Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa: Curitiba, 18/11/2014 / Inclui referências / Resumo: As metástases são um grande problema para pacientes com câncer de mama, chegando a ser a causa de 90% dos casos de morte desta neoplasia. A proteína matriz metaloprotease 14 (MMP-14) tem uma importante contribuição no desencadeamento da migração celular nos carcinomas mamários, pela sua atividade proteolítica, e também pela ativação de outras metaloproteases solúveis capazes de degradar componentes da matriz extracelular. Sabe-se que a regulação do gene MMP14 está intimamente relacionada com aspectos epigenéticos, através da metilação de uma ilha de CpG localizada na região promotora. Estudos têm demonstrado que o padrão de metilação ao longo do corpo do gene também pode apresentar um importante papel na regulação da transcrição gênica e, para tanto, o objetivo deste estudo foi verificar o papel da metilação do corpo do gene MMP14 na regulação da expressão em diferentes linhagens tumorais de mama. As linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 e MCF-7 foram avaliadas quanto a expressão do gene estudado por RT-PCR e RT-qPCR. Duas regiões que continham ilhas de CpG, uma localizada na região promotora (-161 a +186) e outra no primeiro íntron do corpo do gene (+242 a +869), foram amplificadas e sequenciadas após o tratamento com bissulfito de sódio. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2 e PMC42 expressam o gene MMP14 e que suas taxas de metilação global, de ambas as ilhas de CpG avaliadas, não passam de 15%. Por outro lado, a linhagem MCF7 foi a única que não expressou o gene MMP14, e apresentou taxas de metilação global que ultrapassam 75%, em ambas as ilhas de CpG. Assim, mostrou-se uma correlação entre a ausência de expressão e alta metilação da ilha de CpG não só da região promotora, mas também da localizada no primeiro íntron. Estes resultados também permitiram a identificação de regiões diferencialmente metiladas nas linhagens de mama para padronização da técnica de MSP-PCR. A linhagem MCF7, quando submetida ao tratamento com os compostos desmetilantes (DAC) e inibidores desacetilantes de histona (TSA), passou a expressar o gene MMP14 e reduziu suas taxas de metilação global, indicando uma estreita relação entre epigenética e regulação deste gene incluindo a região intrônica. Nas regiões desmetiladas pelos tratamentos, foi possível identificar um sítio de ligação do fator de transcrição GLI3, que pode estar auxiliando na expressão de MMP14. Concluímos que a metilação da ilha de CpG localizada no íntron do gene MMP14 parece estar atuando cooperativamente com a região promotora para promover ou silenciar a transcrição do gene. Estudos de metilação no corpo do gene são recentes e, portanto, novos dados podem contribuir para entender a importância da metilação dessas regiões de DNA nos mecanismos de tumorigênese. Palavras-chave: Câncer de mama. MMP-14. Ilha de CpG intrônica. Metilação. / Abstract: Metastasis is a major problem for patients with breast cancer, being the cause of 90% of deaths from this neoplasia. The protein matrix metalloprotease 14 (MMP-14) has a major contribution in the initiation of cell migration in breast carcinomas, due to its proteolytic activity, and also by the activation of other soluble metalloproteases capable of degrading components of the extracellular matrix. It is known that the regulation of the MMP14 gene is closely related to epigenetic events by methylation of a CpG island located in the promoter region. Studies have shown that the methylation pattern along the body of the gene may also have a role in regulating gene transcription and, therefore, the aim of this study was to investigate the role of methylation in the body of MMP14 in regulating the expression of this gene in different breast tumor cell lines. The expression of the gene was evaluated by RT-PCR and RT-qPCR in the HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 and MCF-7 cell lines. Two regions containing CpG islands, one located in the promoter (-161 to +186), and another region in the first intron of the gene body (+242 to +869), were amplified and sequenced after treatment with sodium bisulfite. The results showed that the HB4aC3.6, HB4aC5.2 and PMC42 lines expressed MMP14 and their rates of global methylation of both CpG islands was no more than 15%. On the other hand, the MCF7 line was the only one that did not express the MMP14 gene and presented global methylation rates exceeding 75% in both CpG islands. This showed a correlation between the absence of high expression and methylation of the CpG island not only of the promoter region but also of the first intron. These results also allowed the identification of different methylated regions in breast cancer cell lines for the standardization of MSP-PCR. The MCF7 line, when subjected to treatment with the demethylating compound (DAC) and the inhbitors of histone deacethylating compund (TSA), expressed MMP14 and reduced its rates of global methylation, indicating a close relationship between epigenetics and regulation of this gene including the intronic region. In regions demethylated by the treatment it was possible to identify a binding site of the transcription factor GLI3, which may be promoting the expression of MMP14. We conclude that methylation of the CpG island located in the intron of the MMP14 gene seems to be working cooperatively with the promoter region to permit or silence the transcription of the gene. Studies of methylation in the body of the gene are new, and, therefore, new data can contribute to understand the importance of DNA methylation of these regions in the mechanisms of tumorigenesis. Keywords: Breast cancer. MMP-14. Intronic CpG island. Methylation.

