Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (del inglés Mesenchymal Stem Cells, MSC), son células adultas indiferenciadas, que poseen propiedades de autorenovación, inmunomodulación y cuentan con una baja inmunogenicidad. Debido a ello son actualmente consideradas como potenciales agentes terapéuticos celulares para el tratamiento de variadas patologías. En el presente estudio se comparó el potencial de proliferación, inmunomodulación e inmunogenicidad in vitro de MSC derivadas de médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA) fetal bovino. Las MSC fueron asiladas en base a su capacidad de adherencia al plástico y a su morfología fibroblastoide. El potencial de proliferación se determinó en dos concentraciones celulares (5000 y 8500 células/cm2) durante 10 y 15 días de cultivo, respectivamente. La expresión de genes de inmunomodulación indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO), interleuquina 6 (IL-6), factor de crecimiento de transformante β1 (TGFβ1), prostaglandina E2 (PGE2) e interleuquina 10 (IL-10) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) en MSC-MO y MSC-TA estimuladas con interferón γ (IFNγ). Adicionalmente, se cuantificaron los niveles de expresión de genes de inmunogenicidad complejo principal de histocompatibilidad I y II (MHC-I y II) y moléculas coestimuladoras de linfocitos T (CD80 y CD86). Además, se evaluó el efecto de medio condicionado de ambas líneas celulares estimuladas con IFNγ sobre la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL) bovina activadas con aloantígenos. La población de MSC provenientes de MO y TA adherentes al plástico expresaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimales (CD105, CD90 y CD73) en comparación a marcadores hematopoyéticos (CD45 y CD34). Las MSC-MO doblaron su población en menor (P<0,01) tiempo en comparación a MSC-TA (2,9 vs 4,4 días, respectivamente). La exposición de MSC-MO y MSC-TA a IFNγ activó la expresión de mRNA de IDO y aumentó (P<0,05) la concentración del metabolito de IDO, quinurenina en el medio condicionado de MSC. Además, ambas líneas celulares expresaron niveles de mRNA de IL-6, PGE2, TGFβ1 e IL-10 con o sin tratamiento de IFNγ. Las MSC-MO expresan mayores (P<0,05) niveles de mRNA de MHC-II en comparación con MSC-TA. El medio condicionado de ambas líneas celulares suprime la proliferación de PBL bovino. En conclusión, los potenciales de proliferación e inmunogenicidad de MSC son dependientes de la fuente de origen tisular, debido a que las MSC-MO poseen alto potencial de proliferación e inmunogenicidad en comparación a MSC-TA. Sin embargo, ambas líneas de MSC poseen similares potenciales de inmunomodulación. / Mesenchymal stem cells (MSC) are undifferentiated adult cells that possess self-renewal, immunomodulating and low immunogenicity properties. Hence, they are currently considered as potential therapeutic agents for the treatment of various pathologies. In the present study, proliferation, immunomodulation and immunogenicity in vitro potentials were compared between MSCs derived from bone marrow (BM) and adipose fetal bovine tissue (AT). MSC were isolated based on their ability to adhere to plastic and fibroblastoid morphology. The proliferation potential was determined at two cell concentrations (5000 and 8500 cells / cm2) during 10- and 15-days culture periods, respectively. Relative expression of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), interleukin-6 (IL-6), transforming growth factor β1 (TGFβ1), prostaglandin E2 (PGE2) and interleukin-10 (IL-10) were quantified using quantitative PCR (Q PCR) in MSC-BM and MSC-AT stimulated with IFNγ. Additionally, the mRNA levels of immunogenicity genes, major histocompatibility complex I and II (MHC-I and II) and T-cell costimulatory molecules (CD80 and CD86) were determined. In addition, the effect of conditioned medium from IFNγ-stimulated MSC was estimated on the proliferation of alloantigen-activated bovine peripheral blood lymphocytes (PBL). The plastic-adherent population of MSC derived from BM and AT expressed higher (P <0.05) mRNA levels of mesenchymal markers (CD105, CD90 and CD73) compared to hematopoietic markers (CD45 and CD34). MSC-MO doubled population in a shorter (P <0.01) time period compared to MSC-AT (2.9 vs. 4.4 days, respectively). Exposure of MSC-BM and MSC-AT to IFNγ activated the expression of IDO mRNA and increased (P <0.05) IDO-metabolite kinurenine concentration in conditioned medium of MSC. Both MSC lines expressed levels of IL-6, PGE2, TGFβ1 and IL-10 mRNA with or without IFNγ treatment. MSC-BM expresses higher (P <0.05) mRNA levels of MHC-II mRNA in comparison to MSC-AT. Conditioned medium of MSC cell lines suppress the proliferation of bovine PBL. In conclusion, the potential for proliferation and immunogenicity are tissue-source dependent, since MSC-MO has a high potential for proliferation and immunogenicity compared to MSC-TA. However, both MSC lines display similar potential for immunomodulation. / Financiamiento: Proyecto Fondef Idea ID15I10129 y PRONABEC y Beca Presidente de la República del Perú.

