Orientador: Leonardo Antonio Mamede Zornoff / Coorientador: Sérgio Alberto Riupp de Paiva / Banca: Katashi Okoshi / Banca: Marcos F. Minicucci / Banca: Daniela R. D. Mksmczuk / Banca: Wilson Nadruz Junior / Resumo: O objetivo do nosso estudo foi de avaliar a influência da administração de taurina sobre a remodelação após o infarto em ratos, por meio de análise de sobrevida e de variáveis morfológicas, funcionais, bioquímicas, celulares e intersticiais cardíacas. Foram utilizados ratos wistar, machos, entre 200 - 250g foram submetidos ao infarto experimental. Após 48hs do procedimento, os animais sobreviventes foram alocados em dois grupos aleatoriamente: grupo IAM (n=31), o qual recebeu água potável e grupo IAM-T (n=30), que recebeu 3% de taurina diluída na água. O grupo controle (n=10) foi composto por animais não infartados e recebeu água potável. Após 3 meses de acompanhamento foi realizado estudo morfológico e funcional pelos seguintes métodos: coração isolado, ecocardiograma, morfometria e histologia. O estudo bioquímico foi realizado por HPLC (para determinar as concentrações e taurina no plasma e no tecido cardíaco). A imunohistoquímica foi utilizada para avaliar a conexina 43 e apoptose. Por meio da zimografia avaliou-se as metaloproteases, por espectrofotometria foram avaliados estresse oxidativo e metabolismo energético e por western blot avaliou-se a resposta antioxidante. A análise estatística foi realizada pelo teste de ANOVA de uma via, t de Student, curva de Kaplan Méier e long - rank. O nível de significância adotado foi de 5%. A concentração de taurina plasmática (C = 49 (38 - 54,2) (μmol/L); IAM = 74,6 (58,7 - 83) (μmol/L); IAM-T = 363 (157 - 477,4) (μmol/L); p = 0,004) e no tecido cardíaco (C = 0,100 ± 0,04 (μmol/g); IAM = 0,175 ± 0,07 (μmol/g); IAM-T = 0,419± 0,187 (μmol/g); p = 0,022) foi maior no grupo IAM-T quando comparado com controle e IAM. Com relação ao estudo ecocardiográfico, o grupo IAM-T apresentou valores intermediários, quando comparado com os grupos C e IAM, nas variáveis AE (C = 5,3 ± 0,7 mm; IAM = 6,8 ± 1,0 mm; IAM-T = 6,8 ... / Abstract: The aim of our study was to evaluate the influence of taurine administration on cardiac remodeling after myocardial infarction in rats by survival analysis and morphological, functional, biochemical, cellular and interstitial evalluation. Methods: Wistar male rats, weighting 200 - 250g were subjected to experimental myocardial infarction. 48 hours after the procedure, the surviving animals were randomly allocated into two groups: IAM group (n = 31), who received drinking tap water and T-IAM group (n = 30), who received 3% of taurine diluted in tap water. The control group (n = 10) was composed of non infarcted animals, who received drinking tap water. After 3 months of follow-up, morphological and functional study was conducted by the following. Isolated heart, echocardiography, histology and morphometry. Biochemical analysis was performed by HPLC (to determine the concentrations of taurine in plasma and heart tissue). Immunohistochemistry was used to evaluate connexin 43 and apoptosis. Metalloproteases was evaluated by zymography, oxidative stress and energy metabolism were evaluated by spectrophotometry and the antioxidant response, by western blot. Statistical analysis was performed by oneway ANOVA, Student t test, Kaplan Meier and long - rank tests. The level of significance was set at 5%. Concentration of taurine in plasma (C = 49 (38 - 54.2) (mmol / L), IAM = 74.6 (58.7 - 83) (mmol / L), T-IAM = 363 (157 - 477.4) (mmol / L), p = 0.004) and in heart tissue (C = 0.100 ± 0.04 (mmol / g), AMI = 0.175 ± 0.07 (mmol / g), T-IAM = 0.419 ± 0.187 (mol / g), p = 0.022) were higher in the T-IAM group compared with control and IAM groups. Regarding the echocardiographic study, the T-IAM group showed intermediate values when compared with C and IAM groups, variables LA (C = 5.3 ± 0.7 mm; IAM = 6.8 ± 1.0 mm; T-IAM = 6.1 ± 0.8 mm, p = <0.001), LA / tibia (C = 1.29 ± 0.18 mm / cm; IAM = 1.64 ± 0.25 mm / cm; ... / Doutor

Orientador: Ellen Cristini de Freitas / Banca: Julio Sérgio Marchini / Banca: Marcelo Papoti / Resumo: A taurina é um aminoácido encontrado em vários tecidos, é derivada do metabolismo da metionina e cisteína. Esse aminoácido apresenta diferentes funções benéficas, entre elas osmoregulação, modulação do cálcio iônico, estabilização da membrana plasmática , desenvolvimento do sistema nervoso, imunomodulação e atividade antioxidante. Além disso, estudos têm demonstrado associação entre taurina, melhora no desempenho físico e acréscimo dos níveis de lipólise, indicando melhora na eficiência metabólica. O pico da permanência máxima de concentração de taurina na circulação é de 120 minutos. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi verificar se a suplementação com taurina de forma aguda 120 minutos antes do exercício melhora o desempenho físico e ocasiona um aumento na liberação de lipídeos em nadadores. Para investigar essa proposta foi realizado um estudo duplo cego, com a participação de 10 nadadores de elite do sexo masculino com idade entre 17e 21 anos, os quais foram submetidos a duas analises de desempenho máximo de 400m em piscina semi-olímpica. Para avaliação do desempenho foi analisado o lactato pico, para os níveis de lipólise foi dosado a concentração sérica de glicerol, e para adequação da alimentação foram aplicados registros alimentares. Observou-se aumento significativo de 24% no nível de lipólise plasmática nos nadadores suplementados com taurina, porém não ocorreram aumento significativo no desempenho físico dos atletas ou alterações na lactacidemia. Concluí-se que a suplementação aguda de taurina 120 minutos antes de um teste de esforço máximo exerce uma melhora na eficiência metabólica de lipídeos quando associada ao exercício físico, porém