Memoria para optar al título profesional de Ingeniera Agrónoma Mención Fitotecnia / Con el objeto de evaluar el efecto en el crecimiento y desarrollo de plantines de tomate “María Italia” al utilizar sustratos enriquecidos con rizobacterias, se realizó una investigación en la plantinera Eco-plantas Ltda. ubicada en la comuna de Malloco, Región Metropolitana, durante la producción invernal del año 2009. El estudio consideró un diseño experimental de parcelas divididas completamente al azar. Para ello se establecieron 2 parcelas principales correspondientes a 2 sustratos a base de turba y perlita, uno con compost y el otro sin compost y 4 sub-parcelas correspondientes una a la inoculación con Bacillus subtilis; otra inoculada con Pseudomonas fluorescens, una tercera sub-parcela inoculada con ambas bacterias más Trichoderma harzianum, Notocarda, levaduras y extracto de alga (Bioroot®) y finalmente una subparcela testigo sin inocular. Todo esto dentro de un universo muestral de 12 bandejas alveoladas de 286 celdas, cada bandeja conformada por los 4 tratamientos, con un total de 6 repeticiones por cada sustrato. Previo a la siembra se caracterizaron en todos los tratamientos los siguientes parámetros: pH, conductividad eléctrica, toxicidad, densidad aparente y real y porosidad. Desde mayo a julio del año 2009 se llevó un registro de los estados de desarrollo: emergencia, cotiledón expandido, primera a tercera hoja verdadera. Una vez finalizada la etapa de plantín a tercera hoja verdadera, se evaluó peso fresco y seco (aéreo y radical), diámetro de tallo, largo foliar y radical, área foliar y radical, volumen radical y bifurcaciones radicales. De los resultados obtenidos se observó que el enriquecimiento de sustratos con rizobacterias estimuló el crecimiento de plantines de tomate, no así el desarrollo de éstos. Los plantines del sustrato sin compost presentaron un mayor crecimiento que aquellos con compost. Sin embargo, no se presentaron diferencias significativas en el desarrollo final de los plantines. De las rizobacterias empleadas, el sustrato inoculado con el conjunto de Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum, Notocarda, levaduras y extracto de alga fue el que presentó el mayor crecimiento total al final del período de plantín. / In order to evaluate the effect on growth and development of "María Italia" tomato seedlings when using rhizobacteria enriched substrates, an investigation was conducted in “Eco-plantas Ltd.” nursery, located in Malloco district, región Metropolitana, during 2009 winter production. The experiment consisted of a split-plot experimental design completely random. This two main plots were established with two substrates based on peat and perlite, one with and one without compost and four sub-plots, one with inoculation of Bacillus subtilis, another with Pseudomonas fluorescens, a third sub-plot inoculated with Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum, Notocarda, yeast and seaweed extract and a last control sub-plot without inoculation. All this within a universe of 12 trays dimpled sample of 286 cells, each tray formed by the four treatments, with a total of six repetitions for each substrate. Before planting, all treatments were characterized for pH, electrical conductivity, toxicity, apparent and real density and porosity. From May to July 2009 the developmental stages were recorded: emergency, expanded cotyledon, first, second and third true leaf of tomato seedlings. Once the third true leaf was obtained, foliar and root fresh and dry weight, stem diameter, foliar and root length, leaf and root area, root volume and forks were evaluated The results obtained showed that the enrichment of substrates with rhizobacteria stimulated the growth of tomato seedlings, but didn`t develop them. The seedlings of the substrate without compost had higher growth than those with compost. However, there were no significant differences in the final development of seedlings. From the used rhizobacteria, the substrate inoculated with the set of Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum, Notocarda, yeasts and seaweed extract was the one who had the highest overall growth at the end of the seedling period.