En las últimas décadas, las células troncales o células madre han generado un gran interés en diversas áreas de la medicina y la investigación biomédica, sobre todo en campos como la regeneración y terapia celular. Las células mesenquimales estromales, pertenecientes al tipo de células madre adultas, están en el punto de mira en este campo debido a sus características biológicas favorables como su multipotencia, efecto paracrino, propiedades inmunomoduladoras, conducta migratoria, así como a la ausencia de connotaciones ético-morales. Uno de los problemas principales del mantenimiento de las células madre en cultivo es la rapidez con la que estas células se vuelven senescentes, habiéndose demostrado que cultivar estas células en condiciones de hipoxia favorece el mantenimiento de las características primordiales de las células madre. La habilidad de percibir y responder a cambios en la concentración de oxígeno es una propiedad fundamental de las células eucariotas. Dicha propiedad conduce a la adaptación del metabolismo celular y a la regulación de la transcripción génica mediante los factores inducibles por hipoxia (HIF), siendo el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) el mecanismo molecular mejor descrito para el mantenimiento de la homeostasis del oxígeno. Por otra parte, una de las principales vías implicadas en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células madre es la vía de Notch, que modula la transcripción en diversos tipos celulares, vinculando la decisión del destino celular de una célula a la de la célula vecina. Los efectos de Notch en el mantenimiento de la indiferenciación celular o en la iniciación de la diferenciación son dependientes de ambiente y tiempo, garantizando así un equilibrio adecuado entre las células madre y su progenie, interfiriendo o favoreciendo el compromiso celular. Numerosos artículos relacionan las vías HIF y Notch, pero todavía permanecen por esclarecer diversos puntos de la interacción entre ambas vías. La SUMOilación es una modificación postraduccional mediante la cual se une de manera covalente la pequeña proteína SUMO (Small Ubiquitin-related modifiers) a otras proteínas. Las consecuencias de la SUMOilación son diversas y dependen de la proteína que ha sido modificada. Las funciones que se ven alteradas mediante esta modificación son la transcripción, la proliferación, la reparación del ADN y la localización nuclear entre otras. Dada la relación ya descrita entre la hipoxia y la modificación postraduccional SUMO surge este trabajo, donde se describe la interacción entre las vías de HIF, Notch y SUMO. A lo largo de este estudio, hemos relacionado la estabilización de HIF-1¿ con el incremento directo de los niveles generales de SUMO1 y con la consecuente SUMOilación de las proteínas. Entre la SUMOilación de diferentes proteínas incluimos el dominio intracelular de Notch 1 (N1ICD), modificación no descrita hasta el momento. En la presente tesis, esclarecemos los mecanismos de interacción entre estas tres vías altamente conservadas en eucariotas y describimos los sitios clave de SUMOilación de N1ICD. Por otra parte, dilucidamos cómo esta interacción modula el comportamiento de las células mesenquimales estromales con el fin de poder mejorar sus propiedades en vistas a su uso terapéutico. / En les últimes dècades, les cèl·lules troncals o cèl·lules mare han generat un gran interès en diverses àrees de la medicina i la investigació biomèdica, sobretot en camps com la regeneració i teràpia cel·lular. Les cèl·lules mesenquimals estromals, pertanyents al tipus de cèl·lules mare adultes, estan en el punt de mira en aquest camp per les seves característiques biològiques favorables con la multipotencia, efecte paracrí, propietats immunomoduladores, conducta migratòria així com a l'absència de connotacions ètic-morals. Un dels principals problemes del manteniment de les cèl·lules mare en cultiu és la rapidesa amb la qual aquestes cèl·lules es tornen senescents, havent-se demostrat que cultivar aquestes cèl·lules en condicions d'hipòxia afavoreix el manteniment de les característiques primordials de les cèl·lules mare. L'habilitat de percebre i respondre a canvis en la concentració d'oxigen és una propietat fonamental de les cèl·lules eucariotes. Aquesta propietat condueix a l'adaptació del metabolisme cel·lular i a la regulació de la transcripció gènica mitjançant els factors induïbles per hipòxia (HIF), sent el factor induïble per hipòxia 1 (HIF-1) el mecanisme molecular millor descrit per al manteniment de l'homeòstasi de l'oxigen. D'altra banda, una de les vies implicades en el manteniment de l'estat indiferenciat de les cèl·lules mare és la via de Notch, que modula la transcripció en diversos tipus cel·lulars, vinculant la decisió del destí cel·lular d'una cèl·lula a la de la cèl·lula veïna. Els efectes de Notch en el manteniment de la indiferenciació cel·lular o en la iniciació de la diferenciació són dependents d'ambient i temps, garantint així un equilibri adequat entre les cèl·lules mare i la seva progènie, interferint o afavorint el compromís cel·lular. Nombrosos articles relacionen les vies HIF i Notch, però encara romanen per aclarir diversos punts de la interacció entre les dos vies. La SUMOilació és una modificació postraduccional mitjançant la qual s'uneix de manera covalent la proteïnaSUMO (Small ubiquitin-related modifiers) a altres proteïnes. Les conseqüències de la SUMOilació són diverses i depenen de la proteína que ha estat modificada. Les funcions que es veuen alterades mitjançant aquesta modificació són la transcripció, la proliferació, la reparació de l'ADN i la localització nuclear entre d'altres. Donada la relació ja descrita entre la hipòxia i la modificació postraduccional SUMO sorgeix aquest treball, on es descriu la interacció entre les vies de HIF, Notch i SUMO. Al llarg d'aquest estudi, hem relacionat l'estabilització d'HIF-1¿ l'increment directe dels nivells generals de SUMO1 i amb la conseqüent SUMOilació de diferentes proteïnes. Entre la SUMOilació de diferents proteïnes incloem el domini intracel·lular de Notch 1 (N1ICD), modificació no descrita fins al moment. En la present tesi, aclarim els mecanismes d'interacció entre aquestes tres vies altament conservades en eucariotes i descrivim els llocs clau de SUMOilació de N1ICD. D'altra banda dilucidem com aquesta interacció modula el comportament de les cèl·lules mesenquimals estromals per tal de poder millorar les seves propietats en vistes al seu ús terapèutic. / In the past few decades, stem cells have generated great interest in different areas of medicine and biomedical research, especially in fields such as regenerative medicine and cell therapy. Mesenchymal stromal cells, belonging to the group of adult stem cells, are in the spotlight in this field due to their favorable biological characteristics, as well as multipotence, paracrine effects, immunomodulatory properties, migratory behavior or the absence of ethical-moral connotations. One of the main problems of