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Coorientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 29/03/2017 / Inclui referências : f. 52-58 / Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais incidente em cadelas não castradas e dentre os fatores envolvidos em sua patogênese está a exposição ao estrógeno e a ação de seu receptor. O receptor de estrógeno-? (RE?) é uma proteína, codificada pelo gene ESR1, amplamente utilizada como marcador molecular de prognóstico para o câncer de mama em mulher, porém na cadela ainda é pouco utilizado. Um dos mecanismos envolvidos na regulação do gene ESR1 em neoplasias mamárias em mulheres é a metilação do DNA, um evento epigenético onde há a adição de um grupamento metil em citosinas ao lado de guaninas. Nos últimos anos vem aumentando o número de trabalhos investigando a expressão da proteína RE? em cadelas, entretanto, ainda são poucos os estudos buscando entender os mecanismos moleculares de regulação do gene ESR1 nestes animais. Neste trabalho, foi avaliada a expressão do gene ESR1 e da proteína em amostras de mama normal, tumores mamários benignos e malignos, bem como verificada a influência da metilação na regulação da expressão deste gene. Neste estudo foram utilizadas quatro amostras de mama normal, oito tumores benignos e nove malignos. Observou-se uma menor expressão do gene ESR1 (p < 0,05) e da proteína RE? (p=0,0037) nos tumores malignos em relação às mamas normais e aos tumores benignos. Embora a correlação encontrada entre mRNA e proteína seja forte e positiva (rho=0,72 e p < 0,05), três das seis amostras RE? negativas (escore zero) apresentaram níveis de mRNA semelhantes aos das amostras RE? positivas classificadas como escore 2 na imuno-histoquímica. Os resultados do sequenciamento evidenciaram um baixo percentual de metilação, sendo observados 2,5% no grupo de mamas normais, 1,9% no grupo receptor de estrógeno positivo e 2,6% no grupo receptor de estrógeno negativo, não havendo diferença estatística entre os grupos (p>0,05). Como não foi evidenciada diferença significativa na metilação entre os três grupos é possível inferir que no câncer de mama canino o gene ESR1 provavelmente não é silenciado por metilação, entretanto estudos com maior número amostral são necessários. Palavras chave: câncer de mama canino, receptor de estrógeno ?, ESR1, metilação do DNA, epigenética / Abstract: The mammary cancer is the most prevalent cancer type in no spayed bitches. Exposure to estrogen and its receptor action is a factor involved in mammary carcinogenesis. The estrogen receptor-? (ER?) is a protein encoded by the gene ESR1 widely used as prognostic biomarker in women breast cancer but poorly used in canine mammary tumor. The DNA methylation is a regulatory mechanism of the gene ESR1 in women breast cancer. It is an epigenetic event where the methyl group is added to a cytosine next to a guanine. In the past few years it has been increasing the number of studies about the ER? expression in bitches, however it still few researches investigating the molecular mechanisms of the ESR1 gene regulation in these animals. The goal of this study was to evaluate the protein and mRNA expression of the ESR1 gene in samples of normal mammary gland, benign and malignant tumors and identify the role of DNA methylation in this gene regulation. It was used samples of four normal mammary gland, eight benign tumors and nine malignant tumors. It was observed a significant lower expression of ER? mRNA (p<0.05) and protein (p=0,0037) in malignant tumors when compared to normal mammary glands and to benign tumors. Although the correlation between mRNA and protein levels was strong and positive (rho=0,72 e p<0,05), three of the six ER? negative samples (score zero) presented mRNA levels similar to ER? positive samples classified as score 2 by immunohistochemistry. The sequencing results showed a low methylation percentage in all samples: 2,5% in normal mammary gland group, 1,9% in positive estrogen receptor group and 2,6% in negative estrogen receptor group. It was not observed significant difference of methylation among the groups (p>0,05). We can infer that in canine mammary tumors the gene ESR1 probably is not silenced by DNA methylation. Further studies with higher number of samples are needed. Key words: canine mammary cancer, estrogen receptor ?, ESR1, DNA methylation, epigenetic

