Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T18:55:13Z No. of bitstreams: 1 117110032.pdf: 700015 bytes, checksum: 794f9c0fa96f18e2200227f043531c61 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T18:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 117110032.pdf: 700015 bytes, checksum: 794f9c0fa96f18e2200227f043531c61 (MD5) Previous issue date: 2013-08-02 / A maturação in vitro (MIV) é um dos pontos críticos da produção in vitro de embriões bovinos, sendo que vários fatores podem interferir na MIV, como a tensão de oxigênio e a densidade de oócitos por volume de meio. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da tensão de oxigênio associada a diferentes densidades de oócitos durante a MIV. Para tanto, três experimentos foram conduzidos com oócitos bovinos obtidos de ovários de abatedouro. O experimento I consistiu na avaliação da maturação citoplasmática e nuclear, o experimento II na avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e atividade antioxidante, e o experimento III na avaliação das taxas de fecundação in vitro. Após a seleção, os oócitos foram submetidos a MIV distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos: Tratamento 1:10/5%: 1 oócito em 10μl de meio de MIV em 5% de O 2 ; Tratamento 1:10/20%: 1 oócito em 10μl de meio em 20% de O 2 ; Tratamento 1:20/5%: 1 oócito em 20μl em 5% de O 2 e Tratamento 1:20/20%: 1 oócito em 20μl de meio em 20% de O 2 . A MIV foi conduzida em grupos de 15 oócitos em meio TCM 199 modificado, acrescido de FSH, LH, EGF, soro de égua em estro (SEE) e piruvato por 24h. Decorrido o período de MIV foi conduzida a fecundação in vitro em gotas de 300μl de meio Fert-TALP, sendo realizada pelo co-cultivo de oócitos e espermatozóides (2x10 6 sptz/mL) selecionados por gradientes de mini-Percoll por 18h. No experimento I, as taxas de maturação nuclear (69,66%) e maturação citoplasmática (71,55%) foram similares entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, a produção de ROS foi avaliada nos oócitos e no meio de MIV, assim como a atividade antioxidante foi avaliada após 24 h de MIV. A produção de ROS pelos oócitos foi superior nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%; 13,3UF) em relação a alta tensão de oxigênio (20%; 7,0UF) independentemente da densidade de oócitos (P<0,05). Os níveis de ROS detectados no meio de MIV foram superiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos (1:10) independentemente da tensão de oxigênio (P<0,05). A atividade da SOD (21,3UI) e os níveis de GSH (6,95 nmol GSH/ml) mensurados nos oócitos foram similares entre os tratamentos (P>0,05). As taxas de fecundação e penetração foram superiores nos tratamentos com 20% de O 2 e com alta densidade de oócitos (1:10; 48,8%) em relação aos tratamentos 1:10/5% (29,5%) e 1:20/20% (29,1%; P<0,05). Adicionalmente a taxa de polispermia foi maior no tratamento com alta tensão de oxigênio e baixa densidade de oócitos. (1:20/20%; 27.8%) em relação ao tratamento 1:10/20% (13,41%; P<0,05). Os resultados deste estudo mostram interação entre a tensão de oxigênio e a densidade de oócitos aumentando a produção de ROS em determinadas associações e influenciando posteriormente as taxas de fecundação in vitro de oócitos bovinos. / The in vitro maturation is one of the critical points on in vitro production of bovine embryos so many factors can do an interference on IVM, like oxygen tension and oocyte density by volume of medium. The aim of this study was evaluate the effects of association of oxygen tension with different oocyte density during IVM Three experiments were performed with bovine oocytes obtained from abattoir ovaries, on experiment I was performed the nuclear and cytoplasmic evaluation, on the experiment III the biochemical assay of ROS production and antioxidant activity and on experiment III was realized the evaluation of in vitro fertilization. After selection, the oocytes were randomly distributed in 4 treatments: Treatment 1:10/5%: 1:10µl in 5% of O2; Treatment 1:10/20%: 1:10µl in 20% of O2; Treatment 1:20/5%: 1:20µl in 5% of O2; Treatment 1:20/20%: 1:20µl in 20% of O2. The IVM was performed in droplets (150µl or 300µl) of TCM 199 plus FSH, LH, EGF, EMS and pyruvate. The IVF were performed in