the maintenance of the stem cells in culture is that these cells become senescent in few passages. Our group and others have been shown that culture mesenchymal stromal cells as well as other kind of stem cells under hypoxic conditions, favors the maintenance of the main characteristics of the stem cells. The ability to perceive and respond to changes in oxygen concentration is a fundamental property of eukaryotic cells. This property leads to the adaptation of cellular metabolism and the regulation of gene transcription by hypoxia-inducible factors (HIF), being the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) the best-described molecular mechanism to maintain oxygen homeostasis. In addition, one of the pathways involved in maintaining the undifferentiated state of stem cells is the Notch pathway., that modulates transcription of a wide variety of cell types linking the fate of neighboring cells. Effects of Notch in the maintenance of stem properties or initiation of differentiation is environment and time dependent, thus ensures a proper balance between stem cells and their progeny, interfering or promoting cell commitment. Currently, there are articles in which the HIF and Notch pathways are related, but several points of this interaction between both pathways still remain to be clarified. SUMOylation is a postranslational modification where a small protein called SUMO (Small Ubiquitin-related modifiers) are covalently bound to other proteins. The several consequences of SUMOylation depend on the protein that has been modified. The functions that are altered by this modification include transcription, proliferation, DNA repair and nuclear localization among others. Given the already described relationship between hypoxia and the postranslational modification SUMO, this work emerges, where the interaction between the HIF, Notch and SUMO pathways is described. Throughout this study, we have been related the stabilization of HIF-1¿ with the direct increase of the general levels of SUMO1 and with the consequent protein SUMOylation including the intracellular domain of Notch 1 (N1ICD), modification not described until now. In the present thesis, we clarify the mechanisms of interaction between these three highly conserved pathways in eukaryotes and described the key SUMOylation sites of N1ICD. Furthermore, we elucidate how this interaction modulates the behavior of mesenchymal stromal cells in order to improve their properties in view of a therapeutic use. / Ciria Calduch, M. (2018). Interacción entre las vías HIF, Notch y SUMO y su implicación en la biología de las hMSCs [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/114769 / TESIS

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimáticas (MSC) son células multipotentes que pueden ser aisladas de diversas fuentes tisulares incluyendo médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA). Tanto su potencial de diferenciación como la producción de factores inmunomoduladores, regenerativos, angiogénicos y antibacterianos han generado gran expectativa en el último tiempo sobre el potencial uso de las MSC para el tratamiento de enfermedades tanto en medicina humana como veterinaria. La utilización de MSC en el equino, responde principalmente a la necesidad de tratar patologías asociadas a la actividad deportiva. Las MSC provenientes de tejido adulto equino han demostrado capacidad in vitro de diferenciación tenogénica al ser expuestas al factor BMP-12. En el caso de MSC de origen fetal, se ha reportado que estas células poseen un mayor potencial de proliferación y diferenciación comparado con MSC obtenidas desde tejidos adultos. Sin embargo, el potencial de diferenciación tenogénica de las MSC derivadas de médula ósea fetal equina no ha sido previamente evaluado. El objetivo del presente estudio es evaluar el potencial in vitro de diferenciación tenogénica de MSC obtenidas de la medula ósea fetal equina. MSC provenientes de la MO fetal equina fueron sembradas a una concentración de 23 x 105 células/cm2 bajo el efecto de tres dosis de BMP-12 (25, 50 y 100 ng/mL). La expresión de los genes marcadores de tendón SCX, COL1α1, TNMD y DCN fue evaluada los días 0 y 21. Posteriormente, se evaluó el efecto de una dosis (50 ng/mL) de BMP-12 durante el proceso de diferenciación tenogénica. En ambos experimentos no se apreciaron diferencias morfológicas tanto para células control, como tratadas con BMP-12. La expresión del marcador tenogénicos TNMD no fue detectada en MSC. En tanto, los niveles de mRNA de SCX disminuyeron (P<0,05) el día 21 de cultivo tanto en MSC no expuestas a BMP-12, como en MSC tratadas con 25, 50 y 100 ng/mL de BMP-12. Los niveles de mRNA de COL1α1 no fueron distintos (P>0,05) en MSC controles y en MSC tratadas con 25, 50 y 100 ng/mL de BMP-12. En comparación, los niveles de expresión relativa del gen DCN, aumentaron (P<0,05) en MSC tratadas con 25 ng/mL de BMP-12. En la evaluación del efecto temporal se detectó una disminución (P<0,05) de SCX el día 21 en comparación con el día 0 en MSC tratadas con BMP-12. La expresión relativa del gen COL1α1 no fue distinta (P>0,05) en MSC tratadas con BMP-12 versus el control no tratado durante los 21 días de cultivo y las células de día 0. Los niveles de mRNA de DCN aumentaron (P<0,05) el día 21 en MSC 2 tratadas con BMP-12, en comparación con el día 0. En conclusión, la suplementación con BMP-12 en MSC fetales equinas durante 21 días disminuye los niveles de mRNA de SCX, lo que a su vez no permitió activar la transcripción del gen TNMD, ni aumentar la expresión de COL1α1. El aumento en la expresión del marcador tenogénico DCN en MSC tratadas con BMP-12 sugiere que este factor indujo un progreso en el proceso de diferenciación hacia un estadio avanzado de diferenciación tenogénica. / Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells than can be isolated from diverse tissue sources including bone marrow (BM) and adipose tissue (AT). The differentiation and immunomodulatory potentials, and the production of trophic factors involved in regenerative, angiogenic and antibacterial activity have generated great expectative on the potential use of MSC for the treatment of diverse pathologies in veterinary and human medicine. The use of MSC in equine responds mainly to the need to treat pathologies associated with sports activities. MSC from adult tissue have proven the capacity for in vitro tenogenic differentiation when exposed to BMP-12 factor. In MSC from fetal origin it has been reported that these cells have a greater proliferation and differentiation potential compared with MSC from adult sources. However, the potential for tenogenic differentiation of MSC derived from equine foetal BM has not been previously reported. The objective of the present study was to evaluate the in vitro tenogenic differentiation potential of MSC derived from equine fetal BM. Cells were seeded at a 23 x 105 cells/cm2 under the effects of three doses of BMP-12 (25, 50 and 100 ng/mL). The expression from tenogenic