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Co-orientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 02/12/2014 / Inclui referências / Área de concentração / Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente entre as mulheres em todo o mundo. A enzima MMP-2 é uma metaloprotease capaz de degradar o colágeno tipo IV, um dos principais constituintes da matriz extracelular (MEC). Sua função é amplamente descrita por atuar no mecanismo de metástases em diversos tipos de câncer. Estudos recentes demonstraram que a linhagem tumoral de mama MCF7 possui o gene MMP2 regulado por metilação do DNA. Além disso, alguns estudos têm demonstrado que a fibronectina, uma importante proteína constituinte da MEC, é capaz de promover a expressão de MMP-2 em linhagens tumorais de mama. Resultados recentes do nosso grupo mostraram que a linhagem tumoral MCF7 quando tratada com fibronectina por 5 horas sofre 30% de desmetilação da região promotora do gene MMP2. Entretanto, observou-se também que tal processo foi transitório, porque houve a remetilação parcial do promotor quando o estímulo foi retirado. Ainda, a fibronectina induziu o aumento de uma marca de histona no promotor de MMP2 que sinaliza para a ativação da transcrição gênica. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi dar continuidade a esse estudo, avaliando a regulação epigenética do gene MMP2 em linhagens tumorais de mama após o cultivo com fibronectina em diferentes tempos. Para isso, células da linhagem MCF7 submetidas ao tratamento com fibronectina por 8, 12 e 24 horas, e da linhagem MDA-MB-436 por 24 horas, tiveram seus níveis de expressão de MMP2, metilação do DNA e modificações de histonas do promotor do gene avaliados. Na linhagem MCF7, o tratamento por 8, 12 e 24 horas foi capaz de promover o aumento da expressão de MMP2 em 7, 25 e 9 vezes, respectivamente, comparado com o controle, assim como a redução da metilação do promotor de 90% (controle) para 70%, 40% e 52%, respectivamente. O tratamento por 24h também promoveu o aumento da marca de ativação gênica H3K4me3. Ainda, após 12h de cultivo com fibronectina, a linhagem MCF7 aumentou sua capacidade migratória. A fim de verificar se o efeito observado não era exclusivo da linhagem MCF7, foi incluída no estudo a linhagem MDA-MB-436 que foi submetida ao tratamento por 24h, e apresentou aumento na expressão gênica de MMP2 (4 vezes) e redução da metilação do promotor (de 90% para 22%). Por fim, as células tratadas foram mantidas em cultivo sem a fibronectina para avaliar a estabilidade das modificações. Essas células, chamadas de recultivo, apresentaram uma redução na expressão gênica e aumento na metilação do promotor quando comparadas com as células logo após os tratamentos, confirmando o efeito transitório da fibronectina nos eventos epigenéticos, que já tinha sido observado após 5 horas de tratamento. Esses dados corroboram e complementam os mecanismos observados pelo nosso grupo de pesquisa e contribuem para a compreensão dos mecanismos epigenéticos que regulam a expressão de um importante gene associado às metástases tumorais. Palavras-chave: Câncer de mama, MMP-2, epigenética, metilação do DNA. / Abstract: Breast cancer is the most common cancer worldwide among women. The MMP- 2 enzyme is a metalloprotease capable of degrading type IV collagen, a major constituent of the extracellular matrix (ECM). Its function is widely described by acting in the mechanism of metastasis in various cancers. Recent data has shown that the MCF7 breast tumor cell line has the MMP2 gene regulated by DNA methylation. In addition, some studies have shown that fibronectin, an important constituent of the extracellular matrix, is capable of promoting MMP-2 expression in breast tumor cell lines. Recent results from our group showed that fibronectin was able to induce MMP2 expression by a 30% decrease in its promoter methylation in MCF7 tumor cell line. However, it was also noted that this process was transient, because a partial promoter remethylation was observed when the stimulus was removed. Moreover, a histone marker for an open chromatin conformation was significantly increased. Therefore, the aim of this work was to continue evaluating the epigenetic regulation of the MMP2 gene after cultivation of breast tumor cell lines with fibronectin at different times. To this reason, MCF7 cells subjected to treatment with fibronectin for 8, 12 and 24 hours and MDA-MB-436 cells subjected to treatment for 24 hours, were evaluated by the levels of MMP2 expression, gene promoter DNA methylation and histone modifications. In the MCF7 cell line, treatments for 8, 12 and 24 hours were able to promote 7, 9 and 25-fold increase in MMP2 expression, respectively, compared with the mock. In addition, promoter methylation was reduced from 90% (control) to 70%, 40% and 52%, respectively. Treatment for 24h also promoted an increase of the histone open chromatin conformation marker H3K4me3. Moreover, the migratory capacity of MCF7 cells treated for 12h was increased. In order to confirm the fibronectin effect, the MDA-MB-436 cell line was subjected to 24h fibronectin treatment, which showed an increase in MMP2 gene expression (4-fold) and a reduction of promoter methylation (from 90% to 22%). Finally, the treated cells were kept in culture without fibronectin to evaluate the modifications stability. These cells (recultivation) showed a gene expression reduction and promoter methylation increased when compared to the cells after treatments, confirming the fibronectin transient effect observed after the 5h treatment. These data support and complement the mechanisms observed by our research group and contribute to understand the epigenetic mechanisms that regulate the expression of an important gene associated with tumor metastasis. Keywords: Breast cancer, MMP-2, epigenetics, DNA methylation.

A Doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum na atualidade. Cerca de 10% dos casos da doença estão relacionados com fatores genéticos e os outros 90% são devido a fatores ambientais e epigenéticos. Evidências indicam alterações na metilação de genes relacionados ao desenvolvimento da doença de Parkinson. No entanto, não se sabe o efeito de inibidores da metilação de DNA sobre a neurotoxicidade induzida por MPP+, uma neurotoxina que mimetiza processos neurodegenerativos associados ao Parkinson in vitro. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos inibidores da metilação de DNA (RG108, n-ftaloil-l-triptofano e 5azadC, 5-aza-2´-deoxycytidina) e do doador universal de grupamentos metil (SAM, S-adenosilmetionina) sobre neurotoxicidade induzida por MPP+ em cultura de células imortalizadas (PC12), por meio da análise da viabilidade celular avaliada no teste do MTT (3 - [4,5 dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio); e da análise de neuritogênese, na presença e na ausência de MPP+. Os resultados demonstraram que: 1. o tratamento com DNMTi (inibidor da DNA metiltransferase) ou com SAM induziram efeito per se sobre a viabilidade celular, apenas quando incubados em altas concentrações e em perídos prolongados (24h); 2. não modificaram a morte celular induzida pelo MPP+, em baixas concentrações, mas agravaram a neurotoxicidade quando incubados em altas concentrações ou por períodos prolongados (24h); 3. essas drogas induziram neuritogênese per se e potencializaram a neuritogênese induzida pelo NGF (fator de crescimento neural); 4. protegeram parcialmente contra a diminuição da neuritogênse induzida pelo MPP+. O conjunto de dados sugere que tanto os DNMTi quanto o SAM podem ser citotóxicos, dependen de suas concentrações e do tempo de exposição à droga. No entanto, essas drogas são capazes de aumentar a neuritogênese (diferenciação celular) e proteger contra a neurotoxicidade celular induzida pelo NGF, em células diferenciadas. / Parkinson\'s disease is the second most common neurodegenerative disease nowadays. About 10% of the disease cases are related to genetic factors and the other 90% are due to environmental and epigenetic factors. Evidence indicates changes in DNA methylation in genes related to the development of Parkinson\'s disease. However, the effect of DNA methylation inhibitors on MPP+-induced neurotoxicity, a drug that mimics neurodegenerative processes associated with Parkinson\'s in vitro, is not known. The aim of this study was to evaluate the effect of DNA methylation inhibitors (RG108, N-phthalyl-L-tryptophan and 5azadC, 5-aza-2?-deoxycytidine) and of the universal donor of methyl group (SAM, S-adenosyl methionine) on: 1. MPP+ -induced neurotoxicity in culture of immortalized cells (PC12), by analysis of cell viability in the MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium) test; 2. neuritogenesis, in the presence and absence of MPP +. Results indicated that: 1. treatment with DNMTi or SAM induced effects per se on cell viability only at higher concentrations and after prolonged periods of incubation (24h); 2. DNMTi (DNA methyltransferase inhibitors) and SAM increased cell differentiation and neuritogenesis per se, especially when incubated for 30 minutes, as well as they potentiated NGF-induced neurogenesis; 3. the drugs attenuated MPP+-induced effects on neuritogenesis. Altogether, these data suggests short treatment with both DNMTi and SAM do not cause cellular cytotoxicity (cell death), but are able to increase neuritogenesis (cell differentiation) and protect against MPP+-induced neurotoxicity in differentiated cells.

Modificações epigenéticas tais como metilação do DNA, constituem um mecanismo especial de regulação da expressão gênica envolvido em muitas situações patológicas. Padrões alterados de metilação do DNA são comuns em cânceres e infecções virais. A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção fúngica sistêmica, causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O Brasil é detentor do maior número de casos na América do Sul. A doença apresenta envolvimento pulmonar primário com disseminação para mucosa oral, pele, sistema retículo-endotelial e glândulas suprarrenais. As lesões orais são caracterizadas por hiperplasia eritematosa finamente granular, salpicadas com hemorragias pontuais chamadas de estomatite moriforme. A finalidade deste estudo foi identificar perfis diferenciais de metilação do DNA em pacientes com e sem lesão oral na PCM. A identificação destes perfis foi baseada na estratégia de MS-AP-PCR (Amplificação arbitrária sensível a metilação). O DNA, extraído do sangue total de pacientes com e sem lesão oral, foi digerido com as enzimas de restrição Hpa II e Msp I. Os produtos da digestão foram amplificados pela técnica de PCR, utilizando iniciadores arbitrários. Foi obtido um perfil diferencial de metilação após a amplificação do DNA de pacientes sem lesão de boca, comparado ao perfil de pacientes com lesão de boca. A banda diferencialmente expressa foi purificada, clonada e os plasmídeos obtidos P5, P6 e P7 foram analisados pelo software PhredPhrap e na ferramenta BLASTN para a obtenção de dados de mapeamento e identidade com as sequências presentes no genoma humano. O fragmento clonado no plasmídeo P5 apresentou similaridade com uma sequência de DNA presente no cromossomo 20, próxima ao gene YTHDF1. Os fragmentos clonados nos plasmídeos P6 e P7 apresentaram similaridade com sequências de DNA presentes no cromossomo 15, sendo que o fragmento P6 apresentou similaridade com uma sequência intrônica do gene RNA binding protein with multiple splicing 2” (RBPMS2) e o fragmento P7 com uma sequência intrônica do gene “diphthamine biosynthesis 6” (DPH6)”. A expressão do gene YTHDF1 em leucócitos foi testada por PCR em tempo real e não houve diferença significativa nos dois grupos de pacientes. Ainda não há descrição na literatura da correlação do gene YTHDF1 com a PCM tornando este estudo inédito e mostrando a importância da análise epigenética para conhecimento dos mecanismos celulares nas condições normais e também patológicas. / Epigenetic changes such as DNA methylation is a specific mechanism for the regulation of gene expression involved in many pathological situations. Altered patterns of DNA methylation are common in cancers and viral infections. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection caused by a thermo-dimorphic fungus, Paracoccidioides brasiliensis. Brazil is having the largest number of cases in South America. The disease presents primary pulmonary involvement that spreads to oral mucus, skin, reticuloendothelial system, and adrenals. Oral lesions are characterized by erythematous fine granular hyperplasia, and speckled with occasional bleeding called moriform stomatitis. The purpose of this study was to identify profiles of different DNA methylation in patients with and without oral lesions in PCM. The identification of these profiles was based on the strategy of MS-AP-PCR (Methylation-Sensitive arbitrarily Primed PCR). The DNA extracted from whole blood of patients with and without oral lesions was digested with restriction enzymes: Hpa II and Msp I. The digestion products were amplified by PCR (polymerase chain reaction) using arbitrary primers. We obtained a differing profile after amplifying the DNA from patients without mouth lesions compared to the profile of patients with mouth lesions from agarose gel electrophoresis. The differently expressed band was purified and cloned, and the obtained plasmids, P5, P6 and P7, were analyzed by the softwares PhredPhrap and BLASTN tool to obtain mapping data and identify the sequences present in the human genome. The cloned fragment in the plasmid P5 showed similarity with a DNA sequence present in chromosome 20, next to the gene YTHDF1. The fragments cloned in plasmids P6 and P7 showed similarity with the DNA sequences present on chromosome 15, the P6 fragment showed similarity with an intronic sequence from the gene, “RNA binding protein with multiple splicing 2 "(RBPMS2), and the P7 fragment showed similarity with the intronic sequence of the gene "diphthamine biosynthesis 6" (DPH6) ".biosynthesis 6" (DPH6)". The YTHDF1 gene expression in leukocytes was tested by real-time PCR and no significant difference were found in both groups of patients. There is no description in the literature relating the YTHDF1 gene with PCM which has shown the importance of study epigenetic for understanding the cellular mechanisms under normal and pathological conditions.

A dengue é uma infecção viral sistêmica, autolimitada, transmitida para os humanos através da picada de mosquitos fêmeas infectadas do gênero Aedes sp. Trata-se de uma doença com grandes impactos na economia e na saúde pública, e estima-se que entre 50 a 100 milhões novas infecções ocorram anualmente em mais de 100 países. A dengue é causada pelo Dengue virus (DENV), um vírus pertencente à família Flaviviridae, com genoma composto de uma única molécula de RNA, fita simples com polaridade positiva. A infecção pelo DENV pode ser assintomática ou apresentar diferentes manifestações clínicas, como febre do dengue (FD), febre hemorrágica do dengue (FHD) e Síndrome do Choque do dengue (SCD). Dados da literatura indicam que algumas infecções virais podem causar alterações epigenéticas em seus hospedeiros, principalmente a metilação do DNA. Assim, o propósito deste trabalho foi investigar a influência da infecção pelo DENV no perfil global de metilação dos pacientes, através da técnica de MethELISA, e analisar o padrão de metilação no promotor dos genes fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon gama (IFN-γ). Os resultados obtidos indicam uma tendência na diminuição do percentual relativo de metilação após a infecção pelo DENV, sugerindo uma influência da infecção viral nos mecanismos epigenéticos do hospedeiro. Observou-se também uma maior taxa de desmetilação do promotor do TNF-α dos pacientes infectados em relação ao grupo controle. Em relação ao IFN-γ, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene entre os dois grupos analisados. A meta-análise de microarranjos de DNA obtidos de pacientes infectados pelo DENV indica um aumento na expressão dos genes da Timina DNA Glicosilase (TDG) e das DNA Metiltransferases 1 e 3 (DNMT1 e DNMT3) nos pacientes infectados. Estes dados sugerem que o DENV é capaz de interferir com os mecanismos epigenéticos do hospedeiro. / Dengue fever is a systemic viral infection, self-limited, transmitted to humans through the bite of infected female mosquito from Aedes genus. It is a disease with major impacts on the economy and public health, and it is estimated that between 50 to 100 million new dengue infections occur annually in more than 100 countries. Dengue fever is caused by Dengue virus (DENV), a single strand positive sense RNA virus belonging to the Flaviviridae family. The DENV infection may be asymptomatic or present different clinical manifestations, such as dengue fever (DF), hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS). Published data indicate that some viral infections can cause epigenetic changes in their hosts, especially in the DNA methylation. Thus, the aim of this study was to investigate the influence of DENV infection in global methylation profile of DENV infected patients by MethELISA technique, and analyze the pattern of methylation in the promoter of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interferon gamma (IFN-γ) genes. The results obtained show a decrease the relative methylation percentage after DENV infection, suggesting an influence of viral infection in the epigenetic mechanisms of the host. There was also detected a higher rate of demethylation of TNF-α promoter in infected patients if compared to the control group. No difference was found in the methylation frequency between the two analyzed groups regarding the IFN-γ promoter. Meta-analysis of DNA microarray indicates that patients infected with DENV shows an increase in the expression of Thymine DNA Glycosylase (TDG) and DNA methyltransferases 1 and 3 (DNMT1 and DNMT3) genes, all involved in epigenetic regulation. So, these data indicated that DENV is able to interfere with the host epigenetic mechanisms. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora a resistência ao anoikis seja considerada um importante processo envolvido no fenótipo maligno, a relação causal entre transformação neoplásica e crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa correlação, foi desenvolvido em nosso laboratório um modelo experimental de transformação maligna de melanócitos murinos, em que melanócitos melan-a foram submetidos a ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo, foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermediárias da progressão tumoral como linhagens de melanoma, as quais são progressivamente resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progressão tumoral. Análises de expressão gênica mostraram aumento da expressão de Timp1 nas linhagens de melanoma quando comparadas à linhagem parental de melanócitos. Ainda que descrita como inibidora de MMPs, essa proteína foi recentemente associada à resistência ao anoikis em células epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste trabalho: 1) a relação entre expressão de Timp1 e aquisição do fenótipo resistente ao anoikis e 2) a possível regulação epigenética da expressão de Timp1 por metilação de DNA neste modelo. Enquanto células melan-a expressam baixos níveis de Timp1, todas as linhagens derivadas desta expressam níveis elevados desta proteína. O tratamento dos melanócitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina resultou em aumento significativo da expressão de Timp1. De fato, a análise pelo ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou aumento progressivo na desmetilação do gene Timp1 em paralelo a sua crescente expressão ao longo da transformação maligna. A superexpressão de Timp1 em células melan-a resultou no aumento da sobrevivência das mesmas em condições independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transformá-las. Além disso, o tempo de latência para o aparecimento de tumores foi menor para células de melanoma transfectadas com Timp1, indicando que esta molécula pode estar associada com a agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expressão de Timp1 durante a transformação maligna, em decorrência da desmetilação gênica progressiva, associado ao aumento da resistência ao anoikis, mas não à aquisição de um fenótipo maligno transformado. / Although anoikis resistance has been considered a hallmark of malignant phenotype, the causal relation between neoplastic transformation and anchorageindependent growth remains undefined. We developed an experimental model of murine melanocyte malignant transformation, where a murine melanocyte lineage (melan-a) was submitted to sequential cycles of substrate adhesion blockade. Cells corresponding to intermediate phases of tumor progression and melanoma cell lines were established and show progressive anoikis-resistance. Gene expression analysis showed up-regulation of Timp1 in all melan-a-derived lineages. Treatment with a demethylating agent resulted in marked expression of Timp1 in melan-a melanocytes. In fact, Ms-SNuPE analysis showed increased demethylation in Timp1 gene in parallel with its expression along malignant transformation. Although described as a MMP inhibitor, this protein has been recently associated with apoptosis resistance in human breast epithelial cells. Melan-a cells overexpressing the Timp1 gene showed increased survival in anchorage-independent conditions, but were unable to form tumors in vivo, whereas Timp1-overexpressing melanoma cells showed reduced latency time for tumor appearance. Our results show an increment in Timp1 expression along carcinogenesis, possibly associated to a progressive gene demethylation, which is causally related with an increase in anoikis-resistance but not with the acquisition, by itself, of a fully transformed malignant phenotype. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pos-Graduaçao em Bioquímica, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-06-26T01:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317199.pdf: 1995162 bytes, checksum: c5f2bf6816dc29a5ca478c754678dd4b (MD5) / O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica de etiologia múltipla caracterizada por hiperglicemia persistente, decorrente da falta de insulina e/ou da resistência dos tecidos a ação do hormônio. Estima-se que até o ano de 2030, cerca de 552 milhões de indivíduos no mundo estejam acometidos por esta doença. A alta morbidade e mortalidade característica desta condição estão fortemente associadas ao desenvolvimento de alterações patológicas na vasculatura. Estas alterações parecem estarem relacionadas com mudanças epigenéticas, que ocorrem nas fases iniciais do DM e favorecem a expressão patológica de determinados genes, provocando desta forma danos irreversíveis no organismo mesmo que a glicemia seja controlada posteriormente. Desta forma o objetivo deste trabalho foi melhor entender o efeito do estrito controle da glicemia, pela