A proteína dermicidina (DCD) é codificada por um gene localizado na porção 12q13 do cromossomo 12, presente apenas em primatas e humanos. A proteína é secretada por células de glândulas da pele, melanócitos, neurônios e células epiteliais da mama normal. Alguns estudos inciais revelaram a participação da proteína DCD em processos oncogênicos nos carcinomas de mama, próstata e melanoma pela sua capacidade de atuar como um fator de crescimento e sobrevivência celular. Nos estudos realizados no nosso laboratório mostramos que a DCD é expressa em células normais da pele, placenta, cérebro e em vários tumores, incluindo os carcinomas de mama e melanoma maligno. Ensaios biológicos e bioquímicos mostraram que o \"knockdown\" da expressão de DCD no melanoma maligno G-361 via RNA de interferência (RNAi) diminuiu significativamente o crescimento in vitro em cultura celular e a formação de tumores em camundongos Nude. Resultados similares foram obtidos quando camundongos Nude transplantados com células de melanoma G-361 foram tratados com anticorpos policlonais de coelhos contra a proteína DCD. Para compreender melhor o papel da proteína DCD na transformação de células de melanoma G-361 foram feitos ensaios de microarranjo de DNA para identificar os genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens pLKO (controle) e IBC-I que expressa o shRNA para o mRNA da DCD. Entre os 374 genes alterados pelo silenciamento, encontramos 162 com expressão aumentada e 212 com a expressão reduzida. Os estudos de bioinformática pelo software MetaCore mostraram que o silenciamento do gene DNA modula as vias canônicas e redes de sinalização mediadas pelo receptores e ligantes da família BAFF/APRIL que contralam a ativação do fator de transcrição NF-kB, bem como para histonas envolvidas na remodelação da cromatina. Os níveis de expressão de mRNA de 9 genes de interesse foram validados por ensaios de RT-qPCR. Em uma segunda fase do estudo, foram analisadas as proteínas presentes em extratos nuclares dos clones pLKO e IBC-I de melanoma maligno G-361 por espectrometria de massas. Nos extratos proteicos da sublinhagem pLKO foram identificadas 74 proteínas nucleares, enquanto que na sublinhagem IBC-I foram identificadas 31 proteínas. Um grupo de 21 proteínas foi identificado em ambas sublinhagens. Estudos de bioinformática pelo programa STRING revelou que 14 das proteínas identificadas na sublinagem G-361-pLKO faziam interações diretas ou indiretas com a DCD. A rede formada por estas proteínas tem como centro a proteína p53, uma proteína chave na regulação do programa de morte celular e sobrevivência ao estresse oxidativo. Por outro lado, notou-se que a maioria das proteínas identificadas no extrato nuclear da sublinhagem IBC-I é da família das histonas e que poderiam atuar em complexos de remodelação da cromatina nas células G-361-IBC-I. Nossos resultados nos possibilitaram sugerir que futuros estudos sobre a expressão das histonas e suas modificações pós-traducionais poderão ajudar a desvendar o possível papel da DCD na regulação epigenética do melanoma e em outros tipos de cânceres / Dermcidin (DCD) is a human gene mapped to chromosome 12q13 region, only identified in primates and humans, and normally expressed in the eccrine glands of skin and brain. Several studies have confirmed that DCD-derived peptides contribute to innate and immune surveillance and in the oncogenic processes of breast, prostate and skin cancers, as revealed by its role as a growth factor and cell survival. We have further explored DCD function and its tumorigenic potential on skin melanocytes by specifically knocking down its expression in G-361 malignant melanoma cells via expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. Biological and biochemical assays showed that the \"knockdown\" in the expression of DCD in G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA decreased significantly the in vitro growth in cell culture and tumor formation in nude mice. Similar results were obtained treating nude mice bearing G-361 melanoma xenografts with rabbit polyclonal antibodies against DCD protein. Here, we present a DNA microarray-based study that identified the genes that are up- and down-regulated in a G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. A total of 372 genes differentially expressed were identified; being 162 genes up-regulated and 212 genes down-regulated. Bioinformatic studies showed that DCD gene silencing modulates canonical pathways and signaling networks mediated APRIL/BAFF receptors and ligands