droplets (300µl) of Fert-TALP. Was realized IVF with oocytes and spermatozoa (2x106 sptz/mL) selected by Percoll density gradients for 18h. On experiment I, the nuclear maturation rates (69.66%) and reorganization mitochondrial (71.55%) rates were similar among treatments (P>0.05). In Experiment II, the ROS production in oocytes, IVM medium and antioxidant activity were evaluated after 24 h of IVM. ROS production in oocytes was higher on treatments with low tension (5%; 13.3 UF) than 20% oxygen tension (7.0 UF) independently of oocyte density (P<0.05). ROS levels on IVM medium was higher on treatments with high oocyte density (1:10) independently of oxygen tension (P<0.05). The GSH levels (6.95 nmol GSH/ml) and SOD activity (21.3UI) were similar among treatments (P>0.05). The rates of normal fertilization and normal penetration were higher in treatments with 20% of O2 with high oocyte density (1:10;48.8%) than treatments 1:10/5% (29.5%) and 1:20/20% (29.1%; P<0.05). In addiction the polysperm rates were higher on treatment with high oxygen tension and low oocyte density (1:20/20%; 27.8%) than treatment 1:10/20% (13.4%; P<0.05). The results of this study show an interaction between oxygen tension and oocyte density, that increase ROS production on certain associations and subsequently affects the IVF rates. / The viruses are significant important pathogenic agents of several animal species, including cattle. In Brazil, several viral agents causing infections have been described in cattle and they produce significant economic losses. The identification of animals infected by a virus can be performed in different ways; however, definitive confirmation requires demonstration of the agent or immune response. For this purpose, various methods with the capacity to detect the viral particle, biological activity, genome, viral antigens, or specific immune response have been developed. Immunoassays are widely used in laboratory routine for detection of viral antigens in clinical or research. These assays exhibit good sensitivity, specificity and easy for implantation. The immunoassay methodologies are based on the employment of monoclonal or polyclonal antibodies specific to the viral antigens. Therefore, the aim of this study was to produce polyclonal antibodies for some bovine virus, and evaluate their reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot tests. For this purpose, strains and/or isolates of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2), bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), bovine herpesvirus type 5 gE deleted (BoHV-5 gEΔ), bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bluetongue virus (BTV), and vaccinia virus (VACV) were amplified in cell culture and the supernatant were used to immunize rabbits. The animals were immunized five times by the subcutaneous route, and five days after the last boost the blood was collected. The serum was obtained by centrifugation. The serum was diluted (1:100 a 1:204.800) and used as primary antibodies in the immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. The working dilution was selected among those produced specific reaction with infected cells and absent or weak background in control cells. The antiserum showed higher reactivity in immunoperoxidase technique than the immunofluorescence and slot blot. The antiserum of the BoHV-1, BoHV-5, BVDV and BRSV presented the reactivity when tested with heterologous isolates in immunofluorescence, immunoperoxidase assays. In summary, that the polyclonal antibodies raised in rabbits have high concentrations of specific antibodies, which were demonstrated by the reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. Additionally, these reagents can be considered an important tool for the detection and characterization of various bovine viruses in diagnostic and research routine.