marker genes SCX, COL1α1, TNMD and DCN was evaluated at days 0 and 21. Cell morphology and relative expression of genes was evaluated at days 7, 14 and 21, as well an immunofluorescence evaluation of COL1α1 on day 21. No morphological differences were observed for both control and cells treated with BMP-12. The tenogenic marker TNMD was not detected in MSC. Levels of SCX decreased (P<0.05) on day 21 for both control and cells treated with 25, 50 and 100 ng/mL of BMP-12. In comparison, mRNA levels of COL1α1 were not different (P>0.05) in MSC control and treated with 25, 50 and 100 ng/mL of BMP-12. DCN relative expression levels increased (P<0.05) in MSC treated with 25 ng/mL of BMP-12. In the evaluation of the temporary effect, SCX levels decrease (P<0.05) on day 21 compared to day 0 on MSC treated with BMP-12. During the 21 days of culture, COL1α1 relative expression was not different (P>0.05) in MSC treated with BMP-12 versus the untreated control. DCN mRNA levels increased (P<0.05) on day 21 in MSC treated with BMP-12 compared to day 0. In conclusion, reduction in mRNA levels of SCX after BMP-12 treatment for 21 days may have prevented the activation of the TNMD gen and the increment of COL1α1 expression. The increase in expression of the tenogenic marker DCN in MSC treated with BMP-12 suggests that this 4 factor may have induced a progress in the differentiation process until an advanced state of tenogenic differentiation.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC, del inglés, Mesenchymal Stem Cells) son células progenitoras adultas capaces de diferenciarse hacia células de tejidos mesodérmicos y que además poseen potencial de auto-renovación y morfología fibroblastoide. Como parte de su capacidad de diferenciación multilinaje, estudios recientes han demostrado que las MSC cuentan con la capacidad de diferenciarse in vitro hacia linaje celular germinal. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial de diferenciación germinal de MSC derivadas de médula ósea fetales bovinas (MSC-MO) mediante exposición in vitro a los biofactores proteína morfogénica ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) y ácido retinoico (AR). Las MSC-MO fueron aisladas mediante adherencia a placas de cultivo de plástico desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=14). El efecto dosis-respuesta fue analizado luego de 21 días de cultivo utilizando tres concentraciones de BMP4 (10, 50, 100 ng/mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng/mL) y AR (0,01; 0,1 y 1 μM). El efecto temporal fue analizado en los días 0, 7, 14 y 21 de cultivo utilizando 100 ng/mL de BMP4, 100 ng/mL de TGFβ1 o 0,1 μM de AR. Se analizaron los genes de pluripotencia OCT4, NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, PIWIL2, STRA8 y el marcador de meiosis SCP3 mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La expresión de Dazl, Nanog y Oct4 fue analizada mediante citometría de flujo. El tratamiento con AR y BMP4 aumentó la expresión génica de DAZL (P<0,05) a partir del día 7. Sin embargo, el aumento bajo el efecto de BMP4 fue transitorio. TGFβ1 no modificó la expresión de mRNA de DAZL. La suplementación con AR activó la expresión de mRNA de NANOG a partir del día 7 hasta el día 21 de exposición, pero no se observaron cambios de expresión bajo el efecto de BMP4 durante el período de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 y de SCP3 no fueron modificados bajo el efecto de ninguno de los factores utilizados. En conclusión, AR fue el biofactor más efectivo en la diferenciación germinal de MSC-MO logrando el aumento de la expresión del gen germinal DAZL / Mesenchymal Stem Cells (MSC) are adult progenitor cells that possess self-renewal capacity and fibroblastoid morphology and are also capable of differentiating into cells of mesodermal tissues. In addition to the multilineage differentiation potential, recent studies have shown that MSCs can differentiate in vitro into germ cell lineage. The objective of the present study was to evaluate the potential for germ cell differentiation of MSCs derived from fetal bovine bone marrow (BM-MSC) by in vitro exposure to bioactive factors bone morhogenetic 4 (BMP4), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and retinoic acid (RA). BM-MSC were isolated by adherence to plastic culture plates from bone marrow of bovine fetuses (7-9 months gestation, n = 14). The dose-response effect of each factor was analyzed using three concentrations of BMP4 (10, 50, 100 ng / mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng / mL) and RA (0.01, 0.1 and 1 μM), after 21 days of culture. The temporal effect was analyzed on days 0, 7, 14 and 21 of culture using 100 ng/mL of BMP4, 100 ng/mL of TGFβ1 o 0,1 μM of RA. The pluripotency genes OCT4, NANOG, germ cell genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germ cell genes DAZL, PIWIL2, STRA8 and the meiosis marker SCP3 were analyzed by quantitative PCR (Q-PCR). The expression of Dazl, Nanog and Oct4 was analyzed by flow cytometry. Treatment with AR and BMP4 increased DAZL gene expression (P <0.05) from day 7, however the increase under the effect of BMP4 was transient. TGFβ1 did not modify the expression of DAZL mRNA. Supplementation with RA activated NANOG mRNA expression from day 7 to day 21 of exposure, but no expression changes were observed under the effect of BMP4 during the culture period. OCT4 mRNA levels are not modified under the effect of any of the factors as well as the SCP3 meiosis marker. In conclusion, AR was the most effective biofactor in the germ differentiation of BM-MSC achieving increased expression of the DAZL germline gene / Financiamiento: Proyecto Fondecyt N° 1161251 y Programa de becas “Convocatoria Abierta 2013” – SENESCYT, Ecuador

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC) pueden ser candidatas adecuadas para la derivación de gametos in vitro debido a su abundancia y a su alto potencial de diferenciación. La diferenciación de las células germinales es un proceso complejo que requiere tanto de regulación endocrina y auto-paracrina en un entorno específico, como de interacciones directas celulares proporcionadas por las células somáticas del testículo. Las células de Sertoli (CS) juegan un papel esencial formando nichos para las células germinales y proporcionando factores esenciales para su diferenciación. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del co-cultivo de CS en la diferenciación de MSC derivadas de tejido adiposo (MSC-TA) y medula ósea (MSC-MO) fetales bovinas hacia linaje de células germinales. Las CS fueron aisladas desde parénquima de testículo de toro adulto y fueron caracterizadas mediante cuantificación de la expresión del biomarcador de CS, Wilms tumor 1 (WT1) y de los niveles de mRNA de Receptor de Andrógeno (AR) utilizando citometría de flujo (FC) y PCR cuantitativo (Q-PCR). Las MSC fueron aisladas desde tejido adiposo y médula ósea mediante adherencia al plástico y posteriormente fueron co-cultivadas sobre monocapas de CS durante 21 días. Muestras de cultivos celulares fueron obtenidas cada 7 días y analizadas para determinación de niveles de mRNA de genes endógenos β-ACTINA y GAPDH, genes de pluripotencia OCT4 y NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, SRY, PIWIL2 y STRA8 mediante Q-PCR. Adicionalmente se evaluó la expresión de Dazl, Nanog y Oct4 mediante FC e IF. Una alta proporción (85,5%±5,5) de CS fueron positivas para WT1. Los niveles mRNA DAZL y PIWIL2 aumentaron el día 14 de diferenciación en co-cultivos de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos y co-cultivos de MSC-MO/CS. Los niveles de mRNA de NANOG fueron activados en MSC-MO y MSC-TA co-cultivadas con CS luego de 7 y 14 días de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 aumentaron (P<0,05) el día 14 en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos. Los niveles de mRNA de CD73 aumentaron (P<0,05) en los co-cultivos el día 21 en comparación con los monocultivos de MSC-MO y MSC-TA, mientras los niveles de mRNA de CD105 disminuyeron (P<0,05) en el co-cultivo de MSC-TA/CS al día 21en comparación con el monocultivos de MSC-TA. Adicionalmente, los niveles de mRNA de SCP3 disminuyeron (P<0,05) en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS el día 7 y 14 en comparación con el monocultivo de MSC-TA y no se detectó en el día 21. Los patrones de expresión génica en los co-cultivos sugieren que las MSC fetales bovinas poseen potencial de diferenciación germinal y que las MSC-TA fetales bovinas tienen mayor capacidad de diferenciación en comparación a las MSC-MO. Considerando la disminución en la expresión de SCP3 en los co-cultivos, estos resultados sugieren que las MSC alcanzaron un estado de diferenciación germinal premeiótico temprano / Mesenchymal stem cells (MSC) may be suitable candidates for in vitro gamete derivation due to their abundant source and wide differentiation potential. Germ cell differentiation requires endocrine and auto/paracrine regulation in a specific environment, as well as direct cell-to-cell interactions provided by the somatic cells of the testis. Sertoli cells (SC) play an essential role by forming niches and providing essential factors for germ cell differentiation. The aim of the present study was to evaluate the effect of co-culture of SC on the germ cell differentiation potential of bovine fetal MSC derived from adipose tissue (MSC-TA) and bone marrow (MSC-BM). Sertoli cells were isolated from bull testis parenchyma and characterized by quantification of biomarker wilms tumor 1 (WT1) expression and androgen receptor (AR) mRNA levels using flow-cytometry (FC) and quantitative-PCR (Q-PCR) analyses. bfMSC were isolated from adipose tissue and bone marrow and were co-cultured over monolayers of SC for 21 days. Cell culture samples were obtained every 7 days and analyzed for endogenous genes β-ACTIN y GAPDH, pluripotency genes OCT4 y NANOG, germinal genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germinal genes DAZL, SRY, PIWIL2 and STRA8 using Q-PCR. A high (P < 0.05) proportion of SC (85,5%±5,5) were positive for WT1 and expressed high levels of WT1 and AR mRNA levels. Levels of DAZL and PIWIL2 mRNA were up-regulated at day 14 of differentiation in bfMSC-SC co-cultures compared to monocultures and co-cultures of MSC-BM/CS. NANOG mRNA levels were activated in MSC-BM and MSC-TA co-cultured with SC at days 7 and 14 of culture. OCT4 mRNA levels increased (P <0.05) at day 14 in co-cultures of MSC-BM/CS and MSC-TA/CS compared to monocultures. CD73 mRNA levels increased (P <0.05) in the co-cultures at day 21. CD105 mRNA levels were decreased (P < 0.05) in the co-culture of MSC-TA/CS at day 21 of culture compared to monoculture of MSC-TA. SCP3 mRNA levels were down-regulated in the co-cultures of MSC-BM/CS and of MSC-TA/CS at 14 day compared to monoculture and were not detected at day 21. Thus, the gene expression patterns in MSC suggest that they have the potential for germinal differentiation and that bfMSC-TA have greater differentiation capacity towards germinal lineage in relation to MSC-BM. Moreover, reduction in SCP3 mRNA throughout the process of germinal differentiation suggest that MSC achieved an early premeiotic germ cell differentiation state / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1161251.

Las células madre mesenquimales (MSC) son un grupo heterogéneo de células multipotentes que pueden ser aisladas de distintos tejidos. Las MSC tienen propiedades inmunológicas únicas, que han hecho de éstas células un foco de interés en el campo de la terapia celular. Esta función inmunomoduladora de las MSC, fue descrita por primera vez en el año 2000 por Lietchty KW, pero los mecanismos mediante los cuales las MSCs ejercen dicha función inmunomoduladora son, todavía, desconocidos. El contacto célula-célula o la liberación de factores solubles pueden ejercer un papel esencial. En cuanto a la terapia celular con MSCs, el primer ensayo clínico fue en 1995 y, desde ese momento, el número de ensayos ha ido en aumento, hasta que, a día de hoy, hay en curso más de 200 ensayos clínicos para distintas enfermedades. No obstante, debido al bajo número de pacientes tratados, no se ha podido establecer una conclusión definitiva de la seguridad del tratamiento con dichas células. Por otro lado, la mayoría de los trabajos publicados relacionados con MSCs, son trabajos en los cuales se han utilizado poblaciones heterogéneas de MSCs y no poblaciones homogéneas clonogénicas. Publicaciones recientes han demostrado la capacidad de las MSCs para aumentar in vitro la frecuencia de células Treg, postulándose que éste puede ser precisamente uno de los principales mecanismos responsables de la inmunomodulación ejercida por las MSCs. Ello podría tener importantes implicaciones clínicas, tanto en el campo de los alotransplantes, para tratar el rechazo inmunológico mediante el establecimiento o inducción del proceso de tolerancia inmunológica, como en patologías autoinflamatorias/ autoinmunes, al reestablecer la tolerancia inmunológica perdida; e incluso, permitiría reducir la dosis de los fármacos inmunosupresores habitualmente utilizados en estas enfermedades, con la consiguiente disminución de efectos secundarios. En este trabajo se lleva a cabo el estudio de comparación de cinco clones de MSC derivados de tejido adiposo. En dicho se han comparado marcadores de membrana, perfiles de citocinas, capacidad para inhibir las distintas poblaciones del Sistema Inmunitario, así como su efecto sobre la población Treg. Además, se realizaron ensayos para determinar el efecto sobre la viabilidad de linfocitos. La conclusión final de este trabajo es, brevemente, que los distintos clones poseen capacidades diferentes de inmunomodulación, a todos los niveles. Estas diferencias pueden ser aprovechadas en pro de una optimización de los protocolos de terapia celular con el objetivo último de realizar las mismas de una forma más eficaz, personalizada y reproducible.