and NF-kB signaling pathway as well as chromatin remodeling mediated by histone family. The mRNA expression levels of 9 genes of interest were validated by RT-qPCR assays. Next we analyzed the proteins present in nuclear extracts from G-361- pLKO and G-361-IBC-I clones by mass spectrometry. We identified 74 proteins in the G-361-pLKO clone and 31 proteins in the G-361-IBC-I. A group of 21 proteins was identified in both sublineages. Bioinformatics analyses by STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) platform showed that a small portion of the proteins identified only in G-361- pLKO cells was predicted to interact directly with DCD. The network formed by these proteins is centered in the p53 protein, a key regulator of survival and cell death program in response to DNA damage and oxidative stress. On the other hand, this network was completed abrogated using the nuclear protein from G-361-IBC-I because of absence of DCD protein. Since most of the proteins identified in nuclear extracts are of the histone family, it is likely that they are acting in the chromatin-remodeling complexes which are important to remodel nucleosomes of the G-361-IBC-I cells. Our results allowed us to suggest that future studies on the expression of histones and their posttranslational modifications may help to unravel the possible role of DCD in the epigenetic regulation of melanoma and other cancers

Evidências sugerem que o fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2), produzido por melanomas, possui importante papel no crescimento tumoral, angiogênese e metástase. Assim, o uso de anticorpo monoclonal (mAb) que reconhece e bloqueia a atividade de FGF2 é uma abordagem a ser considerada em oncologia. O propósito desse estudo foi avaliar a aplicação diagnóstica e terapêutica de um novo anticorpo anti-FGF2, 3F12E7 IgG1, em melanoma experimental B16-F10. Para isso, camundongos C57Bl/6 foram implantados subcutaneamente (ou intravenosamente, para ensaios de metástase) com células de melanoma murino B16-F10 (5x105 células/animal). Quando tumores alcançaram 3-4 mm de diâmetro (ou 24 h pós-inóculo de células B16-F10, no caso de ensaios de metástase), camundongos foram tratados com anti-FGF2 3F12E7 IgG. Animais controle receberam igual volume do veículo ou quantidade de anticorpo controle de isotipo. Grupos: animais tratados com (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1; (2) ligante de CEA IgG1 (controle de isotipo); e (3) veículo. O tratamento dos camundongos portadores de tumor com anti-FGF2 IgG resultou, comparado com os controles salina e de isotipo, em uma redução no número de focos metastáticos nos pulmões (ANOVA, p < 0,05), em ensaios de metástase experimental, bem como em uma menor taxa de crescimento de tumores subcutâneos (n=7/grupo). Esse resultado é acompanhado por uma redução na densidade vascular do tumor, conforme determinado por imunomarcação para CD34 ou CD31. A captação tumoral de anti-FGF2 3F12E7 IgG foi avaliada por métodos de medicina nuclear, usando esse anticorpo radiomarcado com tecnécio-99m. Estudos SPECT/CT in vivo e de biodistribuição ex vivo revelaram que 99mTc-anti-FGF2 3F12E7 IgG pode atingir eficientemente tumores subcutâneos e metastáticos de B16-F10. Assim, esses dados sugerem que anti-FGF2 3F12E7 IgG pode ser uma estratégia antitumoral promissora para melanoma, bem como uma potencial ferramenta de imagem a ser explorada, atuando como um possível traçador para rastrear tumores FGF2-positivos e mapear esse estímulo angiogênico no microambiente tumoral. Aprovado pelo comitê de ética (CAPPesq): número 0942/09 / Compelling evidence suggests that fibroblast growth factor 2 (FGF2), produced by melanomas, plays important role in tumor growth, angiogenesis and metastasis. Therefore, the use of a monoclonal antibody (mAb) that recognizes and blocks FGF2 activity is seen as an approach to be considered in oncology. The purpose of this study was to evaluate the diagnostic and therapeutic application of a new anti-FGF2 antibody, 3F12E7 IgG1, in experimental melanoma B16-F10. For this, C57Bl/6 mice were subcutaneously (or intravenously, for experimental metastasis assay) implanted with murine melanoma B16-F10 cells (5x105 cells/animal). When tumors reached 3-4 mm in diameter (or 24 h after B16-F10 cells injection, in the case of metastasis assay), mice started receiving anti-FGF2 3F12E7 IgG. Control mice received equal volume of vehicle or isotype control IgG amount. Groups: (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1-treated, (2) CEA-binding