antimicrobianos testados e a vancomicina foi o único princípio ativo que se mostrou eficiente a 100% das estirpes testadas. A PFGE revelou 39 pulsotipos distintos, dos quais 25 (64,1%) encontraram-se distribuídos nas 137 (55,9%) estirpes obtidas do leite. Dentre estas, 92 (67,1%) estirpes apresentaram resistência a um ou mais antimicrobianos e foram agrupadas em 22 (88,0%) pulsotipos distintos. Foi observado, também, por meio da PFGE, que nenhum pulsotipo foi isolado por mais de três colheitas consecutivas e que somente o pulsotipo 29 foi identificado em 5 (31,2%) colheitas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two hundred and forty five Staphylococcus aureus strains were isolated between August of 2005 and December of 2006 from samples collected from a type-B milk-producing herd. Samples encompassed milk collected directly from mastitic cows, papillas osteuns of mammary glands, and milking machine cups. Samples were subjected to Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) to monitor for the strains of S. aureus and to determine epidemiologic relationships between the isolated strains, taking into account the different precedence of strains. PFGE was used to monitor the presence of specific coding sequences (i.e., sea, seb, sec, sed, and tst) in the milk samples using polymerase chain reaction (PCR) amplification. Moreover, sensitivity of strains to 12 different antibiotics was determined in vitro. Results revealed the presence of 51 different PFGE profiles of S. aureus in the samples, and highlighted 179 (73.1%) penicillin resistant strains. Nonetheless, the 66 (26.9%) other strains were sensitive to all 12 antibiotics tested, and vancomycin was the only antibiotic effective against all tested strains. PFGE also revealed 39 distinct peaks with 25 of them (64.1%) being present in 137 (55.9%) strains obtained from milk. Of these strains, 92 (67.1%) were resistant to one or more antibiotics, and were further grouped in 22 (88.0%) distinct peaks. Additionally, PFGE revealed the presence of no distinct peaks in samples from three consecutive collection times, and that peak 29 was the only one identified in 5 collection times (31.2%). Importantly, PGFE also indicated that in the periods A and H, which corresponded to 12.5% of the total time points, the isolated strains from one collection day (samples from all 3 sources) all had the peaks 2 and 12, respectively...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Carlos Augusto Fernande de Oliveira / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Doutor