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimales (CMM) son células indiferenciadas con alta capacidad proliferativa y de diferenciación multipotente hacia líneas celulares mesodérmicas que incluyen osteocitos, condrocitos y adipocitos. Estudios recientes indican que las CMM poseen adicionalmente capacidad de diferenciación hacia linajes celulares no mesodérmicos como el hepatogénico. El objetivo del presente estudio fue inducir diferenciación in vitro hepatogénica de CMM aisladas desde médula ósea fetal bovina. Las CMM fueron aisladas en base a su adherencia al plástico desde médula ósea aspirada desde fetos bovinos (n=3) y posteriormente cultivadas in vitro bajo condiciones hepatogénicas por un periodo de 28 días. Durante este periodo se analizó la expresión de los genes hepato-específicos Albúmina (ALB) y α-Fetoproteína (α-FP), de pluripotencia NANOG y la producción de metabolitos hepáticos Glicógeno, Urea y Albúmina. El análisis por PCR cuantitativo (Q-PCR) permitió detectar un aumento (P<0,05) en la expresión de ALB y α-FP (331 y 60 veces el valor del día 0, respectivamente) en CMM diferenciadas el día 28 de cultivo. En esta etapa también se detectaron mayores (P<0,05) niveles de Albúmina (1213 versus 232,9 µg/ml del control) y Urea (8,2 versus 5,5 mg/dl del control) en cultivos de CMM diferenciadas. La presencia de la proteína α-FP y de Glicógeno también fue detectada en estas células. Estos resultados indican que las CMM aisladas desde médula ósea fetal bovina poseen potencial de diferenciación hepatogénico bajo condiciones in vitro / Financiamiento: Proyecto Fondecyt N° 11100205

La terapia celular es una novedosa y prometedora herramienta para la medicina futura, que nos permite reparar, reemplaza o restaurar tejidos u órganos dañados usando una variedad de tipos celulares. Este tipo de terapia requiere un gran número de células en animales grandes o grandes lesiones, y este requisito es uno de los principales obstáculos a la hora de llevar a cabo dichas aplicaciones. Las células mesenquimales estromales de tejido adiposo (hAMSC) son excelentes candidatas para hacer terapia celular. La necesidad de expandirlas en cultivo para obtener el número adecuado de células, requiere de tiempos de cultivo en algunos casos crítico para ciertas aplicaciones. El tiempo de duplicación medio de las hAMSC puede variar entre 2-6 dias, dependiendo de las condiciones de cultivo. En condiciones estándar, se requiere aproximadamente 75 días de cultivo para generar 1010 células. En esta tesis, se han probado condiciones de cultivo que mejoran la producción de grandes números de hAMSC. Se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las hAMSC crecidas en su medio estándar DMEM, respecto a las hAMSC crecidas en EGM-2 (FP-MSC, fast proliferating MSCs). De forma reproducible, el medio EGM-2 confiere a las hAMSCs un fenotipo de gran capacidad proliferativa, lo cual nos permite reducir el tiempo requerido para obtener grandes cantidades de células seguras, sin perder sus propiedades de pluripotencialidad. Este trabajo recoge un extenso análisis comparativo en ambas condiciones de cultivo, que incluye estudios a nivel de proliferación in vitro, paramétros relacionados con las propiedades mesenquimaloides (perfil inmunofenotípico y capacidad de diferenciación a diferentes linajes), perfil de expresión génica y potencial oncogénico. Los datos recogidos de la experimentación in vitro, apuntan a estas células como una alternativa en el uso de hAMSC en terapias celulares. Las FP-MSC fueron probadas en dos tipos de terapias: anti-tumoral y regenerativa. La terapia anti-tumoral mediada por las FP-MSC portadoras de un gen suicida, no produjo ninguna mejora con respecto a las hAMSC crecidas en su medio estándar. Sin embargo, en el ámbito de la regeneración cardiaca, las FP-MSC mostraron una sutil mejora con respecto a las hAMSC. Ambos tipos celulares fueron capaces de diferenciarse al linaje endotelial y miocárdico, sin embargo, a nivel de función cardiaca las FP-MSC tiende a presentar ciertas mejoras en lo que se refiere a densidad vascular y fracción de eyección en comparación con las hAMSC. Si a esto, le sumamos sus características in vitro asociadas al crecimiento en EGM-2, podemos decir que estas células parecen una interesante y novedosa opción para el tratamiento en la regeneración de tejidos dañados. Podemos decir que se abre un amplio campo donde poder aplicarlas, ya que podemos obtener grandes cantidades de células autólogas para tratamientos terapéutico en un periodo de tiempo muy breve; pudiéndolas utilizar como sustitutas de las hAMSC u otro tipo de mesenquimal, o en combinación con otro tipo celular para tener un efecto sinérgico, y mejorar el resultado terapéutico. / Cell therapy is emerging as a promising strategy for future medicine, to repair, replace or restore damaged tissues or organs using a variety of cell sources. Adipose tissue is an important source of adult multipotent stem cells (AMSCs) due to their abundance and ease of isolation with relatively little trauma for the patient, and their similarity to those of their bone marrow counterparts. However, to obtain reasonable numbers of AMSCs for tissue engineering applications, in particular for regeneration in large animals or for large lesions; ex vivo expansion of AMSCs is required. AMSCs have a doubling time that could vary between 2-6 days depending on culture conditions. In standard culture conditions, approximately 75 days would be required to generate 1010 cells, a prohibitive delay for some therapeutic processes. In the current work we perform a comparative study of DMEM grown AMSCs with EGM-2 grown fast proliferating AMSCs (FP-MSCs). By using a reproducible and reliable methodology, this culture medium allowed us to reduce the time required to obtain large numbers of safe cells without losing their pluripotent properties. We have analysed in both culture conditions the parameters that characterize MSCs (specific immunophenotype and multilineage differentiation), as well as proliferative capacity, genetic stability, gene expression profile, oncogenic potential. Moreover, we also compared their capacity as a therapeutic agent against tumors and for myocardium repair. Our results indicate that paracrine effects of FP-MSCs applied in combination with scaffolds over acute myocardium infarcts may promote myocardium revascularization.