IgG1-treated (isotype control) and (3) vehicle-treated mice. The treatment of tumor-bearing mice with anti-FGF2 IgG, compared with saline and isotype controls, led to a reduction in the number of metastatic foci in the lungs (ANOVA test, p < 0.05), in experimental metastasis assays, as well as to a lower subcutaneous tumor growth rate (n=7 per group). This result is accompanied by a reduction in the tumor vascular density, as determined by CD34 or CD31 staining. The anti-FGF2 3F12E7 IgG tumor uptake was evaluated by nuclear medicine approaches, using this antibody radiolabeled with technetium-99m. In vivo SPECT/CT and ex vivo biodistribution studies reveled that 99mTc-anti-FGF2 IgG could efficiently achieved B16-F10 subcutaneous and metastatic tumors. Thus, these data suggest that the anti-FGF2 3F12E7 IgG may be a promising antitumor strategy for melanoma, as well as a potential imaging tool to be explored, working as a possible tracer to identify FGF2-positive tumors and map this angiogenic stimulus in the tumor microenvironment. Ethics committee (CAPPesq) approval number 0942/09

A incidência de casos de melanoma tem aumentado em todo o mundo sendo que, apesar do diagnóstico precoce e do advento das terapias moleculares, o número de pacientes que morrem com a doença em estágio avançado continua em elevação. Deste modo as pesquisas atuais têm focado no desenvolvimento de diferentes estratégias para a disponibilização de terapias eficazes e acessíveis. Nesse contexto, a via de administração transdérmica constitui uma alternativa promissora para aumentar a eficácia local e sistêmica de fármacos, incluindo agentes antitumorais. Diversos métodos têm sido desenvolvidos para maximizar a permeação cutânea de fármacos, destacando-se, entre esses, a ablação térmica por radiofrequência (RF). Esse processo resulta na criação de vários microcanais entre a epiderme e a derme, pelos quais diversas moléculas podem passar em direção às camadas mais profundas da pele. Nesse estudo, a eficácia da infusão transdérmica de etoposídeo por dispositivo de radiofrequência fracionada foi avaliada em modelo de melanoma murino. Camundongos da linhagem C56BL/6 foram divididos nos seguintes grupos experimentais: 1) controle; 2) tratados com radiofrequência; 3) tratados com a aplicação tópica de etoposídeo; e 4) tratados com radiofrequência e posterior aplicação tópica de etoposídeo. Os tratamentos foram realizados durante o período de 28 dias. O peso corpóreo, o volume tumoral e o perfil hematológico foram avaliados semanalmente. Ao término do tratamento os animais foram eutanasiados e procedeu-se a coleta da massa tumoral e dos órgãos (pulmão, baço, rins, linfonodos e fígado) para análise histopatológica. As células tumorais obtidas das massas tumorais foram analisadas quanto às alterações do ciclo celular e do potencial transmembrânico mitocondrial. Os resultados demonstraram que o tratamento com etoposídeo isolado reduziu a sobrevida dos animais e ocasionou alterações histológicas indicativas de toxicidade. Em contrapartida, a infusão transdérmica do etoposídeo por dispositivo de radiofrequência promoveu redução significativa do volume tumoral, em comparação com todos os grupos experimentais, sem ocasionar mortalidade. Esse tratamento também diminuiu a plaquetocitose e elevou o número de eritrócitos em comparação com os outros grupos. A análise histopatológica dos órgãos dos animais tratados com RF + etoposídeo evidenciou que não houveram alterações significativas na arquitetura tecidual. Ainda, o grupo tratado com RF + etoposídeo foi o que apresentou o maior percentual de células estacionadas na fase S/G2M e com mitocôndrias inativas, evidenciando o aumento da eficácia demonstrada no estudo in vivo. O conjunto de resultados sugere que o tratamento com a radiofrequência seguida do etoposídeo resulta em melhor resposta antitumoral do quimioterápico, com baixos índices de toxicidade sistêmica / The incidence of melanoma cases has increased worldwide and, despite early diagnosis and targeted molecular therapy, the number of patients dying from metastatic disease continues to rise. Thus, current research has focused on the development of different treatment strategies to provide efficient and accessible solutions. In this sense, transdermal delivery is a promising alternative enhancing the local and systemic efficacy of drugs, including antitumor agents. Several methods have been developed to improve the skin permeation of drugs, highlighting, among those, the radiofrequency thermal ablation (RFA). This process results in the creation of many microchannels between the epidermis and the dermis through which several molecules can pass towards the deeper layers of the skin. In this study, the efficacy of the transdermal delivery of etoposide by a fractional radiofrequency device was evaluated in a murine melanoma model. C56BL/6 lineage mice were divided into the following experimental groups: 1) control; 2) treated with radiofrequency; 3) treated with topical applications of etoposide; and 4) treated with radiofrequency followed by topical applications of etoposide. The animals were treated for 28 days and the body weight, tumor volume and hematological profile were analyzed weekly. At the end of the treatments, the animals were euthanized and the tumor mass and organs (lung, spleen, kidneys, lymph nodes and liver) were collected for histopathological analysis. Tumor cells obtained from the tumor masses were analyzed for changes in the cell cycle and mitochondrial transmembrane potential. The results showed that the treatment with etoposide alone reduced the survival of the animals and caused histological changes indicating toxicity. On the other hand, the transdermal delivery of etoposide by a radiofrequency device resulted in a significant reduction of the tumor volume, in comparison with all the experimental groups, not causing mortality. This treatment also decreased thrombocytosis and increased the number of red blood cells compared to the other groups. The histopathological analysis of the organs from animals treated with RFA + etoposide demonstrated that there was no significant change in tissue architecture. Furthermore, the group treated with RFA + etoposide presented the highest percentage of cells with inactive mitochondria and interruption at the S/G2M stage, corroborating the increased efficacy of the in vivo study. The set of results indicates that the treatment with radiofrequency followed by etoposide results in better antitumor responses of chemotherapy, with low toxicity rates

No processo de metástase os movimentos de migração e invasão tem um papel essencial e em ambos a função dos microfilamentos é de grande importância. Neste contexto, o presente trabalho buscoui analisar os efeitos da droga jaspamídeo e após a determinação das concentrações de IC50 para as linhagens HT144 e NGM foram estudados os efeitos da droga. Os tratamentos mostraram que o fármaco atua desorganizando o citoesqueleto de modo dependente de sua concentração. Os ensaios de ferida mostraram diminuição da taxa de fechamento da área livre após os tratamentos e os ensaios de migração com placas de transwell mostraram que os grupos tratados sofrem aumento desse parâmetro. Nos ensaios de invasão com câmara de Boyden o tratamento mostrou-se efetivo apenas para a célula NGM quando tratadas com 75 nM de jaspamídeo e 30 <font face=\"Symbol\">mM de Y-27632. Quanto à migração, a linhagem NGM não completava este processo quando tratada com as concentrações do IC50 e do IC50/2 acrescido de Y-27632 e a linhagem HT144 apresenta aumento deste parâmetro quando tratado com jaspamídeo e 200 <font face=\"Symbol\">mM de NSC23766. / Many signaling ways are involved in metastasis and the cellular migration and invasion are important in this context. The role of microfilaments is essential in mesenchymal and amoeboid migration. In this context, the present work aimed to analyze the effects of the drug jaspamide and. after the determination of the IC50 concentrations for the HT144 and NGM cell lines, the effects of the treatment with jaspamide were studied. The wound assays indicated a decrease in the free area after the treatments, and the migration assays with transwell showed that, after the inoculation with the drug, the cells increased the process of migration. In the invasion assays with Boydens chamber, the treatment with jaspamide was effective only in NGM cells, when they are treated with 75 nM of the drug plus 30 <font face=\"Symbol\">mM of Y-27632. Regarding the migration process, the NGM cell line did not show movement when treated with the IC50 concentration and the IC50/2 concentration plus Y-27632, and the HT144 cell line increases this parameter when treated with jaspamide and 200 <font face=\"Symbol\">mM of NSC23766.

O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFN<font face=\"Symbol\">b, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma. / Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFN<font face=\"Symbol\">b, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.