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In vitro cultured bovine embryos are susceptible to oxidative stress caused by high oxygen concentration, that contributes to free radicals formation. Therefore, antioxidant defense systems are needed to neutralize the reactive oxygen species and their harmful effects. The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations (100, 250 and 500μM) of ascorbic acid (AA) antioxidant to in vitro maturation (IVM, 9 replications) or culture (IVC, 8 replications) media of bovine embryos (Chapter 1). The concentration that provided greatest embryonic development rate and better embryo quality was added to in vitro maturation and/or culture media at different gaseous atmospheres (Chapter 2, 10 replications). Media without antioxidant served as control-groups. Cumulus-oocyte complexes obtained from bovine ovaries at the slaughterhouse were randomly distributed in groups and matured in TCM-199 with addition of pFSH, bLH and 10% estrus cow serum (ECS), for 22 to 24h, in an incubator at 39°C and 5% CO 2 in air and saturated humidity. The in vitro production was performed using 20-40 oocytes/group in 400μL of medium in 4-well dishes (Chap. 1) and 13-32 oocytes/group in 200μL drops of medium under mineral oil (Chap. 2). The in vitro fertilization (D0) was performed with Bos taurus taurus frozen semen selected by Swim-up (Chap. 1) and Percoll gradient (Chap. 2) with 1x106 spermatozoa/mL in TALP-Fert with heparin and PHE, for 18 to 22h, at the same IVM conditions. The presumptive zygotes were in vitro cultured in SOFaaci medium with 5% ECS under mineral oil, in the bag system at 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 and saturated humidity (Chap. 1 and 2), or in an incubator at 5% CO2 in air and saturated humidity (20% O2 in air; Chap 2). To analyze the percentage of embryos on D2, D7 and D9 a randomized block delineation was used, having as blockade criteria the collection day (Chap. 1). In Chap. 2, the cleavage rate on D2 was analyzed considering the effects of AA addition on maturation and culture and the interaction between the two factors. The embryonic development data on D7 and D9 were analyzed after arc sine square root transformation and considered the effects of AA presence on maturation and culture, the gaseous atmosphere and the interaction among these factors, taking into account the routine day in the analyses model. Blastocyst cell number was obtained after base 10 logarithmic transformation of data, using 8 (Chap. 1) and 10 replications (Chap. 2), with a significance level of 5%. In Chapter 1, the cleavage rate and embryonic development on D7 were similar (P>0.05) among the different AA concentrations added to IVM or IVC. However, the 100μM AA addition to IVC tended (P<0.07) to show higher blastocyst production (32.3%) when compared to the 500μM group (19.7%). The blastocyst production on D9 increased significantly when 100μM AA were added to IVM (P<0.05) compared to control-group (38.7 vs 29.0%), or on IVC (P<0.01) compared to 500μM concentration (28.1 vs 14.1%). The blastocyst cell number was similar (P>0.05) among the different AA concentrations and the control-group. In Chapter 2, there was no effect of interaction (P>0.05) among the factors studied (AA on IVM, AA on IVC and atmosphere of culture) on D2, D7 and D9. Cleavage rate and embryonic development on D7 and D9 did not differ (P>0.05) between groups with and without antioxidant addition, independently of the gaseous atmosphere. However, a greater cell number was observed in hatched blastocysts (P<0.05) when the AA was included in the culture medium. The results indicate that 100μM ascorbic acid concentration can be used during IVM or IVC to increase embryo production, especially on D9, and improve the quality of hatched blastocysts, independently of the culture gaseous atmosphere. / Embriões bovinos cultivados in vitro são susceptíveis ao estresse oxidativo causado pela alta concentração de oxigênio, que contribui para a formação de radicais livres. Por isso, sistemas antioxidantes de defesa são necessários para neutralizar as espécies reativas de oxigênio e seus efeitos prejudiciais. Este estudo teve como objetivo avaliar a adição de diferentes concentrações (100, 250 e 500μM) do antioxidante ácido ascórbico (AA) aos meios de maturação (MIV, 9 repetições) ou cultivo (CIV, 8 repetições) in vitro de embriões bovinos (Capítulo 1). A concentração que propiciou maior taxa de desenvolvimento embrionário e melhor qualidade dos embriões foi adicionada aos meios de maturação e/ou cultivo in vitro em diferentes atmosferas