A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.

No description available.

A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.

A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.

Orientador: Luciana Rossini Pinto / Resumo: A busca por fontes de energia renováveis desperta o interesse em uma das principais culturas exploradas no Brasil, a cana-de-açúcar. As cultivares modernas derivaram de cruzamentos interespecíficos principalmente entre Saccharum officinarum e S. spontaneum nos quais poucos acessos destas espécies foram utilizados, proporcionando uma base genética estreita. Porém, existe uma vasta variabilidade genética e epigenética dentre os acessos que compõem o “complexo Saccharum” que ainda não foi explorada nos programas de melhoramento. A metilação do DNA, uma das principais modificações epigenéticas ocorrentes em plantas, pode ser quantificada pela técnica de MSAP (Methylation sensitive amplification polymorphism). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo estimar a diversidade epigenética das espécies S. officinarum, S. spontaneum, S. robustum, S. barberi, Erianthus sp. e cultivares comerciais via marcadores MSAP. Para isso, duas amostras de cada acesso foram digeridas com as enzimas de restrição EcoRI-MspI e EcoRI-HpaII, ligadas aos respectivos adaptadores e submetidas as amplificações pré-seletivas e seletivas. Os padrões de metilação foram estimados, classificando os marcadores quanto ao número de loci suscetíveis (MSL) e não suscetíveis a metilação (NML). As relações de dissimilaridade entre os acessos assim como a distribuição da variabilidade epigenética dentre e entre os grupos das espécies foram analisadas. No total, foram obtidos 1341 loci, sendo que a diversidade foi ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The search for renewable energy sources has promoted the interest in one of the main crops explored in Brazil, the sugarcane. Modern sugarcane cultivars derived from interspecific crosses, mainly between Saccharum officinarum and S. spontaneum in which few assessions of these species were involved leading to a narrow genetic base. However, there is a huge genetic and epigenetic variability among the accessions of the “Saccharum complex” that has not yet been explored in the breeding programs. The DNA methylation, one of the main epigenetic modifications that occur in plants, can be quantified by using the MSAP (Methylation sensitive amplification polymorphism) technique. In this context, this study aimed to estimate the epigenetic diversity of S. officinarum, S. spontaneum, S. robustum, S. barberi, Erianthus sp. species and commercial cultivars by using MSAP derived markers. Two DNA samples of each accession were separetly digested with the restriction enzymes EcoRI-MspI and EcoRI-HpaII, ligated to adapters followed by pre-selective and selective amplification. The methylation patterns were estimated by classifying the markers based on the number of MethylationSusceptible Loci (MSL) and Non-Methylated Loci (NML). The dissimilarity relations and variability distribution within and between the accessions was evaluated. A total of 1341 loci were obtained and the diversity was significantly higher in MSL, resulting in a higher variability in the epigenome. Most of the polymorphis... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by ALESSANDRA ALVES MARTINS null (alessandraamartins49@gmail.com) on 2018-08-20T20:31:56Z No. of bitstreams: 1 Cópia 2 - com certificado escaneado anexo.pdf: 1123502 bytes, checksum: 9c8376453b1381b7d4f8860acfc0d7b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-08-21T14:04:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martins_aa_me_jabo.pdf: 1123502 bytes, checksum: 9c8376453b1381b7d4f8860acfc0d7b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martins_aa_me_jabo.pdf: 1123502 bytes, checksum: 9c8376453b1381b7d4f8860acfc0d7b0 (MD5) Previous issue date: 2018-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A busca por fontes de energia renováveis desperta o interesse em uma das principais culturas exploradas no Brasil, a cana-de-açúcar. As cultivares modernas derivaram de cruzamentos interespecíficos principalmente entre Saccharum officinarum e S. spontaneum nos quais poucos acessos destas espécies foram utilizados, proporcionando uma base genética estreita. Porém, existe uma vasta variabilidade genética e epigenética dentre os acessos que compõem o “complexo Saccharum” que ainda não foi explorada nos programas de melhoramento. A metilação do DNA, uma das principais modificações epigenéticas ocorrentes em plantas, pode ser quantificada pela técnica de MSAP (Methylation sensitive amplification polymorphism). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo estimar a diversidade epigenética das espécies S. officinarum, S. spontaneum, S. robustum, S. barberi, Erianthus sp. e cultivares comerciais via marcadores MSAP. Para isso, duas amostras de cada acesso foram digeridas com as enzimas de restrição EcoRI-MspI e EcoRI-HpaII, ligadas aos respectivos adaptadores e submetidas as amplificações pré-seletivas e seletivas. Os padrões de metilação foram estimados, classificando os marcadores quanto ao número de loci suscetíveis (MSL) e não suscetíveis a metilação (NML). As relações de dissimilaridade entre os acessos assim como a distribuição da variabilidade epigenética dentre e entre os grupos das espécies foram analisadas. No total, foram obtidos 1341 loci, sendo que a diversidade foi significativamente maior nos MSL, resultando em uma maior variabilidade no epigenoma. A maioria dos polimorfismos identificados nos seis grupos analisados derivaram da metilação da citosina externa. A frequência de loci metilados variou significativamente entre os grupos de acordo com a combinação seletiva de primers utilizada. Os acessos foram divididos em duas subpopulações, com maior variabilidade epigenética dentro dos grupos investigados. Os marcadores MSAP avaliados indicaram uma diferença epigenética moderada entre as espécies. Os resultados obtidos sinalizaram que existem diferenças nos padrões de metilação entre as espécies que constituem o germoplasma básico da cana-de-açúcar e as cultivares comerciais, podendo esta modificação epigenética ser explorada nos programas de melhoramento da cultura. / The search for renewable energy sources has promoted the interest in one of the main crops explored in Brazil, the sugarcane. Modern sugarcane cultivars derived from interspecific crosses, mainly between Saccharum officinarum and S. spontaneum in which few assessions of these species were involved leading to a narrow genetic base. However, there is a huge genetic and epigenetic variability among the accessions of the “Saccharum complex” that has not yet been explored in the breeding programs. The DNA methylation, one of the main epigenetic modifications that occur in plants, can be quantified by using the MSAP (Methylation sensitive amplification polymorphism) technique. In this context, this study aimed to estimate the epigenetic diversity of S. officinarum, S. spontaneum, S. robustum, S. barberi, Erianthus sp. species and commercial cultivars by using MSAP derived markers. Two DNA samples of each accession were separetly digested with the restriction enzymes EcoRI-MspI and EcoRI-HpaII, ligated to adapters followed by pre-selective and selective amplification. The methylation patterns were estimated by classifying the markers based on the number of MethylationSusceptible Loci (MSL) and Non-Methylated Loci (NML). The dissimilarity relations and variability distribution within and between the accessions was evaluated. A total of 1341 loci were obtained and the diversity was significantly higher in MSL, resulting in a higher variability in the epigenome. Most of the polymorphisms observed in the group of accessions was due to external cytosine methylation.The frequency of methylated loci significantly varied among the groups according to the selective primer combination. The accessions were divided in two subpopulations, with a higher epigenetic variability within the investigated groups. Moderate epigenetic difference among the species was observed. Our results signals differences in methylation patterns among the species that constitute the sugarcane basic germplasm and commercial cultivars, being that this epigenetic modification can be exploited by the sugarcane breeding programs.