estudos crônicos são necessários para verificar a participação desta ação no desempenho físico do atleta. / Abstract: Taurine is an amino acid found in various tissues is derived from the metabolism of methionine and cysteine. This amino acid has different beneficial functions, including osmoregulation, modulation of ionic calcium, stabilizing the plasma membrane, nervous system development, immunomodulation and antioxidant activity. Furthermore, studies have shown an association between taurine improves physical performance and increased levels of lipolysis, indicating an improvement in metabolic efficiency. The peak maximum stay concentration of taurine in the circulation is 120 minutes. Thus, the aim of this study was to determine whether supplementation with taurine acutely 120 minutes before exercise improves physical performance and causes an increase in the release of lipids in swimmers. To investigate this proposal a double-blind study was conducted with the participation of 10 elite swimmers male aged 21 years 17e, which were submitted to two analyzes of maximum performance in the 400m semi-Olympic pool. For performance evaluation we analyzed the lactate peak, for the levels of lipolysis was measured in serum glycerol, and the adequacy of nutrition food records were applied. A significant 24% increase in plasma level of lipolysis in swimmers supplemented with taurine, however no significant increase in physical performance of athletes or changes in lactate. It is concluded that acute taurine supplementation 120 minutes before a maximal exercise test carries an improvement in metabolic efficiency of lipids when combined with exercise, but chronic studies are needed to verify the role of this action on the physical performance of the athlete. / Mestre

Orientador: Kléber Tomás de Resende / Coorientador: Izabelle Auxiliadora Molina de Almeida Teixeira / Coorientador: Carla Joice Härter / Banca: João Alberto Negrão / Banca: Iran Borges / Banca: Heraldo César Gonçalves / Banca: Francisco Palma Rennó / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da restrição nutricional sobre o metabolismo energético e proteico de cabritos de 15 à 45 kg de peso corporal, sendo que foram utilizados 72 cabritos Saanen: 24 machos inteiros, 24 machos castrados e 24 fêmeas, com peso corporal de 15,76 ± 0,174 kg e idade inicial de 108,4 ± 18,86 dias (Experimento 1) e de 84 cabritos Saanen (26 machos inteiros, 27 machos castrados e 31 fêmeas) com peso corporal de 30,3 ± 0,87 kg (Experimento 2). Um esquema de parcelas subdivididas foi utilizado para avaliar a condição sexual (3 sexos = machos inteiros, machos castrados e fêmeas) e a restrição nutricional (3 níveis de restrição nutricional: 0% [ad libitum], 25% e 50%). Em ambos experimentos, dentro de cada sexo, foram formados seis blocos de três animais e dentro de cada bloco, onde os animais foram distribuídos aleatoriamente em cada nível de ingestão. Assim, a alimentação foi estabelecida dentro de cada bloco com base no consumo dos animais alimentados ad libitum. Os animais de cada grupo foram abatidos quando os animais alimentados ad libitum atingiram 30 kg (Experimento 1) ou 45 kg (Experimento 2). Foram avaliados a retenção de proteína e energia e o perfil metabólico/hormonal no sangue, onde foram analisados a glicose, proteína total, albumina, ureia, creatinina, colesterol, ácido graxos não-esterificados (NEFA), beta-hidroxibutirato (BHB), aspartato aminotransferase (AST), gama glutamil-transferase (GGT), creatinina quinase (CK), triiodotiron... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate the effect of feed restriction on energy and protein metabolism of 72 Saanen kids: 24 intact males, 24 castrated males, and 24 females with initial BW of 15.76 ± 0.174 kg and initial age of 108.4 ± 18.86 days (Experiment 1) and of 84 Saanen goats (26 intact males, 27 castrated males and 31 females) with initial body weight (BW) of 30.3 ± 0.87 kg (Experiment 2). A split plot design was employed (3 genders = intact males, castrated males, and females; 3 levels of feed restriction = 0% [ad libitum], 25%, and 50%). Groups of 3 goat kids was formed by gender (each goat eating one level of feed restriction); goats of each group were slaughtered when animals fed ad libitum reached 30 kg BW (Experiment 1) and 45 kg (Experiment 2). Blood samples were evaluate glucose, total protein, albumin, urea, creatinine, cholesterol, non-esterified fatty acid, beta-hydroxybutyrate, aspartate aminotransferase, gamma glutamyltransferase, creatine kinase, triiodothyronine, thyroxine, and insulin-like growth factor. Females had greater retention of body fat (% empty BW) regardless the level of feed restriction (P<0.001). Both gender and feed restriction affected energetic and proteic metabolism of goats (P< 0.05). Females from 15 to 30 kg BW changed their glycolytic metabolism to retain fat deposition even when subjected to feed restriction, while males mainly changed their protein metabolism to retain protein synthesis, and were less affected by feed restr... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O tecido cerebral é altamente dependente de uma complexa rede vascular e um suprimento adequado de oxigênio, uma vez que o metabolismo oxidativo é a principal via de produção de ATP. Entretanto, durante o aumento da atividade neuronal existe uma relação não linear entre fluxo sanguíneo cerebral e consumo de oxigênio, verificado por tomografia de emissão de pósitrons e posteriormente por técnicas quantitativas de ressonância magnética nuclear. O aumento mais pronunciado do fluxo sanguíneo em comparação com o consumo de oxigênio levanta questões sobre a possibilidade de o oxigênio atuar como um fator limitante. Apesar dos efeitos devastadores da privação completa de oxigênio ao tecido cerebral dentro de minutos, a redução da disponibilidade de oxigênio por curtos períodos de tempo é comum em pacientes com apneia do sono e está associada como fator de risco à hipertensão e acidentes vasculares. Acreditamos que a obtenção de novas informações sobre o efeito da disponibilidade de oxigênio na regulação da resposta vascular e do metabolismo energético no cérebro humano in vivo é crucial para um melhor entendimento de aspectos básicos do metabolismo energético cerebral e sua relação com o sistema neurovascular. Nesta tese foi avaliado o impacto da redução da disponibilidade de oxigênio no acoplamento neurovascular e metabólico do cérebro humano saudável. Dois estudos foram realizados na presença de hipóxia moderada, com saturação sanguínea entre 80 a 85%, e normóxia como condição de controle. O primeiro utilizou técnicas quantitativas de ressonância magnética funcional (fMRI) em 3T para caracterizar a resposta vascular evocada de 9 sujeitos saudáveis perante a estimulação visual. O segundo visou caracterizar as concentrações metabólicas em repouso e também as alterações induzidas pela estimulação visual em 11 sujeitos, utilizando a técnica de espectroscopia de ressonância magnética funcional (fMRS) em 7T. Os dados de fMRI mostraram reduções significativas das áreas corticais recrutadas durante a hipóxia moderada, embora as áreas comuns às três técnicas que continuaram ativas demonstraram respostas com amplitude de fluxo e volume sanguíneos similares a normoxia. Além disto, a variação de consumo de oxigênio devido à estimulação visual foi menor durante a hipóxia. Tais achados potencialmente poderiam indicar diminuição da extensão do recrutamento neuronal, porém um novo desacoplamento entre atividade neuronal e a resposta vascular, ou seja, aumento da atividade neuronal sem uma mesma resposta vascular durante a hipóxia moderada não poderia ser descartado. O estudo de fMRS demonstrou alterações metabólicas (glutamato e lactato) induzidas pela estimulação similares em ambas as condições gasosas. Entretanto, alterações significativas nas concentrações de aspartato, glutamato e glutamina foram observadas entre as condições no repouso. A combinação dos achados de ambos os estudos aqui apresentados sugere que a hipóxia moderada não resulta na diminuição do recrutamento neuronal, pois variações similares de glutamato e lactato, considerados fortes marcadores do aumento de atividade neuronal, foram observadas durante hipóxia moderada. Entretanto, há evidências de que a disponibilidade reduzida de oxigênio leva a alterações no mecanismo do acoplamento vascular e também no metabolismo basal. Análises futuras serão necessárias para verificar se existe um mecanismo fisiológico que explica as alterações vasculares e metabólicas aqui observadas. / The cerebral tissue is highly dependent on a complex vascular network and a tight regulated supply of oxygen, since oxidative metabolism is the primary source of ATP synthesis. Increased neuronal activity leads to a well-established mismatch between CBF and CMRO2, measured by PET and nuclear magnetic resonance techniques. The much larger CBF evoked response as compared to CMRO2 response raises questions about the role played by oxygen as a potential limiting factor. Despite the devastating effects of intense hypoxia to cerebral tissue, moderate oxygen deprivation through short periods of time is frequent in chronic disorders such as obstructive sleep apnea and has been suggested to be a risk factor for morbidities such as hypertension and stroke. Identifying the impact of mild hypoxia on functional brain metabolism in the healthy human brain is a crucial step for understanding basics aspects of cerebral bioenergetics and its relationship with the neurovascular system. In this thesis we evaluate the impact of reduced oxygen availability in the neurovascular and metabolic coupling of the healthy human brain. Two studies were performed in the presence of mild hypoxia, with 80 to 85% arterial blood oxygen saturation, and normoxia as the control condition. The first study utilized functional Magnetic Resonance Imaging techniques (fMRI) at 3T to characterize the vascular response to visual stimulation in 9 subjects. The second study aimed at characterizing the neurochemical profile of the human brain and quantifying the stimulus-induced metabolic changes as measured by fMRS at 7T in 11 subjects. The fMRI data showed significant reductions in the recruited cortical areas during mild hypoxia, although activated areas in all three imaging modalities showed responses with similar amplitude of blood flow and volume from normoxia. In addition, the variation of oxygen consumption due to stimulation was smaller during mild hypoxia. These findings could potentially suggest decreased neuronal recruitment, although a new decoupling between neuronal activity and vascular response (i.e. similar neuronal recruitment with different vascular response) could not be discarded. The fMRS study showed similar stimulus-induced glutamate and lactate changes during both gas conditions. However, significant concentration differences were observed in aspartate, glutamate and glutamine during rest conditions. Finally, the combination of the data from the two studies herein presented suggests that mild hypoxia does not result in reduced neuronal recruitment despite the altered vascular response, as shown by the similar glutamate and lactate stimulus-induced responses, known to be strong markers of increased neuronal activity. However, there are evidences that support altered neurovascular coupling and metabolic concentrations during reduced oxygen availability at rest. Further analysis will be necessary to elucidate how the new steady state concentrations of aspartate, glutamate and glutamine could be linked to physiological mechanism that potentially alters the neurovascular response.