gasosas (Capítulo 2, 10 repetições). Meios sem antioxidante serviram como grupos-controle. Complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de frigorífico foram distribuídos aleatoriamente em grupos e maturados em TCM-199 adicionado de pFSH, bLH e 10% de soro de vaca em estro (SVE), por 22 a 24h, em estufa a 39°C e 5% CO 2 em ar e umidade saturada. Para a produção in vitro foram utilizados 20-40 oócitos/grupo em 400μL de meio em placa de quatro poços (Cap. 1) e 13-32 oócitos/grupo em gotas de 200μL de meio sob óleo mineral (Cap. 2). A fecundação in vitro (D0) foi conduzida com sêmen congelado Bos taurus taurus selecionado por Swim-up (Cap. 1) e gradiente de Percoll (Cap. 2), com 1x106 espermatozóides/mL em TALP-Fert com heparina e PHE, por 18 a 22h, nas mesmas condições da MIV. Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em meio SOFaaci com 5% de SVE sob óleo mineral, no sistema de bolsas gaseificadas (bag system) a 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 e umidade saturada (Cap. 1 e 2), ou em estufa a 5% CO2 em ar e umidade saturada (20% O2 em ar; Cap. 2). Para analisar a porcentagem de embriões no D2, D7 e D9 utilizou-se o delineamento blocos ao acaso, tendo como critério de bloqueio o dia da coleta (Cap. 1). No Cap. 2, para analisar a taxa de clivagem no D2 foram considerados os efeitos da adição do AA na maturação, adição do AA no cultivo e a interação entre os dois fatores. Os dados do desenvolvimento embrionário no D7 e D9 foram analisados após transformação arcoseno raiz quadrada e foram considerados os efeitos da presença do AA na maturação, presença do AA no cultivo, a atmosfera gasosa e a interação entre esses fatores, considerando o dia de realização da rotina no modelo de análise. Para contagem de células dos blastocistos os dados foram analisados após transformação logarítmica de base 10, sendo utilizadas 8 repetições (Cap. 1) e 10 repetições (Cap. 2), com nível de significância de 5%. No Capítulo 1, a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 foram similares (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA adicionadas na MIV ou CIV. Entretanto, a adição de 100μM de AA no CIV apresentou tendência (P<0,07) de maior produção de blastocistos (32,3%) quando comparado ao grupo com 500μM (19,7%). A produção de blastocistos no D9 aumentou significativamente quando 100μM de AA foi adicionado na MIV (P<0,05) comparado ao grupo-controle (38,7 vs 29,0%), ou no CIV (P<0,01) comparado com a concentração de 500μM (28,1 vs 14,1%). O número de células por blastocisto foi similar (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA e o grupo-controle. No Capítulo 2, não houve efeito da interação (P>0,05) entre os fatores estudados (AA na MIV, AA no CIV e atmosfera de cultivo) sobre o D2, D7 e D9. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 e D9 não diferiram (P>0,05) entre os grupos com e sem antioxidante, independentemente da atmosfera gasosa. No entanto, maior número de células foi observado nos blastocistos eclodidos (P<0,05) quando o AA foi incluído no meio de cultivo. Os resultados indicam que a concentração de 100μM de ácido ascórbico pode ser utilizada durante a MIV ou CIV para incrementar a produção embrionária, especialmente no D9, além de melhorar a qualidade dos blastocistos eclodidos, independentemente da atmosfera gasosa de cultivo.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_caroline_gomes_lucas.pdf: 894020 bytes, checksum: 8d27baa8c8ae08744efe112062ff8b86 (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / The possibility of increasing the genetic pattern and animal production make the in vitro production of embryos an extremely valuable technique for the technological development of livestock. However, due to the need for mimicking the in vivo process, that consists in several interdependent steps there are difficulties in setting the optimal conditions for each situation performed. The improvement of in vitro maturation (IVM) protocols through supplementation with different molecules can increase the efficiency of the culture medium and improve the competence of oocytes for fertilization and embryogenesis. A promising approach is the realization of mediated delivery of nanocarriers