Para mejorar la eficiencia de regeneración en dos variedades africanas de camote (Tanzania y Wagabolige) se probó un protocolo vía organogénesis de dos fases en Tanzania y de dos, tres y cuatro fases en Wagabolige. La primera fase, en ambas variedades, consistió en el mantenimiento de los explantes en un medio con auxinas y las siguientes, con citoquininas. Se probó tres tipos de explantes: hojas con peciolo, peciolos y raíces. Todos los regenerantes fueron obtenidos a partir de hojas con peciolo. Los brotes emergentes fueron de apariencia normal y anormal. Se logró resultados favorables al trabajar con bajas concentraciones de 2,4-D y en Tanzania, al suplementar AG3 a la primera etapa, se incrementó la frecuencia de regeneración de brotes normales; sin embargo, ambas variedades presentaron un bajo índice de regeneración: 3.33% en Tanzania y 1.46% en Wagabolige.To improve the regeneration efficiency of two sweetpotato African varieties (Tanzania and Wagabolige), a two-stage organogenesis regeneration protocol was tested in Tanzania; while a two, three, four-stages was tested in Wagabolige. The first stage, in both varieties, maintained the explants in a medium supplemented with auxines, and the next stages, with cytokinines. Three different explants were tested: leaves with petiole, petioles and roots. All shoots came from leaves with petioles. Shoots presented normal or anomalous morphology. The best results were obtained working with low concentrantions of 2,4-D. For Tanzania, the addition of GA3 in the first stage was found to increase normal shoot frequency, nevertheless both varieties showed low regeneration efficiencies: 3.33% in Tanzania, and 1.46% in Wagabolige.

La terapia celular es una novedosa y prometedora herramienta para la medicina futura, que nos permite reparar, reemplaza o restaurar tejidos u órganos dañados usando una variedad de tipos celulares. Este tipo de terapia requiere un gran número de células en animales grandes o grandes lesiones, y este requisito es uno de los principales obstáculos a la hora de llevar a cabo dichas aplicaciones. Las células mesenquimales estromales de tejido adiposo (hAMSC) son excelentes candidatas para hacer terapia celular. La necesidad de expandirlas en cultivo para obtener el número adecuado de células, requiere de tiempos de cultivo en algunos casos crítico para ciertas aplicaciones. El tiempo de duplicación medio de las hAMSC puede variar entre 2-6 dias, dependiendo de las condiciones de cultivo. En condiciones estándar, se requiere aproximadamente 75 días de cultivo para generar 1010 células. En esta tesis, se han probado condiciones de cultivo que mejoran la producción de grandes números de hAMSC. Se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las hAMSC crecidas en su medio estándar DMEM, respecto a las hAMSC crecidas en EGM-2 (FP-MSC, fast proliferating MSCs). De forma reproducible, el medio EGM-2 confiere a las hAMSCs un fenotipo de gran capacidad proliferativa, lo cual nos permite reducir el tiempo requerido para obtener grandes cantidades de células seguras, sin perder sus propiedades de pluripotencialidad. Este trabajo recoge un extenso análisis comparativo en ambas condiciones de cultivo, que incluye estudios a nivel de proliferación in vitro, paramétros relacionados con las propiedades mesenquimaloides (perfil inmunofenotípico y capacidad de diferenciación a diferentes linajes), perfil de expresión génica y potencial oncogénico. Los datos recogidos de la experimentación in vitro, apuntan a estas células como una alternativa en el uso de hAMSC en terapias celulares. Las FP-MSC fueron probadas en dos tipos de terapias: anti-tumoral y regenerativa. La terapia anti-tumoral mediada por las FP-MSC portadoras de un gen suicida, no produjo ninguna mejora con respecto a las hAMSC crecidas en su medio estándar. Sin embargo, en el ámbito de la regeneración cardiaca, las FP-MSC mostraron una sutil mejora con respecto a las hAMSC. Ambos tipos celulares fueron capaces de diferenciarse al linaje endotelial y miocárdico, sin embargo, a nivel de función cardiaca las FP-MSC tiende a presentar ciertas mejoras en lo que se refiere a densidad vascular y fracción de eyección en comparación con las hAMSC. Si a esto, le sumamos sus características in vitro asociadas al crecimiento en EGM-2, podemos decir que estas células parecen una interesante y novedosa opción para el tratamiento en la regeneración de tejidos dañados. Podemos decir que se abre un amplio campo donde poder aplicarlas, ya que podemos obtener grandes cantidades de células autólogas para tratamientos terapéutico en un periodo de tiempo muy breve; pudiéndolas utilizar como sustitutas de las hAMSC u otro tipo de mesenquimal, o en combinación con otro tipo celular para tener un efecto sinérgico, y mejorar el resultado terapéutico. / Cell therapy is emerging as a promising strategy