Le mélanome métastatique représente le plus mortel des cancers cutanés par sa forte résistance aux thérapies conventionnelles. Les cellules initiatrices de tumeurs (CIT) sont présentes dans de nombreux cancers dont le mélanome. Ces cellules, capables de s’autorenouveller, sont à l’origine de la récidive tumorale et des métastases représentant une cible pour le développement de nouveaux traitements. Les CIT sont confinées dans un microenvironnement tumoral dans lequel des facteurs sécrétés tels que l'Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1) et le Transforming growth factor (TGF-β) favorisent la transition épithéliomésenchymateuse (TEM), un processus clef lié à l’émergence des CIT. En utilisant des cellules de mélanome métastatique, nous avons montré qu’une inhibition d’IGF-1 induit une diminution de la tumorigénicité des cellules en diminuant la capacité des B16-F10 à former des métastases pulmonaires. Outre son action sur la prolifération cellulaire, IGF-1 est impliqué dans le processus de TEM favorisant les propriétés migratoires et invasives des cellules B16-F10. Par ailleurs, IGF-1 joue un rôle majeur dans le maintien des CIT expliquant la forte résistance des mélanomes aux thérapies conventionnelles. Des expériences préliminaires suggèrent que ces activités induites par IGF-1 pourraient être médiées en partie par le facteur TGF-β, un facteur clef de la TEM. D'autres résultats confortent cette hypothèse en montrant une implication directe du TGF-β dans le caractère souche des cellules B16-F10. Ces travaux montrent que l’inhibition de la voie IGF-1/IGF-1R dans le microenvironnement tumoral pourrait être une bonne stratégie pour le développement de traitements anti-tumoraux contre le mélanome. / Metastatic melanoma is arguably the most virulent among human cancers, owing to its propensity to metastasize, and its resistance to conventional therapies. Like in many other cancers, tumor stem cells or tumor initiating cells (TIC), have been identified in melanoma. These cells have the unique ability to self-sustain and renew the tumor and thus represent an interesting target for the development of new therapeutic strategies. TIC are nested in a confined microenvironment where secreted-factors such as Insulin-Like Growth Factor- 1 (IGF-1) and transforming growth factor (TGF-β) promote epithelialmesenchymal transition (EMT), a key process in stemness features acquisition. In this context, we investigated the effects IGF-1 on TIC behavior. Using B16-F10 metastatic melanoma cell line, we show that IGF-1 downregulation curbs lung metastasis suggesting that IGF-1 plays a direct role in the intrinsic tumorigenic potential of these cells.markers associated with an increased expression of the epithelial marker E-cadherin and of the major regulator of melanocyte differentiation MITF. Most importantly, IGF-1 inhibition sharply decreased stemness features, reducing the expression of key stem markers and functional characteristics of MIC. This was associated with an important sensitivity to mitoxantrone treatment. Interestingly, our preliminary data suggest the EMT key component, TGF-β, conveys IGF-1-mediated effects. Indeed, TGF-β directly affects B16-F10 stemness phenotype and markers. In summary, we show that the IGF-1/IGF-1R nexus represents an interesting target for the development of novel therapeutic strategies against metastatic melanoma.