Os ácidos fitânico (Fit) e pristânico (Prist) são ácidos graxos saturados de cadeia lateral ramificada, cujas concentrações estão aumentadas em diversas doenças peroxissomais. Os pacientes afetados por essas desordens apresentam manifestações clínicas heterogêneas com envolvimento neurológico importante. O aumento nas concentrações do Fit e Prist, que podem chegar a 5000 μM e 300 μM no plasma, respectivamente, parece estar correlacionado com a severidade das doenças, indicando que estes ácidos graxos possam ser neurotóxicos. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e tendo em vista a importância do metabolismo energético para o sistema nervoso central, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos Fit e Prist sobre vários parâmetros do metabolismo energético. Inicialmente, observamos que o Fit não diminuiu a produção de CO2 a partir de D-[U-14C] glicose e ácido [1-14C] acético, sugerindo que não houve comprometimento da via glicolítica ou do ciclo do ácido cítrico (CAC). Esse último resultado foi confirmado pela determinação da atividade das enzimas do CAC, onde não foram observadas alterações. Por outro lado, o Fit diminuiu significativamente a atividade dos complexos I, I-III, II, II-III e IV da cadeia respiratória, indicando que o fluxo de elétrons por essa cadeia está prejudicado na presença desse ácido graxo. Também verificamos que a atividade da enzima creatina quinase não foi alterada pelo Fit. Finalmente, medimos a atividade da enzima Na+,K+-ATPase na presença de Fit e observamos que esse ácido graxo diminuiu de maneira acentuada essa atividade, indicando que a neurotransmissão está prejudicada por esse metabólito. Por outro lado, investigamos a ação do Prist sobre a produção de CO2 a partir de ácido [1-14C] acético e observamos que esse metabólito diminuiu esse parâmetro, indicando o comprometimento do CAC. Avaliamos se esse efeito deletério pudesse ter sido causado pela diminuição de coenzima A devido a uma possível competição entre o Prist e acetato por essa coenzima. Observamos que os efeitos inibitórios sobre essa atividade não foram devidos a uma depleção de coenzima A. Em seguida, investigamos o efeito do Prist sobre as atividades dos complexos da cadeia respiratória e observamos que esse ácido graxo diminuiu a atividade dos complexos I, II e II-III sem interferir com a atividade do complexo IV, o que indica claramente que esse ácido graxo interfere no fluxo dos elétrons pela cadeia respiratória, podendo potencialmente comprometer a geração de ATP. Também observamos que a atividade da enzima creatina quinase não foi alterada pelo Prist. Entretanto, foi observada uma diminuição acentuada na atividade da enzima Na+,K+-ATPase causada pelo Prist, o que indica que pode haver um comprometimento na manutenção do potencial da membrana necessário para o funcionamento da neurotransmissão. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos Fit e Prist acumulados em algumas doenças peroxissomais comprometem o metabolismo energético e possivelmente a neurotransmissão e que esses mecanismos podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas desordens. / Phytanic acid (Phyt) and pristanic acid (Prist) are branched-chain saturated fatty acids whose concentrations are elevated in various peroxisomal disorders. Patients affected by these disorders present heterogeneous clinical manifestations with predominant neurological involvement. The elevation of plasma, Phyt and Prist concentrations, that can reach up to 5000 μM and 300 μM, respectively, seems to be correlated with the severity of the symptoms, indicating that these fatty acids may be neurototoxic. Considering that the pathophysiology of the neurological symptoms of these diseases are not well established and the importance of the energy metabolism to the central nervous system, the present work proposed to investigate the in vitro effects of Phyt and Prist on various parameters of energy metabolism. Initially, we observed that Phyt did not reduce CO2 production from labeled glucose and acetate, suggesting that this acid did not alter glycolysis and citric acid cycle (CAC) activity. CAC enzyme activities were also not modified by Fit reinforcing the view that the CAC is not disturbed by Fit. On the other hand, Phyt diminished the activities of complexes I, I-III, II, II-III and IV of the respiratory chain, indicating that the electron flow through this chain is impaired by this fatty acid that could lead toa disturbance of ATP generation. We also verified that the activity of creatine kinase was not altered by this metabolite. Finally, we measured the activity of Na+,K+-ATPase in the presence of Phyt and observed that this fatty acid drastically reduced this activity, indicating that the maintenance of membrane potential and consequently neurotransmission is probably compromised by this metabolite. On the other hand, we investigated the effect of Prist on CO2 production from labeled acetate and observed that this metabolite decrease this parameter, indicating an impairment of CAC functioning. We also evaluated if this effect could be due to a decrease of coenzyme A due to a possible competition between Prist and acetate for this coenzyme. We observed that the inhibitory effects on this activity was not caused by depletion of coenzyme A. Next, we investigated the effect of Prist on the activities of the respiratory chain complexes and observed that this fatty acid reduced the activity of complexes I, II and II-III without interfering with complex IV, which clearly indicates that this fatty acid compromises the electron flow through the respiratory chain that could potentially reduce ATP generation. We also verified that the activity of creatine kinase was not altered by Prist. However, we observed a large decrease on the activity of Na+,K+-ATPase caused by Prist, which indicates that there can be a compromise on the maintenance of membrane potential necessary to a normal neurotransmission Our results suggest that the fatty acids Phyt and Prist accumulated in some peroxisomal diseases compromise energy metabolism and possibly the neurotransmission and that these mechanisms may be involved with the neurological damage presented by patients affected by these disorders.