for future medicine, to repair, replace or restore damaged tissues or organs using a variety of cell sources. Adipose tissue is an important source of adult multipotent stem cells (AMSCs) due to their abundance and ease of isolation with relatively little trauma for the patient, and their similarity to those of their bone marrow counterparts. However, to obtain reasonable numbers of AMSCs for tissue engineering applications, in particular for regeneration in large animals or for large lesions; ex vivo expansion of AMSCs is required. AMSCs have a doubling time that could vary between 2-6 days depending on culture conditions. In standard culture conditions, approximately 75 days would be required to generate 1010 cells, a prohibitive delay for some therapeutic processes. In the current work we perform a comparative study of DMEM grown AMSCs with EGM-2 grown fast proliferating AMSCs (FP-MSCs). By using a reproducible and reliable methodology, this culture medium allowed us to reduce the time required to obtain large numbers of safe cells without losing their pluripotent properties. We have analysed in both culture conditions the parameters that characterize MSCs (specific immunophenotype and multilineage differentiation), as well as proliferative capacity, genetic stability, gene expression profile, oncogenic potential. Moreover, we also compared their capacity as a therapeutic agent against tumors and for myocardium repair. Our results indicate that paracrine effects of FP-MSCs applied in combination with scaffolds over acute myocardium infarcts may promote myocardium revascularization.

Autorizada por el autor para ser publicada a texto completo a contar de noviembre de 2011 / La producción de proteínas recombinantes utilizando células animales es un proceso clave en la elaboración de productos terapéuticos de uso mundial. Para optimizar este proceso se debe tomar en cuenta una serie de factores como la línea celular utilizada, los vectores de expresión de la proteína recombinante y el medio de cultivo. Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la optimización del medio de cultivo de células embrionarias de riñón humano (HEK-293) para la producción de un anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral (TNF-α). La estrategia general de trabajo consistió en transfectar células HEK-293 con un vector de expresión, que codifica para las cadenas liviana y pesada de un anticuerpo anti-TNF-α. Utilizando diluciones al límite de las células transfectadas, se seleccionaron seis clones productores del anticuerpo. Estos clones fueron caracterizados durante 7 días de cultivo en un medio DMEM/F12 y posteriormente en un medio mejorado, ambos con 10% de suero fetal bovino (SFB). La velocidad máxima de crecimiento en el medio mejorado fue de 0,033 hrs-1 con una máxima densidad celular de 19x106 cel/ml, siendo ésta siete veces mayor que la alcanzada en el medio DMEM/F12. Además, la producción de anticuerpo en este medio fue 1,07 unidades de absorbancia [405 nm], un 200% mayor que en el medio DMEM/F12. Utilizando un análisis factorial se obtuvo un clon capaz de crecer en estas condiciones usando una concentración de 3 mg/l de dexametasona. Este cultivo tuvo una máxima densidad celular de 2,8x106 cel/ml, una velocidad máxima de crecimiento de 0,018 hrs-1 y una producción de anticuerpo de 0,33 unidades de absorbancia. Para este clon, se obtuvieron disminuciones de un 38 y 70% en la densidad celular y producción de anticuerpo respectivamente, comparados con el medio con 10% de SFB. Finalmente se obtuvo una adaptación parcial a un crecimiento en suspensión. Este cultivo tuvo una máxima densidad celular de 0,48x106 cel/ml, una velocidad máxima de crecimiento de 0,01 hrs-1 y una producción de anticuerpo de 0,166 unidades de absorbancia. Se calcularon las tasas específicas de consumo de glucosa y producción de lactato para los crecimientos antes descritos. Se observó que las células en presencia de suero utilizan menos glucosa como fuente de energía, generando menos lactato en el medio de cultivo. Además, las células en suspensión tienen mayores tasas específicas de consumo de glucosa y producción de lactato, comparado con células en adherencia en un medio libre de suero y son capaces de utilizar lactato como fuente de carbono. Con el propósito de aumentar la producción del anticuerpo recombinante se utilizaron distintos suplementos en el medio de cultivo como ácido linoleico, insulina, extractos de levadura, sulfato de zinc, butirato de sodio y ácido valproico. Este último resultó fundamental para la producción del anticuerpo, aumentando en alrededor de un 90% la expresión en células adheridas. En conclusión, se obtuvo información del estado de las células en distintas fases de cultivo, generando una mayor comprensión del estado metabólico de células HEK-293 al generar un anticuerpo recombinante.