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales. / Las células madre mesenquimales (CMM) son células progenitoras multipotentes que poseen potenciales de auto-renovación y diferenciación multilinaje (osteogénico, condrogénico y adipogénico). La capacidad de diferenciación de las CMM se extiende principalmente hacia linajes mesodérmicos como osteogénico, condrogénico y adipogénico; sin embargo, estudios recientes in vitro han demostrado que las CMM poseen capacidad para diferenciarse hacia tejidos ectodérmicos como el neuronal. El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad de diferenciación neurogénica in vitro de CMM bovinas aislada desde medula ósea (MO) fetal. La detección de marcadores mesenquimales CD90, CD105 y CD73, hematopoyéticos CD34 y CD45 y de pluripotencia OCT4 y NANOG fue realizada por medio de PCR-cuantitativo (Q-PCR) y citometría de flujo. El protocolo 1 de diferenciación neurogénica consistió en una pre-inducción neuronal por 24 horas con medio DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino (SFB) y una posterior inducción neuronal con Betamercaptoetanol (BME) durante 6 días. El protocolo 2 de diferenciación neurogénica consistió en medio DMEM suplementado con Fibroblast Growth Factor-basic (bFGF), Epidermal Growth Factor (EGF) durante 24 horas y posteriormente durante 120 horas con medio de cultivo suplementado con hidroxianisol butilado (BHA), cloruro de potasio, ácido valproico, forskolina y suplemento neuronal. Muestras celulares fueron obtenidas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo. La expresión de genes fue evaluada por Q-PCR e inmunofluorescencia. Los análisis de Q-PCR en CMM indiferenciadas, detectaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimaticos CD73, CD90 y CD105 en relación a los niveles de CD34 (151.2, 245.1 y 238.1 veces, respectivamente). Mediante citometría de flujo se determinó una alta proporción de CMM positivas para marcadores mesenquimáticos CD29 (76,3%), CD73 (96,8%) y marcadores de pluripotencia Oct4 (94,6%) y Nanog (88,4%). En contraste, una alta proporción de CMM fue negativa para marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45 (93,4% y 95,6%, respectivamente). Durante el el protocolo 1 de diferenciación neuronal se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,7; 2 y 1 veces expresión de la hora 0). En comparación, los niveles de mRNA de MAP2 aumentaron (P<0,05) a las 24, 96 y 144 horas (2,4; 18,9 y 16 veces expresión de la hora 0). Los niveles de mRNA de TRKA aumentaron (P<0,05) a las 96 y 144 horas (6,6 y 8 veces expresión de la hora 0). En tanto los niveles de mRNA de NGF y de NANOG no fueron distintos entre el grupo control y diferenciación. Durante el protocolo 2 se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,74; 0,3; 0,1 veces expresión de la hora 0). En comparación, la expresión de MAP2 aumentó (P<0,05) a las 96 y 144 horas (4,1; 22,8 veces expresión de la hora 0). Asimismo, los niveles de TRKA aumentaron (P<0,05) luego de 96 y 144 horas (51,3; 111,7 veces expresión de la hora 0) de diferenciación. Además, NGF presento un menor nivel de expresión en las CMM diferenciadas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo (1; 0,8; 16,2 y 17,4 veces la expresión de la hora 0), en comparación con el control (1; 5,8; 47,8 y 25,7 veces la expresión de la hora 0), respectivamente. El perfil de expresión relativa de genes obtenido en el protocolo 2 es concordante con el obtenido en el ensayo de inmunoflorescencia asociada a NESTIN, MAP2, TRKA y PrPC. A pesar de que las CMM expuestas a BME presentan cambios morfológicos similares a un perfil neuronal, los valores de expresión génica no indican la adopción de un fenotipo neurogénico. Como ha sido reportado previamente, estos cambios pueden deberse a efectos citotóxicos del BME más que a inducción neurogénica. Sin embargo, el protocolo 2 utilizado en este estudio indujo cambios morfológicos y un perfil de expresión génica asociado a diferenciación neurogénica. En conclusión, las CMM de origen fetal bovino indiferenciadas poseen mayoritariamente un perfil mesenquimático y bajo condiciones de cultivo in vitro adecuadas poseen un potencial de diferenciación neurogénica. / Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent progenitor cells that possess the potential for self-renewal and multilineage differentiation (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Despite MSC have been isolated from several tissues, the most common source of isolation is the bone marrow (BM), both for clinical and research purposes. The differentiation capacity of MSC extends primarily to mesodermal lineages; however, recent studies have shown that MSC have also the potential to differentiate into ectodermal cell types such as neuronal. The aim of this study was to determine the potential for in vitro neurogenic differentiation of MSC isolated from fetal bovine BM. Detection of mesenchymal markers CD90, CD105 and CD73, hematopoietic markers CD34 and CD45 was performed by Quantitative-PCR (Q-PCR) and flow cytometry. Protocol 1 of neurogenic differentiation consisted in pre-induction for 24 hours with DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS), and induction with beta-mercaptoethanol (BME) for 6 days. Protocol 2 of neurogenic differentiation consisted in culture of MSC in DMEM supplemented with Fibroblast Growth Factor-basic (FGFb) and Epidermal Growth Factor (EGF) for 24 hours, followed by culture in DMEM supplemented with butylated hydroxyanisole, KCl, valproic acid, forskolin, neural supplement for 120 hours. Cell samples were taken at 0, 24, 96 and 144 hours of culture. Analyses indicated that mRNA levels of mesenchymal markers CD73, CD90 and CD105 were higher (151.2, 245.1 and 238.1 fold, respectively; P <0.05) relative to CD34. Moreover, flow cytometry detected a high proportion of MSC positive for mesenchymal markers CD29 (76.3%), CD73 (96.8%), pluripotent markers Oct4 (94.6%) and Nanog (88.4%). In contrast, high proportion of MSC were negative to hematopoietic markers CD34 and CD45 (93.4% and 95.6%, respectively). During protocol 1 of neuronal differentiation, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3,7; 2 and 1 fold 0 hours). In contrast, levels of mRNA of MAP2 increased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (2,4; 18,9 and 16 fold 0 hours). Similarly, levels of TRKA mRNA increased (P<0.05) at 96 and 144 hours (6,6 and 8 fold 0 hours). NGF and NANOG mRNA levels were not significantly different between treatments. During protocol 2, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3.74, 0.3, 0.1 fold 0 hours). In comparison, MAP2 mRNA levels increased (P <0.05) at 96 and 144 hours (4,1; 22,8 fold 0 hours). In addition, NGF mRNA levels were lower (P<0,05) in differentiated MSC at 0, 24, 96 and 144 hours of culture (1; 0.8; 16.2 and 17.4 fold the expression at 0 hours) compared to control (1; 5.8; 47.8 and 25.7 fold 0 hours). The gene relative expression values in differentiated MSC were consistent with immunofluorescence patterns. Although BME induced neuron-like changes in MSC morphology, gene expression profiles showed no indication of the adoption of a neurogenic phenotype. As reported before, BME-induced morphological changes may be due to cytotoxic effects rather than neurogenic induction. However, the second protocol induced morphologic changes and a gene expression pattern associated to neurogenic differentiation. In conclusion, undifferentiated MSC isolated from fetal bovine BM possess a mesenchymal profile and under adequate in vitro culture conditions may be induced into neurogenic differentiation. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11100205.