SOUSA, J. C. Fatores Reguladores de Interferon (IRFs) em pacientes com Síndrome Mielodisplásica. 2015. 200 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceara, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-26T12:46:52Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_jcsousa.pdf: 1726859 bytes, checksum: b83c00c082a73dcf53401b31ef53acda (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-26T12:47:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_jcsousa.pdf: 1726859 bytes, checksum: b83c00c082a73dcf53401b31ef53acda (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T12:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_jcsousa.pdf: 1726859 bytes, checksum: b83c00c082a73dcf53401b31ef53acda (MD5) Previous issue date: 2015-07-20 / Myelodysplastic Syndrome (MDS) is characterized by peripheral cytopenias, defects in hematopoiesis, increased apoptosis and intramedullary risk of transformation to AML. Various advances have been made in understanding the pathogenesis of MDS and there is evidence that bone marrow failure that occurs in MDS is mediated by abnormal activation of signaling in the innate immune system. Interferon regulatory factors (IRF-Interferon Regulatory Factor) form a family of transcription factors that play a central role in regulating immune responses, differentiation and proliferation of hematopoietic cells, cell cycle regulation, apoptosis, and oncogenesis. It is believed that IRFs may have an important role in the pathogenesis of MDS. Therefore, the objective of this study was to evaluate the profile of methylation and gene expression of IRFs in bone marrow (BM) of patients with MDS. From samples of 119 patients diagnosed with MDS was conducted the study of gene expression by real-time PCR and methylation by QMSP (quantitative methilation specific PCR) of the nine family members of IRFs. The expression of genes IRF2, IRF3, and IRF7 IRF8 were different between BM cells of MDS patients and healthy individuals (P = 0.002, 0.002, 0.028 and 0.016, respectively). IRF1 a higher level of expression was associated in patients with hypocellular marrow (p = 0.018). The IRF3, and IRF7 IRF8 genes have been associated with patients in peripheral blood cytopenias (p = 0.028; 0.001; 0.008, respectively). Furthermore, methylation of IRF1, IRF2, IRF3, IRF6 and IRF8 was associated with higher risk characteristics in SMD, such as advanced forms, unfavorable karyotype, cytopenias, blast above 5% and high-risk categories established by IPSS, IPSS-R and WPSS. Multivariate analysis revealed that patients with higher expression of IRF3 had higher overall survival (p = 0.001), whereas patients with higher expression of IRF5 had 5.4 more likely to progress to AML (p <0.001 95% CI = 1098-26829 ) and 9 times more likely to come to death (p = 0.001, 95% CI 2.39 to 32.69). Ambiguously, patients with methylated IRF5 had 4 times more likely to come to death (p = 0.041, 95% CI 1.066 to 20,192). We can conclude that the expression and methylation of IRFs can have great impact prognosis in this disease. The expression of IRF3 is a favorable prognostic marker, while expression and methylation IRF5 are unfavorable prognostic markers in MDS. / A síndrome mielodisplásica (SMD) é caracterizada por citopenias periféricas, defeitos na hematopoese, aumento da apoptose intramedular e risco de transformação para LMA. Vários avanços têm sido realizados para o entendimento da patogênese da SMD e há evidências de que a falha na medula óssea que ocorre na SMD seja mediada pela ativação anormal da sinalização do sistema imune inato. Os fatores reguladores de interferon (IRF-Interferon Regulatory Factor) formam uma família de fatores de transcrição que possuem um papel central na regulação de respostas imunes, diferenciação e proliferação de células hematopoéticas, regulação do ciclo celular, apoptose e oncogênese. Acredita-se que os IRFs possam ter um papel importante da patogênese da SMD. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o perfil de metilação e expressão dos genes dos IRFs em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD. A partir de amostras de 119 pacientes com diagnóstico de SMD foi realizado o estudo da expressão gênica, por PCR em tempo real e da metilação por QMSP (quantitative methilation specific PCR) dos nove membros da família dos IRFs. A expressão dos genes IRF2, IRF3, IRF7 e IRF8 foram diferentes entre células de MO de pacientes com SMD e indivíduos saudáveis (p=0,002; 0,002; 0,028 e 0,016, respectivamente). Um maior nível de expressão do IRF1 foi associado a pacientes com medula hipocelular (p=0,018). Os genes IRF3, IRF7 e IRF8 foram associados a pacientes com citopenias no sangue periférico (p= 0,028; 0,001; 0,008, respectivamente). Por outro lado, a metilação dos IRF1, IRF2, IRF3, IRF6 e IRF8 foi associada a características de maior risco