La vid es un cultivo de propagación vegetativa y de gran importancia económica cuyo cultivo se distribuye mundialmente por zonas templadas. Su producción va destinada principalmente a la elaboración de vino, seguido de la producción de uva de mesa. Aunque existen miles de variedades, una decena de ellas son las que se utilizan mayoritariamente a nivel mundial lo que conlleva a una pérdida de variabilidad. Desde la llegada de la filoxera, el cultivo de la vid se realiza mediante injerto en pies resistentes a este áfido. Según la Comisión Directiva 2005/43/EC el material de propagación de vid debe estar libre de los siguientes virus: GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV y ArMV. En este trabajo se han evaluado y desarrollado distintas metodologías relacionadas con el cultivo in vitro de plantas encaminadas al saneamiento, multiplicación y conservación de germoplasma de vid. La conservación de variedades de vid in vitro es muy importante para complementar la conservación de germoplasma de las colecciones de campo. Para ello es importante seleccionar el material a conservar, determinar su estado sanitario, sanear si es el caso y establecer las condiciones adecuadas para su conservación. En un primer capítulo de esta tesis (Capítulo 1) se describen los ensayos realizados para inducir la embriogénesis somática en 16 variedades de vid que incluyen seis variedades infectadas con los virus GFLV, GLRaV-3 y GFkV. La embriogénesis somática ha sido descrita en vid como una metodología útil para el saneamiento de plantas infectadas con virus y es la vía común de regeneración adventicia.. En este trabajo se utiliza como material de partida semillas cortadas y se han obtenido plantas libres de virus y porcentajes de regeneración elevados en todas las variedades evaluadas. La utilización de marcadores microsatélites nos ha servido para seleccionar entre las plantas regeneradas aquellas que muestran el mismo genotipo que las plantas de partida. Por otra parte, en este trabajo se ha desarrollado un protocolo de micropropagación a partir de planta sana de la variedad 'Monastrell' cultivada in vitro obteniéndose tasas de multiplicación elevadas y plantas que se han aclimatado a condiciones de campo (Capítulo 2). El medio de cultivo MW, utilizado para el desarrollo de las plantas, se ha evaluado en otras 16 variedades y también se ha comparado el crecimiento en este medio y en variaciones de éste, como son la disminución de la concentración de azúcar a la mitad y la eliminación del ácido indolbutírico. La finalidad de estos ensayos ha sido determinar para cada variedad qué condiciones son las más adecuadas para mantener el germoplasma vegetal en cultivo in vitro activo, pero alargando el tiempo entre subcultivos optimizando costes (Capítulo 3). En el Capítulo 4 se incluye un trabajo para localizar, identificar, descartar o detectar la presencia de los virus anteriormente comentados, sanear si es el caso, y conservar in vitro las variedades de interés en las que se lleva a cabo una identificación utilizando marcadores SSR y un análisis de variabilidad genética cuando se dispone de varias accesiones. A modo de ejemplo, en este trabajo se publica el perfil de marcadores microsatélites para dos de las variedades colectadas y/o conservadas, la variedad 'Esclafacherre' ('Esclafagerres') y accesiones de 'Valencí Blanc' en las que se ha detectado diferencias para el marcador VVMD32 que agrupa las accesiones de Alicante por una parte, y al resto de accesiones por otra. También se ha validado un protocolo de crioconservación en la variedad 'Esclafacherre'. Por último, el Capítulo 5 hace referencia a un estudio llevado a cabo para determinar el estado actual de la aplicación de la transformación genética en vid, centrándonos en los factores limitantes de las metodologías empleadas. La transformación genética es una herramienta de gran potencial para la mejora de los cultivos, principalmente