\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Le mauvais pronostic associé aux mélanomes est dû aux taux de réponses très faibles de ces cancers à la radiothérapie et à la chimiothérapie, cette résistance provenant essentiellement de la résistance des mélanomes aux stimuli pro-apoptotiques qui représentent la majorité de l’arsenal anticancéreux actuel.<p>Les plantes de la famille des Amaryllidaceae ont été utilisées dans la médecine traditionnelle à travers le monde notamment pour le traitement des tumeurs. Il s’est avéré que les composés responsables de l’activité anticancéreuse de ces traitements traditionnels étaient des alcaloïdes, dont les isocarbostyriles. Nous avons voulu caractériser les propriétés anticancéreuses de la narciclasine, un isocarbostyrile, in vitro et in vivo, et étudier son mécanisme d’action antitumoral dans des cellules de mélanome.<p>Nous avons tout d’abord analysé l’activité inhibitrice de croissance in vitro de ces composés et nous avons observé que l’activité de ces produits était indépendante du caractère résistant ou non des lignées cancéreuses aux stimuli pro-apoptotiques. De plus, à l’exception de la pseudolycorine, ces composés ont une activité cytostatique au niveau de la croissance des cellules cancéreuses. <p>Nous avons ensuite identifié le facteur d’élongation eEF1A, une GTPase, comme étant une cible potentielle de la narciclasine. De nombreux effets biologiques exercés par la narciclasine (inhibition de la synthèse protéique, désorganisation du cytosquelette d’actine, etc…) peuvent s’expliquer grâce à cette cible. Des travaux antérieurs à ma thèse mais auxquels j’ai participé, suggéraient déjà l’implication d’autres GTPases appartenant à la famille des Rho GTPases comme pouvant être également des cibles de la narciclasine. Nous avons également identifié au cours de notre travail de thèse d’autres GTPases, telle que Rac1, comme étant des cibles de la narciclasine. Nous avons toutefois observé que certaines GTPases telles que Ran ne semblaient pas être des cibles de la narciclasine lorsque celle-ci exerce ses effets antitumoraux. Ainsi, si de nombreuses GTPases semblent être des cibles privilégiées de l’action antitumorale de la narciclasine, toutes les GTPases ne le sont pas. Nous avons observé en fait que la narciclasine n’entre pas en compétition avec le GDP / GTP au sein de la poche GTP du facteur d’élongation eEF1A. <p>Des études d’activité in vivo réalisées par notre groupe, soit antérieures à mon travail de thèse (gliomes, cancer du poumon NSCLC), soit au cours de ma thèse (mélanomes), ont montré que la narciclasine à des doses non toxiques (administrations chroniques de 1 mg/kg par voie orale ou par voie intraveineuse) apporte un bénéfice thérapeutique dans différents types de modèles de cancers (gliomes, mélanomes, cancers NSCLC) à conditions que les cellules tumorales soient greffées de manière orthotopique au sein du cerveau de souris immunodéficientes. Ces mêmes cancers s’avèrent insensibles à ces doses non toxiques de narciclasine lorsque les cellules sont greffées en dehors du cerveau chez la souris immunodéficiente. <p>L’ensemble de nos résultats suggèrent que la narciclasine pourrait devenir un nouvel outil dans le combat contre les cancers cérébraux primaires et secondaires, les métastases cérébrales constituants un problème d’importance pour des cancers tels que les mélanomes, les cancers du poumon, les cancers du sein, les cancers rénaux et les cancers colorectaux. Les cancers primaires du cerveau représentent environ 5% de l’ensemble des cancers solides de l’adulte et jusqu’à 20-30% chez l’enfant. Les métastases cérébrales, dont principalement les métastases cérébrales de mélanomes, représentent également environ 5% de l’ensemble des cancers solides de l’adulte. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Melanocytic neoplasms have been genetically characterized in detail during the last decade. Recurrent CTNNB1 exon 3 mutations have been recognized in the distinct group of melanocytic tumors showing deep penetrating nevus-like morphology. In addition, they have been identified in 1–2% of advanced melanoma. Performing a detailed genetic analysis of difficult-to-classify nevi and melanomas with CTNNB1 mutations, we found that benign tumors (nevi) show characteristic morphological, genetic and epigenetic traits, which distinguish them from other nevi and melanoma. Malignant CTNNB1-mutant tumors (melanomas) demonstrated a different genetic profile, instead grouping clearly with other non-CTNNB1 melanomas in methylation assays. To further evaluate the role of CTNNB1 mutations in melanoma, we assessed a large cohort of clinically sequenced melanomas, identifying 38 tumors with CTNNB1 exon 3 mutations, including recurrent S45 (n = 13, 34%), G34 (n = 5, 13%), and S27 (n = 5, 13%) mutations. Locations and histological subtype of CTNNB1-mutated melanoma varied; none were reported as showing deep penetrating nevus-like morphology. The most frequent concurrent activating mutations were BRAF V600 (n = 21, 55%) and NRAS Q61 (n = 13, 34%). In our cohort, four of seven (58%) and one of nine (11%) patients treated with targeted therapy (BRAF and MEK Inhibitors) or immune-checkpoint therapy, respectively, showed disease control (partial response or stable disease). In summary, CTNNB1 mutations are associated with a unique melanocytic tumor type in benign tumors (nevi), which can be applied in a diagnostic setting. In advanced disease, no clear characteristics distinguishing CTNNB1-mutant from other melanomas were observed; however, studies of larger, optimally prospective, cohorts are warranted.