em SMD, tais como, formas avançadas, cariótipo desfavorável, citopenias, blastos acima de 5% e com categorias de alto risco estabelecidas pelo IPSS, R-IPSS e WPSS. A análise multivariada revelou que pacientes com maior expressão do IRF3 apresentaram maior sobrevida global (p=0,001), enquanto os pacientes com uma maior expressão do IRF5 apresentaram 5,4 mais chances de evoluir para LMA (p<0,001 IC95%=1.098-26.829) e 9 vezes mais chance de vir a óbito (p=0,001; IC95%=2,39-32,69). Ambiguamente, pacientes com o IRF5 metilado possuíam 4 vezes mais chance de vir a óbito (p=0,041; IC95%=1,066-20.192). Podemos concluir que a expressão e a metilação dos IRFs podem ter grande impacto prognóstico nessa doença. A expressão do IRF3 é um marcador de prognóstico favorável, enquanto a expressão e a metilação do IRF5 são marcadores de prognóstico desfavorável em SMD.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Objetivos: O processo de envelhecimento e a maioria das neoplasias podem ser regulados por alterações epigenéticas, dentre elas a metilação do DNA. Este estudo tem como objetivos: a) analisar a frequência de metilação dos promotores dos genes SIRT1; SIRT3, hTERT, SMARCA5, CDH1, IGFBP3, CAV-1 no envelhecimento e no adenocarcinoma gástrico; b) avaliar a expressão das proteínas codificadas desses genes em tecidos gástricos tumoral e normal; c) associar resultados com dados clinicopatológicos da amostra. Métodos: A frequência de metilação desses genes foi analisada por PCR metilação-específica (MS-PCR) em amostras de linfócitos de jovens e idosos, bem como em adenocarcinoma gástrico e margens normais. A análise da expressão protéica foi realizada por imunoistoquímica. Resultados: Os promotores dos genes SIRT1 e IGFBP-3 apresentaram maior metilação em idosos, quando comparado ao grupo jovem. Além disso, dentre os sete genes estudados, cerca de 85% dos idosos apresentaram quatro ou mais desses genes hipermetilados, enquanto que entre jovens mais de 50% apresentou até três genes metilados (p=0,001). A proteína SIRT1 apresentou uma expressão seis vezes maior em tumores do que em tecido não neoplásico (p=0,0003), já SIRT3 apresentou maior expressão em tecido não neoplásico do que em tumoral (OR=0,313; p=0,005). SIRT3 encontrou-se mais frequentemente hipermetilado quando não havia expressão de sua proteína (p=0,0019). O gene hTERT apresentou-se mais frequentemente hipermetilado em amostras tumorais (p=0,0002) e sua expressão protéica foi observada somente em tumores (p<0,0001). SMARCA5 apresentou maior expressão no tecido neoplásico quando comparado com a margem do tecido gástrico (p<0,001) e a expressão de sua proteína estava associada à ausência de metilação do promotor gênico (p=0,0104). Caveolina-1 também foi mais frequentemente observada em tumores quando comparada ao não neoplásico (p<0,0001), principalmente no tipo intestinal (P=0,0008). A metilação do promotor do gene CAV1 foi associada à ausência de expressão em amostras tumorais (p=0,0001). Para IGFBP-3, foi observado ainda maior expressão em tumores do que em tecido não neoplásico (p<0,0001). CDH1 estava presente em 100% das amostras de tecido não neoplásico, diferindo do tumoral (p<0,0001). Conclusões: No processo do envelhecimento natural, ocorre um aumento da metilação em promotores de genes específicos com a idade, que pode influenciar a expressão gênica. Além disso, no câncer gástrico, as proteínas SIRT1, hTERT, SMARCA5, CDH1, IGFBP-3 e CAV1 apresentaram uma maior expressão, podendo configurar bons biomarcadores e possíveis alvos terapêuticos. SIRT3 foi a única proteína com função protetora contra esse tipo tumoral. A regulação epigenética pela metilação do DNA parece ocorrer em tecido gástrico somente para os genes SIRT3, SMARCA5 e CAV1, porém a análise da metilação dos genes hTERT e CDH1 também pode servir como marcador para a neoplasia estudada. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agráricas, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-22T04:08:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334785.pdf: 5476214 bytes, checksum: 01a514e031f6dc667dbbc296f2367b67 (MD5) Previous issue date: 2015 / O abacaxizeiro comercial (Ananas comosus var. comosus), pertencente à família Bromeliaceae, teve iniciada sua domesticação no norte da América do Sul entre 6.000 e 10.000 anos atrás. Em 1492, quando os europeus chegaram às Américas, o abacaxizeiro já estava disperso por toda a América tropical e parte da subtropical. Nos séculos seguintes ele foi espalhado pelo mundo e se consolidou como uma espécie frutífera de importância econômica mundial. A produção comercial desta cultura repousa sobre uma estreita base genética e tem como principais fontes de propágulos mudas reproduzidas vegetativamente, as quais podem disseminar pragas e doenças. Ferramentas biotecnológicas compreendem um expressivo arranjo de