administração de insulina, em animais que desenvolveram hiperglicemia através da administração de estreptozotocina (STZ) sobre parâmetros metabólicos, alterações a nível de DNA, expressão gênica, sinalização celular de proteínas relacionadas à insulina, e conteúdo mitocondrial em sangue ou cérebro de ratos Wistar. Os resultados deste estudo mostraram que os animais que receberam STZ se tornaram hiperglicêmicos e hiperlipidêmicos por um marcado prejuízo na arquitetura das ilhotas de Langerhans, que como consequência provocou o comprometimento na síntese do hormônio insulina. Estas alterações metabólicas periféricas, que foram acompanhadas por uma marcada redução do peso corporal, desencadearam uma série de eventos no sistema nervoso central, principalmente evidenciados por i) redução na expressão genica hipocampal da insulina e da citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10); i) manutenção da fosforilação de proteínas alvos do receptor da insulina, como o substrato do receptor da insulina -1 (IRS-1) e Akt no córtex cerebral; iii) aumento no número de mitocôndrias no bulbo olfatório; e iv) hipermetilação do DNA em hipocampo. As alterações sobre a expressão de IL-10 e de hipermetilação no sistema nervoso central destes animais, foi prevenido/revertido com pela administração com insulina. A partir destes dados as seguintes conclusões podem ser formuladas: i) no cérebro existe um metabolismo de síntese, produção e sinalização de insulina independente do periférico e com objetivos diferentes; ii) o controle da glicemia mediante pela administração de insulina previne das alterações epigenéticas decorrentes da hipermetilação do DNA; iii) a melhor caracterização do modelo de hiperglicemia induzido por STZ aqui realizada permitirá a sua utilização em diferentes desafios metabólicos.<br> / Abstract : Diabetes mellitus (DM) is a metabolic syndrome of multiple etiologies characterized by persistent hyperglycemia resulting from lack of insulin and/or resistance of tissues to the hormone action. It is estimated that in 2030, nearly 552 million individuals in the world will be affected by this disease. The high morbidity and mortality characteristic of this entity are known to be strongly associated with the development of pathological changes in the vasculature. These changes seem to be related to epigenetic modulations, which occur in the initial stages of diabetes and promote the pathological expression of certain genes, thus resulting in irreversible damage in the organism, even when the blood glucose is subsequently controlled. In this scenario, the main objective of this project was to better understand the effect of the strict glycaemia control by the administration of insulin, on biochemical metabolic measurements, DNA methylation, genic expression and cell signaling of proteins related to insulin, and the content of mitochondria in blood or brain of streptozotozin (STZ)-induced hyperglycemic animals. It was here observed, that animals receiving STZ showed an altered islets of Langerhans architecture that provoked reduced blood insulin concentration, hyperglycemia and hyperlipidemia, and marked bodyweight lost. These peripheral chronic metabolic alterations elicited a series of events in the central nervous system (CNS) characterized by: i) reduced gene expression of hippocampal insulin and interleukin-10 (IL-10); ii) correct phosphorylation of target proteins of the insulin receptors, including insulin receptor substrate-1 (IRS-1) and Akt in the cerebral cortex; iii) increased number of mitochondria in the olfactory bulbs; and iv) increased DNA methylation in hippocampus. The alterations linked to reduced IL-10 expression and DNA methylation were significantly prevented and/or reverted by the exogenous insulin. According to these data, the following conclusions could be formulated: i) there is a peripheral independent insulin metabolism in the CNS, with specific objectives for insulin synthesis, maturation and signaling; ii) the insulin-induced control of hyperglycemia prevents from epigenetic alterations; iii) this better characterization of the STZ-induced hyperglycemia animal model will allow further utilization for different metabolic challenges.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317842.pdf: 1874621 bytes, checksum: 1625556e3bf30951e00ec4f3cd4b2d07 (MD5) Previous issue date: 2013 / O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma espécie tropical com tem um elevado valor económico, é o principal elemento na produção de chocolate o alto conteúdo de polifenóis o há posicionado como um produto antioxidante. O cacaueiro a além de ser um dos principais componentes econômicos nas regiões onde é cultivado exerce também um importante papel na preservação ambiental. No entanto, às características botânicas que esta espécie apresenta, associadas a um alto grau de auto-incompatibilidade, os plantios comerciais apresentam alta heterozigosidade genética, afetando diretamente a produtividade do seu cultivo, gerando assim a necessidade dos melhores genótipos serem propagados assexuadamente. Por estão razão, a embriogênese somática se configura como alternativa eficiente para a propagação de genótipos elite, permitindo a captura e fixação de ganhos genéticos. A técnica de cultura de tecidos, como a embriogênese somática tem sido rotineiramente usada tanto como uma técnica de propagação clonal de plantas, bem como um modelo válido para investigar eventos estruturais, fisiológicos e moleculares que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário. No presente trabalho buscou-se avaliar a resposta embriogênica e capacidade de formar embriões somáticos dos genótipos do grupo genético Nacional, visando estabelecer um protocolo de