As doenças metabólicas são Erros Inatos do Metabolismo (EIM) que apresentam diferentes aspectos relacionados com sistemas e órgãos distintos, incluindo o cérebro e o coração. Dentre os EIM, as acidemias orgânicas e as aminoacidopatias são os mais freqüentes. Neste trabalho abordaremos a Deficiência de Guanidinoacetato Metiltransferase (GAMT), uma acidemia orgânica, e a Homocistinúria (HCU), uma aminoacidopatia. A Deficiência de GAMT é caracterizada bioquimicamente por acúmulo de guanidino acetato (GAA) e pela deficiência de creatina. Há evidências mostrando que o GAA pode causar excitotoxicidade e induzir estresse oxidativo. A creatina é uma amina de ocorrência natural com um papel muito importante no metabolismo energético, além de apresentar propriedades antioxidantes per se. A hiper-homocisteinemia é um fator de risco para doenças cardiovasculares, aterosclerose e trombose, no entanto, os mecanismos pelos quais a homocisteína (Hcy) desencadeia essas disfunções não são totalmente compreendidos. A Na+,K+-ATPase e a creatina cinase desempenham um papel fundamental no sistema nervoso central, uma vez que a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolismo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças neurodegenerativas. Dessa forma, os objetivos desse trabalho serão apresentados em duas partes; como segue: Parte I - Ampliar o conhecimento sobre uma possível estratégia de tratamento dos pacientes afetados pela Deficiência de GAMT, investigando o efeito da administração de creatina sobre alterações causadas pela administração intraestriatal de GAA em ratos adultos; Parte II - Investigar o efeito da hiper-homocisteinemia crônica sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em coração de ratos jovens. Para os modelos experimentais mencionados, foram avaliados parâmetros do metabolismo energético (Na+,K+-ATPase, creatina cinase e complexo II da cadeia respiratória), bem como níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), atividade de enzimas antioxidantes denominadas superóxido dismutase e catalase, oxidação de 2',7'-diclorofluoresceína (H2DCF), e níveis de nitritos. Também avaliamos o efeito do ácido fólico sobre as alterações bioquímicas provocadas pela Hcy. Os nossos resultados mostram que a administração de creatina preveniu todos os parâmetros alterados pela administração de GAA. Acreditamos que a prevenção causada pela creatina pode contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados com o déficit energético e estresse oxidativo presentes na Deficiência de GAMT. Para o modelo experimental de hiper-homocisteinemia severa, os nossos resultados mostram que a administração crônica de Hcy aumentou a lipoperoxidação e a produção de espécies reativas, diminui as defesas antioxidantes enzimáticas e os níveis de nitritos em coração de ratos jovens. A administração concomitante de ácido fólico, preveniu os efeitos da Hcy provavelmente por suas propriedades antioxidantes, indicando que o estresse oxidativo provocado pela Hcy pode ser um mecanismo que contribui, pelo menos em parte, nas alterações cardiovasculares características dos pacientes hiper-homocisteinêmicos. Se confirmado em seres humanos, nossos dados poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos cerebrais e cardiovasculares característicos da Deficiência de GAMT e da HCU, respectivamente, e propor terapias adjuvantes para as alterações pertinentes encontradas no cérebro e no coração dos pacientes afetados por essas doenças metabólicas. / Metabolic diseases are Inborn Errors of Metabolism (IEM) that present different aspects related to different systems and organs including the brain and the heart. Among the IEM, the organic acidemias and the aminoacidopathies are the most frequent. In this work we study the guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT), an organic acidemia, and the Homocystinuria (HCU), an aminoacid pathology. The GAMT deficiency is characterized biochemically by the accumulation of guanidineacetate (GAA) and creatine deficiency. There are evidences that the GAA can cause excitotoxicity and induce oxidative stress. Creatine is a naturally occurring amine with a very important role in energy metabolism, besides its antioxidant properties per se. Hyperhomocysteinemia is a risk factor for cardiovascular diseases, atherosclerosis and thrombosis, however, the mechanisms by which homocysteine (Hcy) triggers these disorders are not fully understood. The Na+, K+-ATPase and creatine kinase plays a key role in central nervous system, since alteration of these enzymes, together with the decrease of the energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated with some neurodegenerative diseases. Thus, the objectives of this study will be presented in two parts, as follows: Part I - To increase knowledge on a possible treatment strategy of patients affected by GAMT deficiency, investigating the effect of creatine administration on changes caused by intrastriatal administration of GAA in adult rats; Part II – To investigate the effect of chronic hyperhomocysteinemia on some parameters of oxidative stress in the heart of young rats. For the experimental models mentioned were evaluated parameters of energy metabolism (Na+, K+-ATPase, creatine kinase and complex II of the respiratory chain), as well as levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), antioxidant enzymes called superoxide dismutase and catalase, oxidation of 2 ', 7'-dichlorofluorescein (H2DCF) and nitrite levels. We also evaluated the effect of folic acid on the biochemical changes caused by Hcy. Our results show that administration of creatine prevented all the parameters altered by the administration of GAA. We believe that the prevention caused by creatine may contribute, at least in part, to a better understanding of the mechanisms related to the energy deficit and oxidative stress present in GAMT deficiency. For the experimental model of severe hyperhomocysteinemia, our findings show that chronic administration of Hcy increased lipoperoxidation and reactive species generation, decreases the enzymatic antioxidant defenses and levels of nitrite in the heart of young rats. Concomitant administration of folic acid prevented the effects of Hcy probably by its antioxidant properties, indicating that the oxidative stress induced by the Hcy may be one mechanism that contributes at least in part, on cardiovascular features of hyperhomocysteinemic patients. If confirmed in humans, our data may contribute to elucidating the brain and cardiovascular mechanisms characteristics of the GAMT deficiency and of the HCU, respectively, and to propose adjuvant therapies relevant to the amendments found in the brain and heart of patients affected by these metabolic diseases.