en plantas de p / Grapevine is a crop of vegetative propagation with great economical importance which is distributed worldwide in temperate zones. It is mainly used for wine and table grape production. Despite the fact thousands of varieties exist only few are commonly used, producing a loss of variability. Since the arrival of the phylloxera aphid the grapevine culture is performed using resistant rootstocks. The Directive Commission 2005/43/EC amending the Directive Council annexes 68/193/EEC, indicates that grapevine material should be free of these viruses: Grapevine fanleaf virus (GFLV), Grapevine leafroll associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll associated virus 3 (GLRaV-3), Grapevine fleck virus (GFkV) and Arabis mosaic virus (ArMV). In this work different methodologies related with in vitro culture were evaluated and developed with the aim of sanitate, mutiplicate and preserve grapevine germplam. In vitro preservation of grapevine varieties is a complementary stratregy of field preservation. In a preservation program it is important the selection of the starting material, determine its sanitary status, sanitate if it is necessary and, establish the appropriate in vitro conditions for its preservation. In the first chapter of this thesis (Chapter 1) the assays carried out for inducing somatic embryogenesis in 16 grapevine varieties which include six that were infected by the viruses GFLV, GLRaV-3 and GFkV are described. In grapevine, somatic embryogenesis has been described as a usefull methodology for virus sanitation and is the common pathway to adventitious regeneration. Efficient regeneration prototocols are necessary to address breeding by genetic transformation. In this work, cut seed are used as starting material and virus-free plants and high precentages of regeneration were obtained in all the varieties evaluated. The use of microsatellite markers has been useful to select those plants with the same genotype than the mother plant. From the other side, in this work, a micropropagation protocol starting from a healthy plant of the cultivar 'Monastrell' was developed and high multiplication rates with good adaptation to field conditions were obtained (Chapter 2). The culture medium MW was evaluated in 16 grapevine varieties as well as the following modifications: reduction in a half of the sugar content and elimination of the Indolebutyric Acid. The aim of these assays was to determine for each variety which conditions are the most appropiate to maintain in active in vitro culture this germplasm, lengthen the time between subcultures for reducing costs (Chapter 3). In Chapter 4 it is included a divulgation report that summarized the steps followed in the MINECO proyect CGL2015-70843-R for localizing and identifying grapevine varieties; discard or detect the presence of the viruses, sanitizing if it is necessary and, conserve in vitro the most interesting accessions. Microsatellite markers were used for genotyping. Analysis of variability were performed when several accessions were available. As an example, in this work it is published the microsatellite profile for two accessions of the endangered cultivar 'Esclafacherre' ('Esclafagerres') localized in two fields of the Valencian Community, and those of several accessions of 'Valencí Blanc' which differed for the VVMD32 marker, grouping the Alicante accessions and the rest of accessions from other origins. It was also validated a cryoconservation protocol for the 'Esclafacherre' variety. By last, Chapter 5 makes reference to a review performed with the goal to know the state of the art of genetic transformation in grapevine focusing on the main limiting factors of the employed methodologies. Genetic transformation is a potential tool for crop breeding, mainly in vegetative propagation plants. / La vinya és un cultiu de propagació vegetativa i de gran importància econòmica que es distribueix