molecules. Tretinoin (TTN, all- trans retinoic acid - ATRA ) is a natural retinoid and active metabolite of vitamin A with important action in cell proliferation and differentiation and embryonic development under both in vivo and in vitro conditions. TTN acts on the cytoplasmic maturation process, in the initial embryonic development and oocyte competence, improving the quality of embryos generated. The combinations of tretinoin with polymeric nanoparticles are alternatives to enhance the solubility and chemical stability of this molecule, allowing controlled release and decreased degradation. The objective of this study was to evaluate the effects of IVM medium supplementation with tretinoin-loaded lipid-core nanocapsules (TTN-LNC) at concentrations of 0.25, 0.5 and 1 μM, by analysis of embryonic development until the blastocyst stage, production of reactive oxygen species (ROS), and expression of genes related to apoptosis and pluripotency. As main results, TTN-LNC 0.25 μM increased the rate of blastocyst production and reduced ROS production. In addition, TTN and TTN-LNC induced a lower gene expression of Bax and SHC1, suggesting beneficial effects on the development of embryos. The results indicate that nanoencapsulation allows the use of a lower dose of TTN-LNC with consequent obtention of higher percentages of blastocyst production and decreased production of ROS, making nanoembriology a potential tool for improving bovine embryos IVP. / A possibilidade de aumento do padrão genético e da produção animal torna a produção in vitro (PIV) de embriões uma técnica extremamente valiosa para o desenvolvimento tecnológico da pecuária. No entanto, devido a necessidade de uma mimetização do processo in vivo, que consiste em várias etapas interdependentes, há dificuldades em ajustar as condições ótimas requeridas para cada situação reproduzida. O melhoramento dos protocolos de maturação in vitro (MIV) através da suplementação com diferentes moléculas permite aumentar a eficiência dos meios de cultivo e melhorar a competência de oócitos para a fertilização e embriogênese. Uma abordagem altamente promissora é a realização da entrega de moléculas mediada por nanocarreadores. A tretinoína (TTN, ácido retinóico all-trans - ATRA) é um retinóide natural e metabólito ativo da vitamina A, com ação importante na proliferação e diferenciação celular, e no desenvolvimento embrionário tanto em condições in vivo como in vitro. A TTN age no processo de maturação citoplasmática, no desenvolvimento inicial embrionário e competência oocitária melhorando a qualidade dos embriões gerados. A associação da tretinoína à nanopartículas poliméricas surge como alternativa para melhorar a solubilidade e estabilidade química desta molécula, possibilitando uma liberação controlada e redução da degradação. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação com nanocápsulas de núcleo lipídico associadas à tretinoína (TTN-LNC) no meio de MIV, nas concentrações de 0,25, 0,5 e 1 μM, através da análise do desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e expressão de genes relacionados a apoptose e pluripotência. Como principais resultados, a TTN-LNC a 0,25 μM aumentou a taxa de produção de blastocistos e reduziu a produção de EROs. Além disso, TTN e TTN-LNC induziram uma menor expressão dos genes Bax e SHC1 sugerindo efeitos benéficos sobre o desenvolvimento embrionário. Os resultados indicam que a nanoencapsulação permite a utilização de uma menor dose de TTN-LNC com consequente obtenção de maiores porcentagens de produção de blastocistos e diminuição da produção de EROs, tornando a nanoembriologia uma ferramenta potencial para a melhora da técnica de PIV de embriões bovinos.