tecnologias que podem auxiliar a caracterização, o melhoramento e a multiplicação rápida e massiva de genótipos de abacaxizeiro. Neste sentido, um maior conhecimento sobre a diversidade genética existente na espécie pode possibilitar a expansão da oferta de genótipos para o plantio comercial, ao mesmo tempo em que possibilita uma maior eficiência no planejamento e na execução de programas de melhoramento genético e de conservação de germoplasma. Por sua vez, técnicas de micropropagação possibilitam a propagação rápida e em larga escala de mudas isentas de pragas e doenças a partir de genótipos-elite, configurando alta qualidade fitossanitária e genética. Entretanto, as mudas micropropagadas de abacaxizeiro normalmente apresentam um alto custo quando comparado ao custo das mudas produzidas via reprodução vegetativa convencional. Desta forma, a combinação de altas taxas regenerativas associadas ao emprego do meio de cultura líquido em um protocolo de organogênese convencional em imersão permanente e ao protocolo via culturas nodulares (CN) em sistemas de imersão temporária podem se configurar em avanços expressivos na micropropagação do abacaxizeiro, desde que eles mantenham a fidelidade genética das plantas regeneradas. Levando em conta estes aspectos, a presente tese objetivou: a) analisar o nível de ploidia do abacaxizeiro ?Gigante de Tarauacá?, variedade tradicional do estado do Acre; b) aperfeiçoar o protocolo baseado em CN associadas a sistemas de imersão temporária na fase de crescimento de brotos; c) estudar os níveis de metilação do DNA global (NMDG) e os incrementos de massa fresca (IMF) durante as fases de multiplicação de CN e de diferenciação de CN para microbrotos, bem como avaliar por meio das análises de AFLP, nível de ploidia e de características morfológicas a fidelidade genética das mudas oriundas deste sistema regenerativo; e, d) analisar por meio de características morfológicas a fidelidade genética de plantas jovens e adultas que foram micropropagadas ao logo de sucessivas repicagens via organogênese convencional em imersão permanente e via CN associadas a sistemas de imersão temporária. Os resultados obtidos mostram que: a) a cultivar ?Gigante de Tarauacá? é triplóide (2n=3x=75); b) o sistema de imersão temporária em frascos duplos associado ao meio de cultura livre de fitorreguladores na fase de crescimento de brotos alia alta eficiência regenerativa e sincronismo no desenvolvimento de brotos vigorosos; c) os NMDG apresentaram-se dinâmicos nas duas fases estudadas e estavam associados ao IMF e a idade das culturas, por sua vez, as análises baseadas em AFLP, nível de ploidia e em características morfológicas indicaram que as plantas regeneradas mantiveram-se homogêneas; e, d) plantas de A. comosus var. comosus regeneradas via organogênese convencional e via CN mostraram-se homogêneas entre si, enquanto plantas da var. bracteatus regeneradas via organogênese convencional apresentaram uma maior susceptibilidade à ocorrência de variações morfológicas. Tomados em conjunto, os resultados da presente tese ampliam o conhecimento associado ao uso, conservação e melhoramento do abacaxizeiro.<br> / Abstract : The domestication of commercial Pineapple (Ananas comosus var. comosus), belonging to the Bromeliaceae family, started between 6000 and 10000 years ago in the Guiana?s Shield. In 1492, when Europeans arrived in America, Pineapple was spread in low lands of the tropical America and regions of the subtropical America. In the following centuries Pineapple was spread in the world and was consolidated as one of the world?s most economically important fruit species. The commercial production of this species is based in a narrow genetic base and the conventional vegetative propagation based on suckers allows the dissemination of pest and diseases. Biotechnological tools include an expressive arrangement of technologies that can assist the characterization, the improvement, and the fast and massive micropropagation of selected pineapple genotypes. In this way, a better knowledge about the genetic diversity in this species may allow the expansion of the genotypes used in commercial plantation, at the same time allowing a higher efficiency in the planning and execution of genetic improvement and conservation programs. In turn micropropagation techniques allow the fast and massive production of pest- and disease-free stock plants from elite genotypes, resulting in plantlets with high genetic and phytosanitary quality. However, the micropropagated plantlets present higher costs when compared to the vegetative stocks production costs. In this way, the combination of high regenerative rates associated with permanent immersion in liquid medium for conventional organogenesis or use of temporary immersion with bioreactors for nodule cluster cultures (NC) micropropagation may result