[ES] Actualmente la insuficiencia cardiaca es una de las principales causas de mortalidad y co-morbilidad a nivel mundial sobre todo en países desarrollados. Este tipo de patología a su vez, se desglosa en un gran abanico de posibles agentes que perturban el funcionamiento del músculo cardiaco en función de su causa. Uno de los problemas más importantes a niveles de afectación cardiaca se centra en pacientes que sufren algún tipo de cáncer y son tratados con antraciclinas. Estas drogas ampliamente usadas en el mundo de la oncología, tienen una serie de efectos secundarios entre los cuales destaca su posible efecto cardiotóxico. Este trabajo ahonda sobre este proceso y sobre la existencia de un perfil de paciente con una susceptibilidad a sufrir este tipo de episodios de toxicidad cardiaca. En este sentido, se investiga una serie de miRNAs que se encuentran diferencialmente expresados en pacientes que sufren este tipo de episodios frente a los que no. Una vez se detectan estos miRNA generamos un algoritmo predictor mediante el cual somos capaces de predecir si un paciente sufrirá cardiotoxicidad en función de la cantidad de ciertos miRNAs presentes en suero. Una vez descubiertos estos miRNAs nos centramos en la búsqueda de una posible opción terapéutica para esta serie de eventos. Para ello usamos las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células mesenquimales estromales (MSC), unas células que han demostrado tener un alto potencial terapéutico y de gran seguridad. Se evaluó su capacidad terapéutica en el daño inducido por doxorrubicina y posteriormente se amplió el estudio añadiendo el daño por isquemia reperfusión en diferentes frentes como puede ser la regeneración cardiaca, inhibición de la fibrosis o neoangiogénesis. Aunque es necesario un estudio más exhaustivo de los perfiles de cardiotoxicidad y de los mecanismos de acción tanto de los miRNAs como de las EVs, esta tesis demuestra la capacidad de ambos como una potente herramienta tanto de diagnóstico como terapéutica. / [CA] Actualment la insuficiència cardíaca és un dels principals causes de mortalitat i co-morbiditat a nivell mundial sobretot en països desenvolupats. Aquest tipus de patologia al seu torn, es desglossa en un gran ventall de possibles agents que pertorben el funcionament de l'múscul cardíac en funció de la seva causa. Un dels problemes més importants a nivells d'afectació cardíaca se centra en pacients que pateixen algun tipus de càncer i són tractats amb antraciclines. Aquestes drogues àmpliament usades en el món de l'oncologia, tenen una sèrie d'efectes secundaris entre els quals destaca el seu possible efecte cardiotòxic. Aquest treball aprofundeix sobre aquest succés i sobre ha un perfil de pacient amb una susceptibilitat a patir aquest tipus d'episodis de toxicitat cardíaca. En aquest sentit s'investiga una sèrie de miRNAs que es troben diferencialment expressats en pacients que pateixen aquest tipus d'episodis enfront dels que no. Un cop es detecten aquests miRNA generem un algoritme predictiu mitjançant el qual, som capaços de predir si un pacient patirà cardiotoxicitat en funció de la quantitat de certs miRNAs presents en sèrum. Un cop descoberts aquests miRNAs ens centrem en la recerca d'una possible opció terapèutica per a aquesta sèrie d'esdeveniments. Per a això fem servir les vesícules extracelulres derivades de cèl·lules mesesnquimales, unes cèl·lules que han demostrat tenir un alt potencial terapèutico i de gran seguretat. Es testen la seva capacitat terapèutica en el dany per doxurbicina i posteriorment s'amplia l'estudi afegint el dany per isquèmia reperfusió en diferents fronts com pot ser la regeneració cardíaca, inhibició de la fibrosi o neoangiogènesi. Encara que és necessari un estudi més exhaustiu dels perfils de cardiotoxicitat i dels mecanismes d'acció tant dels miRNAs com de les EVs, aquesta tesi demostra la capacitat de tots dos com una potent eina tant de diagnòstic com terapèutica. / [EN] Heart failure is currently one of the main causes of mortality and co-morbidity worldwide, especially in developed countries. This type of pathology, can be broken down into a wide range of possible agents that disturb the functioning of the cardiac muscle depending on its cause. One of the most important problems in terms of cardiac involvement is centered on patients who suffer from some type of cancer and are treated with anthracyclines. These drugs, widely used in the world of oncology, have a series of side effects, among which their possible cardiotoxic effect stands out. This work delves into this event and into the existence of a patient profile with a susceptibility to suffer this type of episodes of cardiac toxicity. In this sense, we investigate a series of miRNAs that are differentially expressed in patients who suffer this type of episodes versus those who do not. Once these miRNAs were detected, we generated a predictive algorithm by which we are able to predict whether a patient will suffer cardiotoxicity based on the amount of certain miRNAs present in serum. Once these miRNAs were discovered, we focused on the search for a possible therapeutic option for this series of events. For this we used extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal cells (MSC), cells that have been shown to have a high therapeutic potential and high safety. We tested their therapeutic capacity in doxorubicin injury and later extended the study by adding ischemia reperfusion injury on different fronts such as cardiac regeneration, inhibition of fibrosis or neoangiogenesis. Although a more exhaustive study of the cardiotoxicity profiles and mechanisms of action of both miRNAs and EVs is needed, this thesis demonstrates the capacity of both as a powerful diagnostic and therapeutic tool. / Sánchez Sánchez, R. (2021). Estudio del papel de los miRNAs y las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales en la patología cardiaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177178 / TESIS