mundialment per zones temperades. La seua producció va destinada principalment a l'elaboració de vi, seguit de la producció de raïm de taula. Encara que existeixen milers de varietats, una desena d'elles son les que s'utilitzen majoritàriament a nivell mundial, el que comporta una pèrdua de variabilitat. Des de l'arribada de la fil·loxera, el cultiu de vinya es realitza mitjançant l'ampelt en peus resistents a aquest àfid. Segons la Comissió Directiva 2005/43/EC, el material de vinya ha d'estar lliure dels següents virus: GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV i ArMV. En este treball s'han avaluat i desenvolupat diferents metodologies relacionades amb el cultiu in vitro de plantes encaminades al sanejament, multiplicació i conservació de germoplasma de raïm. La conservació de varietats de raïm in vitro és molt important per a complementar la conservació de germoplasma en les col·leccions de camp. En el primer capítol d'esta tesi (Capítol 1) es descriuen els assaigs realitzats per a induïr l'embriogènesi somàtica en 16 varietats de raïm que inclouen sis varietats infectades amb els virus GFLV, GLRaV-3 i GFkV. En vinya, l'embriogènesi somàtica ha sigut descrita com una metodologia útil per al sanejament de plantes infectades amb virus i és la via comú de regeneració adventícia. En este treball s'utilitza com a material de partida llavors tallades i s'han obtingut plantes lliures de virus i percentatges de regeneració elevats en totes les varietats avaluades. La utilització de marcadors microsatèl·lits ens ha servit per a seleccionar entre les plantes regenerades aquelles que mostren el mateix genotip que les plantes de partida. Per altra banda, en este treball s'ha desenvolupat un protocol de micropropagació a partir de planta sana de la varietat 'Monastrell' cultivada in vitro, obtenint-se taxes de multiplicació elevades i plantes que s'han aclimatat a condicions de camp (Capítol 2). En el medi de cultiu MW, utilitzat per al desenvolupament de les plantes, s'han avaluat un total de 16 varietats i també s'ha comparat el creixement en este medi i en variacions d'este, com son la disminució de la concentració de sucre a la meitat i la eliminació de l'àcid indolbutíric. La finalitat d'estos assaigs ha sigut determinar per a cada varietat quines condicions són les més adequades per a mantindre el germoplasma vegetal en cultiu in vitro actiu però allargant el temps entre subcultius i optimitzant costos (Capítol 3). En el Capítol 4 s'inclou un treball de divulgació per a localitzar, identificar, descartar o detectar la presència dels virus anteriorment comentats, sanejar si cal, i conservar in vitro les varietats d'interés en les que es porta a cap una identificació utilitzant marcadors SSR i l'anàlisi de la variabilitat genètica quan es disposa de diverses accessions. A mode d'exemple, en estre treball es publica el perfil de marcadors microsatèl·lits per a dos de les accessions col·lectades de la varietat en perill d'extinció 'Esclafacherre' ('Esclafagerres'). També, es mostra el genotipat d'accessions de 'Valencí Blanc' en les que s'han detectat diferències per al marcador VVMD32 que agrupa les accessions d'Alacant per una banda, i a la resta d'accessions per altra. També s'ha validat un protocol de crioconservació en la varietat 'Escalfacherre'. Per últim, el Capítol 5 fa referència a un estudi portat a terme per a determinar l'estat actual de l'aplicació de la transformació genética en raïm, centrant-nos en els factors limitants de les metodologies empleades. La transformació genética és una ferramenta de gran potencial per a la millora dels cultius, principalment en plantes de propagació vegetativa. / San Pedro Galán, TM. (2017). Desarrollo y aplicación de técnicas biotecnológicas para el saneamiento, multiplicación, caracterización y conservación de germoplasma de vid (Vitis vinifera L.) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/94622 / TESIS