in significant advances for pineapple micropropagation. However genetic fidelity must be guaranteed for regenerated plants. Taking these aspects into account, the present thesis aimed at: a) to analyze the ploidy level of pineapple ?Gigante de Tarauacá?, a traditional landrace from Acre state, North Brazil; b) to improve the protocol via NC associated with bioreactors of temporary immersion systems in the phase of shoots elongation; c) to study the global DNA methylation levels (GDML) and the fresh mass increase ratio (FMIR) during NC multiplication and differentiation to microshoots, as well as to evaluate the genetic fidelity through the analyzes of AFLP, ploidy level and morphological characteristics of regenerated plants; d) to analyze the genetic fidelity through morphological characteristics in young and adults plants that were micropropagated over successive subcultures via conventional organogenesis in permanent immersion and via NC associated with temporary immersion systems. The results showed that: a) the cultivar ?Gigante de Tarauacá? is triploid (2n=3x=75); b) the twin flask temporary immersion system associated with culture medium free of plant growth regulation in the phase of shoots elongation combine high regenerative efficiency and synchronism in the development of vigorous shoots; c) the GDML in both phases were dynamics and associated to the FMIR and to the cultures age, in turn, the analysis of AFLP, ploidy level and morphological features indicated homogeneity in the regenerated plants; and d) regenerated plants of A. comosus var. comosus via conventional organogenesis and via NC showed homogeneity between them, while regenerated plants of A. comosus var. bracteatus via conventional organogenesis showed a higher susceptibility to the occurrence of variant plants. Taking together, the results of this thesis expand the knowledge associated with the use, conservation and genetic improvement of pineapple.

Resumo: O câncer de mama é o tipo mais comum e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres no mundo todo. As metástases contribuem com 90% das causas de morte por câncer. O estudo de novos marcadores moleculares de câncer estão em amplo e atual desenvolvimento, tanto para diagnóstico como prognóstico da doença. Diversos estudos tem mostrado o papel de eventos epigenéticos entre eles a metilação do DNA, em regiões promotoras de genes como um evento importante no processo de tumorigênese em diversos tipos de câncer. No câncer de mama já foram descritos um grande número de genes envolvidos com controle da proliferação, adesão e migração celular que podem ser silenciados por mecanismos epigenéticos. O gene CXCL12 codifica para uma quimiocina ou citocina quimiotática, que é comprovadamente silenciado por metilação de sua região promotora em câncer gástrico, de cólon intestinal e de mama. O produto deste gene esta envolvido no processo migratório como molécula ligante de células tumorais que superexpressam o receptor CXCR4 e que migram e colonizam secundariamente pulmões ossos, fígado ou linfonodos que tem altos níveis de CXCL12. Nesse trabalho estudamos detalhadamente a região promotora do gene CXCL12 que contém 5 regiões ricas em dinucleotídeos CpGs (ilhas de CpG). As ilhas de CpG 1 ,2, 3 e 5 foram amplificadas, clonadas e sequenciadas a partir de DNA de sete linhagens tumorais de mama. A ausência ou presença de metilação do DNA de cada região foi correlacionado com a presença ou ausência de expressão do gene CXCL12. A ilha de CpG 1 apresentou-se hipermetilada em linhagens que expressam CXCL12, sendo assim essa região parece não participar do processo de silenciamento desse gene nessas linhagens. A ilha de CpG 2 que contém 1346 pb foi analisada em 2 partes sendo que a parte inicial que contém o nucleotídeo +1 apresentou-se fortemente correlacionada com a expressão do gene. Somente uma linhagem imortalizada, a HB4a apresentou 53,25% de metilação global, o que poderia interferir na expressão do gene. A segunda parte da ilha 2, assim como a ilha de CpG 3 e 5 apresentaram-se hipermetiladas nas linhagens que expressam o gene, e portanto essas regiões provavelmente não interferem na expressão do gene CXCL12 nessas linhagens tumorais. Por outro lado a ilha de CpG 4 localizada a cerca de 1500 pb de distância do início de transcrição e fora da provável região promotora, apresentou-se pouco metilada nas linhagens que expressam o gene e hipermetilada nas linhagens que não expressam CXCL12. Concluímos que as regiões denominadas ilhas de CpG 1 o terço final da Ilha de CpG 2, ilha de CpG 3 e 5 estão metiladas em linhagens que expressam o gene CXCL12 e assim sendo, não são importantes no processo de regulação da expressão desse gene. A Ilha de CpG 4 é a única região diferencialmente metilada e que parece atuar de modo a sinalizar o silenciamento do gene CXCL12.