propagação baseado na embriogênese somática. Assim, também integraram-se duas técnicas como a quantificação do padrão de metilação do DNA de embriões e das plântulas obtidas durante a embriogênese somática, assim como também a elaboração de um perfil proteômico dos embriões somáticos formados durante a embriogênese somática de Theobroma cacao L. Propondo-se identificar a relação da metilação DNA e a capacidade conversão dos embriões somáticos, visto que a metilação do DNA é um dos mediadores chave no mecanismo epigenético associado ao desenvolvimento embrionário. Neste contexto, o presente trabalho foi estruturado em capítulos, para facilitar a compreensão dos resultados obtidos. O primeiro capítulo consiste no estado da arte e situação do problema, no qual a traves de uma revisão bibliográfica se trata de mostrar aspectos relevantes de Theobroma cacao L., da embriogênese somática, da metilação do DNA e da proteômica em plantas. O segundo capítulo consiste na avaliação da resposta dos genótipos de grupo Nacional à embriogênese somática. O terceiro capítulo relaciona aos níveis de metilação do DNA global em embriões somáticos formados durante a embriogênese somática secundaria e as plântulas obtidas durante a conversão e o quarto aborda a proteômica comparativa como uma ferramenta para identificar proteínas relacionadas com a capacidade de conversão dos embriões somáticos de Theobroma cacao L.<br>

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:15Z : No. of bitstreams: 1 000869033_20170527.pdf: 824646 bytes, checksum: 00f5f8bbdd7abcbefcbd2d042d519568 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-06-02T11:56:26Z: 000869033_20170527.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-06-02T11:57:14Z : No. of bitstreams: 1 000869033.pdf: 3301498 bytes, checksum: de14b09badf78ded8a950b747525f42b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia mais comum do sistema endócrino. O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) compreende 80-85% dos casos, seguido dos carcinomas foliculares (CFT), pouco diferenciados (CPDT) e anáplasicos (CAT). O diagnóstico dos CT, principalmente nos casos bem diferenciados, ainda é um desafio devido a semelhanças morfológicas compartilhadas por esses tumores e lesões benignas (LBT). O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil de metilação do DNA para identificar marcadores epigenéticos envolvidos no desenvolvimento das lesões benignas e dos diferentes subtipos histológicos de carcinomas. Além disso, buscou-se identificar marcadores prognósticos nos CT. Foram incluídos nesse estudo 17 lesões benignas da tireoide (8 adenomas, 6 bócios tireoideanos e 3 tireoidites), 60 CPT, 8 CFT, 2 carcinomas de células de Hurthle (CCH), 1 CPDT e 3 CAT, além de 50 tecidos não neoplásicos (TN) obtidos dos pacientes que tiveram CPT. As análises de metilação diferencial foram realizadas utilizando a plataforma microarray Infinium® Human Methylation450 BeadChip (Illumina). Na primeira etapa do estudo, os resultados obtidos de sondas diferencialmente metiladas foram utilizados na construção de um algoritmo útil como classificador diagnóstico. Na segunda etapa, o perfil de metilação do DNA das lesões benignas e dos diferentes subtipos tumorais foi comparado aos dados de tecidos não neoplásicos. Somente sondas significativamente alteradas no presente estudo e aquelas confirmadas no GEO (Gene Expression Omnibus) foram selecionadas para a construção de algoritmos. Foram delineados três algoritmos diagnósticos baseados na metilação diferencial de nove sondas selecionadas a partir de área abaixo da curva de 0,75 para o classificador de LBT e 0,90 para os classificadores CFT e CPT além de análise multivariada. Foram também aplicados métodos lineares de classificação. A aplicação do algoritmo... / Thyroid cancer (TC) is the most prevalent type of endocrine cancer. Papillary thyroid carcinoma (PTC) comprises 80-85% of the diagnosed thyroid cancers, followed by follicular (FTC), poorly differentiated (PDTC) and anaplastic carcinomas (ATC). Diagnosis of thyroid carcinomas, especially of well-differentiated carcinomas is a challenge due to morphological similarities between these tumors and benign lesions. The aim of this study was to evaluate the methylation profile to identify diagnostic markers involved in benign lesions and in different histological subtypes of carcinomas. Moreover, a search for reliable molecular prognostic markers was also performed in TC. The study included 17 benign lesions (8 adenomas, 6 goiters and 3 thyroiditis), 60 PTCs, 8 FTCs, 2 Hürthle cell carcinomas (HCC), 1 PDTC and 3 ATC, as well as 50 non-neoplastic tissues (NT) obtained from patients who had PTC. Differential methylation analyzes were performed using the Infinium® Human Methylation450 BeadChip microarray (Illumina). In the first stage of the study, the results of differentially methylated probes were used in the development of diagnostic classifier algorithm. In second step, the methylation profile of benign lesions and tumor subtypes was compared to data from non-neoplastic tissues. Only probes significantly altered in the current study and those confirmed by GEO data (Gene Expression Omnibus) were selected for the development of the algorithms. Three diagnostic algorithms were developed based on differential methylation of nine probes selected from area under the curve of 0.75 for BTL classifier and 0.90 for FTC and PTC classifiers and multivariate analysis. It was also applied linear classification methods. Application of the algorithm diagnosis allowed the correct classification of non-neoplastic tissues, benign and malignant lesions (sensitivity: 91.9% and specificity: 76.5%). The same strategy was performed using the GEO database...