A deficiência da desidrogenase de acilas de cadeia média (MCAD) é o mais freqüente erro inato da oxidação de ácidos graxos. Os indivíduos afetados por esse distúrbio apresentam-se sintomáticos durante períodos de descompensação metabólica, caracterizado pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia média (AGCM), particularmente os ácidos octanóico (AO), decanóico (AD) e cis-4-decenóico (AcD). Durante as crises, os pacientes apresentam hipoglicemia hipocetótica, hipotonia, rabdomiólise, edema cerebral e, finalmente, entram em coma, podendo ter um desenlace fatal. O tratamento de urgência é baseado na infusão de glicose nos pacientes durante as crises, enquanto uma dieta rica em carboidratos e pobre em gorduras é recomendada nos períodos fora das crises. Uma parte considerável dos pacientes que sobrevivem às crises apresenta um grau variável de manifestações neurológicas. Entretanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos da deficiência de MCAD são praticamente desconhecidos. No presente estudo avaliamos a influência dos principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD, os ácidos AO, AD e AcD, e , em alguns casos, também de seus derivados de carnitina e glicina, sobre as atividades de enzimas importantes do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos Wistar de 30 dias de vida. AO, AD, AcD e octanoilcarnitina inibiram a atividade da Na+, K+-ATPase, com ênfase ao AcD, o inibidor mais potente da atividade da enzima. Além disso, verificamos que a co-incubação do AO com glutationa (GSH) ou trolox (vitamina E solúvel) evitou seu efeito inibitório sobre a atividade da enzima. A inibição da enzima pelo AcD foi também prevenida quando o mesmo foi co-incubado com as enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) juntas, mas não com GSH. Além disso, AO, AD e AcD aumentaram a lipoperoxidação em homogeneizados de córtex cerebral de ratos, medidos por quimioluminescência e TBA-RS. Tais resultados sugerem que esses metabólitos inibiram a atividade da Na+, K+-ATPase via radicais livres. Observamos ainda que somente AD e AcD inibiram atividades dos complexos da cadeia respiratória, ao contrário do AO que não teve qualquer ação sobre essas atividades. Enquanto o AD diminuiu somente a atividade do complexo IV a uma concentração muito alta (3 mM), o AcD diminuiu as atividades dos complexos II, II-III e IV dentro da faixa de concentrações encontrada na deficiência de MCAD (0,25-0,5 mM). Além disso, AO, AD e AcD inibiram a produção de CO2 a aprtir de glicose e acetato radiativos como substratos, indicando uma inibição do ciclo de Krebs. No entanto, somente AD e AcD reduziram a produção de CO2 a partir de citrato, enquanto AO não alterou a mesma. Além disso, nenhum dos três metabólitos testados alterou a atividade da citrato sintase. Demonstramos ainda que o AcD reduziu as atividades da creatinaquinase mitocondrial e citosólica, mas em uma concentração muito alta não encontrada na deficiência de MCAD. Este efeito não foi evitado por GSH, vitamina C+E ou L-NAME, sugerindo que o mesmo deve ter ocorrido via mecanismo distinto do estresse oxidativo. AcD foi o inibidor mais potente das atividades enzimáticas testadas neste trabalho, indicando que deve ser o metabólito de maior toxicidade nesta doença, ao menos no que se refere ao comprometimento do metabolismo energético. Espera-se que nossos resultados possam contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos envolvidos na deficiência de MCAD.