Objetivo:Comparar a eficácia dos meios de cultivo HTF (Human Tubal Fluid) e TCM 199 (Tissue Culture Medium) na maturação in vitro. Métodos:Estudo experimental controlado e randomizado no qual foram avaliadas as taxas de maturação oocitária, fertilização, clivagem e produção de embriões de boa qualidade em 23 ciclos não estimulados de maturação oocitária, com 119 oócitos coletados, de 13 mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos. Os oócitos de cada paciente foram transferidos randomicamente para cada um dos meios de cultivo sendo que, 61 (51%) foram colocados no meio TCM 199 e 58 (49%) no meio HTF. Os dois meios de cultivo receberam suplementação hormonal. Resultados:Diferenças significativas foram encontradas entre os meios de cultivo TCM 199 e HTF em relação à taxa de maturação oocitária (82% vs. 56.9%, p = 0.005), taxa de fertilização (70% vs. 39.4%, p = 0.007) e taxade produção de embriões de boa qualidade (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusão:O meio de cultivo HTF embora seja utilizado para manutenção de embriões em técnicas de fertilização assistida e em procedimentos de maturação in vitrocom ciclos estimulados, não é o meio mais apropriado paramaturação de oócitos obtidos de mulheres com Síndrome dos Ovários policísticosem ciclos não estimulados. / Objective:Compare oocytes human culture in human tubal fluid (HTF) and Tissue Culture Medium (TCM 199) invitromaturation cycles. Methods:Randomized controlled trial which oocyte maturation, fertilization, cleavage rates and embryo quality in 23 in vitromaturation cycles no stimulation were evaluated, resulting in 119 oocytes retrieved from 13 patients withpolycystic ovarian syndrome. The oocytes from each patient were assigned randomly to the two culture media, 61 (51%) to the TCM 199 and 58 (49%) to the HTF using the same hormonal supplementation. Results:Significant differences were observed between TCM 199 and HTF regarding maturation rate (82% vs. 56.9%, p = 0.005), fertilization rate (70% vs. 39.4%, p = 0.007) rates and embryo quality (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusion:The HTF medium, although widely employed for oocyte fertilization and embryo maintenance in IVF techniques, is not an appropriated medium to maturation oocytes obtained from PCOS patients innon - stimulated cycles.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.

Objetivo:Comparar a eficácia dos meios de cultivo HTF (Human Tubal Fluid) e TCM 199 (Tissue Culture Medium) na maturação in vitro. Métodos:Estudo experimental controlado e randomizado no qual foram avaliadas as taxas de maturação oocitária, fertilização, clivagem e produção de embriões de boa qualidade em 23 ciclos não estimulados de maturação oocitária, com 119 oócitos coletados, de 13 mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos. Os oócitos de cada paciente foram transferidos randomicamente para cada um dos meios de cultivo sendo que, 61 (51%) foram colocados no meio TCM 199 e 58 (49%) no meio HTF. Os dois meios de cultivo receberam suplementação hormonal. Resultados:Diferenças significativas foram encontradas entre os meios de cultivo TCM 199 e HTF em relação à taxa de maturação oocitária (82% vs. 56.9%, p = 0.005), taxa de fertilização (70% vs. 39.4%, p = 0.007) e taxade produção de embriões de boa qualidade (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusão:O meio de cultivo HTF embora seja utilizado para manutenção de embriões em técnicas de fertilização assistida e em procedimentos de maturação in vitrocom ciclos estimulados, não é o meio mais apropriado paramaturação de oócitos obtidos de mulheres com Síndrome dos Ovários policísticosem ciclos não estimulados. / Objective:Compare oocytes human culture in human tubal fluid (HTF) and Tissue Culture Medium (TCM 199) invitromaturation cycles. Methods:Randomized controlled trial which oocyte maturation, fertilization, cleavage rates and embryo quality in 23 in vitromaturation cycles no stimulation were evaluated, resulting in 119 oocytes retrieved from 13 patients withpolycystic ovarian syndrome. The oocytes from each patient were assigned randomly to the two culture media, 61 (51%) to the TCM 199 and 58 (49%) to the HTF using the same hormonal supplementation. Results:Significant differences were observed between TCM 199 and HTF regarding maturation rate (82% vs. 56.9%, p = 0.005), fertilization rate (70% vs. 39.4%, p = 0.007) rates and embryo quality (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusion:The HTF medium, although widely employed for oocyte fertilization and embryo maintenance in IVF techniques, is not an appropriated medium to maturation oocytes obtained from PCOS patients innon - stimulated cycles.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.