A deficiência da desidrogenase de hidroxiacil-coa de cadeia longa (LCHAD) é um erro inato do metabolismo de ácidos graxos. Pacientes acometidos apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longano sangue e tecidos. A sintomatologia é bastante variada, sendo que os pacientes apresentam hepatopatia e cardiomiopatia severa, assim como retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, letargia e convulsões. Considerando que a patofisiologia do dano hepático encontrado nos pacientes com deficiência da LCHAD não está esclarecida, o presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos dos ácidos 3-hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico(3HPA) sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmentros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado (U), bem como o potencial de membrana (ΔΨm), inchamento, capacidade de retenção de Ca2+ mitocondrial e estado redox do NAD(P) em mitocôndrias isoladas de fígado de ratos jovens. Os ácidos monocarboxílicos encontrados em maiores concentrações nos pacientes, 3HTAe 3HPA inibiram a respiração estimulada por ADP (estado 3), a desacoplada, o RCR, diminuíram o ΔΨm e o conteúdo de NAD(P)H e, em contraste, aumentaram a respiração lenta (estado 4) em mitocôndrias utilizando glutamato/malato ou sucinato como substratos. Além disso, o inibidor competitivo do translocador de nucleotídeo adenina (ANT) atractilosídeo atenuou o aumento no estado 4 provocado pelo 3HTA. Esses dados indicam que o 3HTA e o 3HPA atuam como inibidores metabólicos e desacopladores da fosforilação no fígado. Também verificamos que baixas concentrações desses ácidos graxos hidroxilados causam uma diminuição significante no ΔΨm e no conteúdo de NAD(P)H na presença de Ca2+. 3HTA e 3HPA também diminuíram a capacidade de retenção de Ca2+ e induziram inchamento em mitocôndrias. Os efeitos induzidos por 3HTA foram totalmente prevenidos pelos inibidores clássicos do poro de transição de permeabilidade (PTP) ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, um inibidor da captação de Ca2+, indicando abertura do PTP. Ademais, ditiotreitol e N-etilmaleimida não foram capazes de prevenir estes efeitos, descartando a oxidação dos grupamentos tióis do PTP como mecanismo de sua abertura. Finalmente, verificamos que o ácido dicarboxílico 3- hidroxitetradecanodioico (3HTDA), que também se acumula na deficiência da LCHAD e que é um análogo do 3HTA, não alterou os parâmetros de bioenergética mitocondrial. Em conjunto, nossos dados demonstram que os principais ácidos graxos monocarboxílicos hidroxilados de cadeia longa acumulados na deficiência da LCHAD prejudicam a homeostase energética mitocondrial em fígado. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a disfunção hepática caracerística dos pacientes acometidos por essa doença. / Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencie is an inborn error of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids.Clinical presentation is characterized by a wide variety of symptoms, including severe hepatopathy and cardiomyopathy, as well as retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and developmental delay, lethargy and seizures.Considering that the pathophisiology of the hepatic damage found in LCHAD-deficient patients is not yet clear, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3- hydroxypalmitic (3HPA)on inportant parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and state uncoupled (U), as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P) redox state in isolated liver mitochondria from young rats. The monocarboxylic acids found at higher concentrations in LCHADdeficient patients, 3HTA and 3HPA, inhibited the ADP-stimulated (state 3) and uncoupled respiration, decreased ΔΨm and NAD(P)H content and, in contrast, increased resting (state 4) respiration in mitochondrial preparations supported by glutamate plus malate or succinate.Furthermore, the competitive inhibitor of adenine nucleotide translocase (ANT) atractyloside, attenuated the 3HTA-induced increase of state 4 respiration. These data indicate that 3HTA and 3HPA act as metabolic inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation in the liver.We also verified that low concentrations of these hydroxyl fatty acids caused a strong decrease of ΔΨm and NAD(P)H content in the presence of Ca2+. 3HTA and 3HPA also reduced Ca2+ retention capacity and induced swelling in mitochondria. The effects induced by 3HTA were totally prevented by the classical mitochondrial permeability transition (MPT) inhibitors cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, a Ca2+ uptake blocker, indicating MPT pore opening. Furthermore, dithiothreitol and N-ethylmaleimide were not able to prevent these effects, making unlikely an oxidation of thiol groups of the MPT pore as a mechanism of its opening. Finally, the dicarboxylic 3-hydroxytetradecanodioic acid (3HTDA), which also accumulates in LCHAD deficiency and is an analogue of 3HTA, did not alter mitochondrial bioenergetics parameters. Taken together, our data demonstrate that the major monocarboxylic long chain fatty acids accumulating in LCHAD deficiency disrupt energy mitochondrial homeostasis in the liver. It is proposed that this pathomechanism may explain at least in part the hepatic alterations characteristic of the affected patients.

Estima-se que 1 em 5 pessoas morrerão de câncer e, neste momento 1 em 200 vivem com a patologia. Classicamente, é descrita como uma doença genética, e por muito tempo as abordagens terapêuticas focaram em mutações. Apesar de casos de sucesso, a eficácia terapêutica ainda é insuficiente, estima-se que 2 em 3 pessoas diagnosticadas com câncer morrerão de causas relacionadas à doença. Apesar da imensa variabilidade genética, diferentes mutações convergem para um número limitado de fenótipos. Assim, o estudo do câncer sob uma ótica evolutiva focando em fenótipos agressivos é uma alternativa promissora. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar fenótipos agressivos em tumores sólidos, buscando caracterizar alterações e propor alvos e terapias. Para isto, investigou-se câncer de pulmão e mama sob diferentes aspectos biológicos. O capítulo I estudou metabolismo redox em câncer de pulmão de não-pequenas células (NSCLC). Aqui, demonstramos que o desbalanço redox oxidativo intracelular é um fenótipo agressivo. Posteriormente, sugerimos abordagens antioxidantes como uma boa proposta terapêutica. O capítulo II estudou adenocarcinoma de pulmão sob o contexto da reprogramação metabólica. Neste, sugerimos que o metabolismo glicolítico dependente de transportadores de glicose (GLUT’s) e lactato/piruvato (MCT’s) é um fenótipo agressivo. Por fim, propomos que inibidores para isoformas específicas destes transportadores podem ter impacto clínico nesta malignidade. O capítulo III investigou uma abordagem terapêutica para um fenótipo agressivo bem estabelecido, a resistência à hipóxia. Utilizando modelos in vitro e in vivo de câncer de mama triplo-negativo (TNBC), encontramos que o inibidor epigenético JQ1 é capaz de inibir genes e rotas importantes à sobrevivência da célula cancerosa em hipóxia. Utilizando modelos in vitro e in vivo de câncer de mama triplo-negativo (TNBC), encontramos que o inibidor epigenético JQ1 é capaz de inibir genes e rotas importantes à sobrevivência da célula cancerosa em hipóxia. Deste modo, é proposto esta abordagem epigenética na terapêutica de TNBC. Portanto, foi demonstrado aqui que a investigação de fenótipos agressivos é capaz de contribuir para a oncologia molecular, identificando padrões e apontando alvos. Foi dito no passado que “nada em biologia faz sentido senão à luz da evolução”, e foi sob esta filosofia que o presente trabalho foi desenvolvido e buscou contribuir na busca da cura do câncer. / It is estimated that 1 in 5 people will die of cancer, and now 1 in 200 live with this pathology. Classically, cancer is described as a genetic disease, and for a long time therapeutic approaches focused on mutations. Despite some successes, treatment efficacy is still insufficient, it is estimated that 2 out of 3 people diagnosed with cancer will die from causes related to the disease. Despite the large genetic variability, different mutation converge to a limited number of phenotypes. Thus, the investigation of cancer under an evolutive perspective that focus on aggressive phenotypes is an promising alternative approach. Therefore, this study aimed to investigate aggressive phenotypes in solid tumors, seeking to characterize changes and propose targets and therapies. For this, we investigated lung cancer and breast under different biological aspects. Chapter I studied redox metabolism in non-small cell lung cancer (NSCLC). Here, we show that redox imbalance favouring intracellular oxidative stress is an aggressive phenotype. Later, we suggest antioxidants approaches as a promising therapeutic window. Chapter II studied lung adenocarcinoma in the context of metabolic reprogramming. Herein, we suggest that the glycolytic metabolism dependent on transporters of glucose (GLUT's) and lactate / pyruvate (MCT's) is an aggressive phenotype. Then, we propose that inhibitors for specific isoforms of GLUT’s and MCT’s may have clinical impact in this malignancy. Chapter III investigated a therapeutic approach for cells that are resistant to hypoxia, a well-established aggressive phenotype. Using in vitro and in vivo models of triple negative breast cancer (TNBC), we find that the epigenetic inhibitor JQ1 is able to inhibit important genes and pathways in hypoxic cancer cell survival. Thus, we propose this epigenetic approach in the management of TNBC. Therefore, it was demonstrated here that investigation of aggressive phenotypes can contribute to the molecular oncology, identifying patterns and pointing targets. It was once said that "nothing in biology makes sense except in the light of evolution", this study was conducted under this philosophy to contribute in the search for the cure of cancer.

Durante as últimas décadas a incidência de obesidade e diabetes tipo 2 vem aumentando assustadoramente, principalmente, em crianças. Recentes estudos sugerem que a hiperglicemia crônica, situação comum em diabéticos sem controle sobre a glicemia, altera mecanismos intracelulares, incluindo aumento na via dos polióis, ativação da proteína quinase C, aumento da via das hexosaminas e aumento na formação de produtos finais da glicação avançada (AGEs). Complicações vasculares como a nefropatia e a neuropatia são comumente encontradas em pacientes diabéticos, assim como falha na função cardíaca e hepática. Os AGEs estão relacionados com o aumento de: estresse oxidativo, dano ao ADN, citocinas pró-inflamatórias e resistência à insulina. Nos últimos anos muitas drogas têm sido testadas para prevenção ou diminuição dos efeitos das glicotoxinas, principalmente no diabetes, entretanto poucas obtiveram sucesso. Na presente tese, demonstramos que as glicotoxinas endógenas e exógenas afetam o metabolismo de alguns aminoácidos e o metabolismo energético do sistema nervoso central de maneira a prejudicar sua homeostase. Podemos concluir, também, que os Ω3- PUFAs demonstraram melhorar o estado redox no fígado e no rim de ratos diabéticos alimentados com uma dieta hiperlipídica aquecida. Estes resultados podem sugerir que os ácidos graxos poli-insaturados Omega 3 (Ω3-PUFAs) possam ser adjuvante no tratamento de algumas doenças como diabetes mellitus e resistência à insulina. / During the last decades the incidence of obesity and type 2 diabetes has increased alarmingly, especially in children. Some studies suggest that chronic hyperglycemia, a situation common in diabetics with no control over blood glucose levels, alters intracellular mechanisms, including increased polyol pathway, activation of protein kinase C, increased of Hexosamines pathway and increased formation of advanced glycation end products (AGEs). Vascular complications such as nephropathy and neuropathy are commonly found in diabetic patients, as well as cardiac and liver failure. AGEs are related to the increase: oxidative stress, DNA damage, proinflammatory cytokines and insulin resistance. In recent years several drugs have been tested for preventing or mitigating the effects of glycotoxins, especially in diabetes, but few have succeeded. In this thesis, we demonstrate that endogenous and exogenous glycotoxins affect metabolism of some amino acids and energy metabolism of the central nervous system in a manner detrimental homeostasis. We can also conclude that Ω3-PUFAs shown to improve the redox state in liver and kidney of diabetic rats fed a heated fat diet. These results may suggest that polyunsaturated fatty acids Omega 3 (Ω3-PUFAs) can be used as adjuvant in the treatment of some diseases such as diabetes mellitus and insulin resistance.