Orientador: Silvia Regina Rogatto / Banca: Patricia Pintor dos Reis / Banca: Miriam Galvonas Jasiulionis / Banca: Janete Maria Cerutti / Banca: Sandra A. Drigo Linde / Resumo: O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia mais comum do sistema endócrino. O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) compreende 80-85% dos casos, seguido dos carcinomas foliculares (CFT), pouco diferenciados (CPDT) e anáplasicos (CAT). O diagnóstico dos CT, principalmente nos casos bem diferenciados, ainda é um desafio devido a semelhanças morfológicas compartilhadas por esses tumores e lesões benignas (LBT). O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil de metilação do DNA para identificar marcadores epigenéticos envolvidos no desenvolvimento das lesões benignas e dos diferentes subtipos histológicos de carcinomas. Além disso, buscou-se identificar marcadores prognósticos nos CT. Foram incluídos nesse estudo 17 lesões benignas da tireoide (8 adenomas, 6 bócios tireoideanos e 3 tireoidites), 60 CPT, 8 CFT, 2 carcinomas de células de Hurthle (CCH), 1 CPDT e 3 CAT, além de 50 tecidos não neoplásicos (TN) obtidos dos pacientes que tiveram CPT. As análises de metilação diferencial foram realizadas utilizando a plataforma microarray Infinium® Human Methylation450 BeadChip (Illumina). Na primeira etapa do estudo, os resultados obtidos de sondas diferencialmente metiladas foram utilizados na construção de um algoritmo útil como classificador diagnóstico. Na segunda etapa, o perfil de metilação do DNA das lesões benignas e dos diferentes subtipos tumorais foi comparado aos dados de tecidos não neoplásicos. Somente sondas significativamente alteradas no presente estudo e aquelas confirmadas no GEO (Gene Expression Omnibus) foram selecionadas para a construção de algoritmos. Foram delineados três algoritmos diagnósticos baseados na metilação diferencial de nove sondas selecionadas a partir de área abaixo da curva de 0,75 para o classificador de LBT e 0,90 para os classificadores CFT e CPT além de análise multivariada. Foram também aplicados métodos lineares de classificação. A aplicação do algoritmo... / Abstract: Thyroid cancer (TC) is the most prevalent type of endocrine cancer. Papillary thyroid carcinoma (PTC) comprises 80-85% of the diagnosed thyroid cancers, followed by follicular (FTC), poorly differentiated (PDTC) and anaplastic carcinomas (ATC). Diagnosis of thyroid carcinomas, especially of well-differentiated carcinomas is a challenge due to morphological similarities between these tumors and benign lesions. The aim of this study was to evaluate the methylation profile to identify diagnostic markers involved in benign lesions and in different histological subtypes of carcinomas. Moreover, a search for reliable molecular prognostic markers was also performed in TC. The study included 17 benign lesions (8 adenomas, 6 goiters and 3 thyroiditis), 60 PTCs, 8 FTCs, 2 Hürthle cell carcinomas (HCC), 1 PDTC and 3 ATC, as well as 50 non-neoplastic tissues (NT) obtained from patients who had PTC. Differential methylation analyzes were performed using the Infinium® Human Methylation450 BeadChip microarray (Illumina). In the first stage of the study, the results of differentially methylated probes were used in the development of diagnostic classifier algorithm. In second step, the methylation profile of benign lesions and tumor subtypes was compared to data from non-neoplastic tissues. Only probes significantly altered in the current study and those confirmed by GEO data (Gene Expression Omnibus) were selected for the development of the algorithms. Three diagnostic algorithms were developed based on differential methylation of nine probes selected from area under the curve of 0.75 for BTL classifier and 0.90 for FTC and PTC classifiers and multivariate analysis. It was also applied linear classification methods. Application of the algorithm diagnosis allowed the correct classification of non-neoplastic tissues, benign and malignant lesions (sensitivity: 91.9% and specificity: 76.5%). The same strategy was performed using the GEO database... / Doutor

Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2015-05-08T14:45:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO MESTRADO NARA BARBOSA.pdf: 2438195 bytes, checksum: f37491db6e785b1379cc05dba0df0017 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-08T14:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO MESTRADO NARA BARBOSA.pdf: 2438195 bytes, checksum: f37491db6e785b1379cc05dba0df0017 (MD5) Previous issue date: 2015-03-31 / FACEPE / O câncer de mama é o câncer mais comum e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres, em todo o mundo. Diferentes mutações têm sido relacionadas ao câncer, mas apenas as mutações não conseguem esclarecer a heterogeneidade do câncer de mama. Desta forma, eventos epigenéticos têm sido estudados em tecido mamário cancerígeno. A metilação do DNA é a regulação epigenética mais estudada e bem compreendida, sendo catalisado pelas enzimas da família das DNA Metiltransferases; principalmente DNMT1, DNMT3A, e DNMT3B. Além disso, DNMT2 (TRDMT1), inicialmente considerada como um membro desta família foi mais tarde descrita como uma tRNA metiltransferase e, até o momento, pouco se sabe sobre a sua função. O objetivo deste estudo foi determinar o perfil de metilação do DNA em 31 pacientes com câncer de mama ductal invasivo e 04 tecidos saudáveis obtidos a partir da mama oposta. Os níveis globais de metilação foram observados por meio de um ensaio de ELISA, enquanto que os níveis de expressão das DNMTs (DNMT1, DNMT2 e DNMT3B) foram determinados por PCR em tempo real. Os níveis de expressão gênica também foram analisados para BRCA1, BRCA2, ERBB2 e ERBB4. Todos estes parâmetros foram correlacionados com os dados dos pacientes e as características intrínsecas dos tumores. Nossos resultados mostram que a metilação global em tumores de mama é significativamente menor em comparação com os tecidos saudáveis da mama (p = 0,0034). DNMT1 e DNMT3B foram mais expressos no tecido de carcinoma mamário (p = 0,0034; p = 0,0031, respectivamente), sendo o nível de DNMT3B significativamente maior (p = 0,0391) do que o nível de DNMT1. Apenas DNMT1 exibiu uma correlação com a metilação global, apesar de ser inversa. Além disso, a expressão das DNMTs apresentou uma forte correlação positiva com BRCA1 e apenas a DNMT2 mostrou estar relacionada com BRCA2. Pacientes submetidos a terapias adjuvantes apresentaram uma diminuição significativa na expressão de DNMT2 (p = 0,0013), indicando uma redução dos níveis de metilação em moléculas de tRNA. História familiar de câncer de mama foi a única variável independente que se correlacionou com os níveis de DNMT1 (p = 0,0043), sendo maior em pacientes com risco hereditário. Nossos resultados apontam para um importante papel das DNMTs no câncer de mama e mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos subjacentes envolvidos no processo de metilação que contribuem para o desenvolvimento e progressão do câncer de mama. / Breast cancer is the most common cancer and the leading cause of cancer deaths among women worldwide. Different mutations were related to breast cancer, but only their presence cannot explain de heterogeneity of this cancer. Then, epigenetic events have been studied in breast cancer tissues. DNA methylation is the most studied and well-understood epigenetic regulation, being catalysed by DNA methyltransferases family; mainly DNMT1, DNMT3A, and DNMT3B. Besides, DNMT2 (TRDMT1), initially thought to be a member of this family, was later described as a RNA methyltransferase and so far, little is known about its function. The aim of this study was to determine the DNA methylation profile in 31 patients with Invasive Ductal Breast Cancer and 04 healthy tissues obtained from the opposite breast. Tests were performed for global methylation levels through an ELISA assay and for the expression levels of DNMTs (DNMT1, DNMT2 and DNMT3B) by real-time PCR. Gene expression was also analysed for BRCA1, BRCA2, ERBB2 and ERBB4. All these parameters were correlated with patient‘s data and intrinsic characteristics of the tumours. Our results show that global methylation in breast tumours is significant lower compared to breast healthy tissues (p= 0.0034). DNMT1 and DNMT3B (p=0.0034; p=0.0031, respectively) showed high expression in breast cancer tissue, being DNMT3B level significantly higher (p=0.0391) than DNMT1 level. Only DNMT1 exhibit a correlation with the global methylation, despite inversely related. In addition, DNMTs presented a tightly positive correlation with BRCA1 and only DNMT2 seems to be related with BRCA2. Patients submitted to adjuvant therapies showed a significant decrease in DNMT2 expression (p=0.0013), indicating reduced methylation levels in tRNA molecules. Family history of breast cancer was the only independent variable that correlated to DNMT1 level (p=0.0043), being higher in patients with hereditary risk. Our results points to an important role of DNMTs in breast cancer and further studies are necessary to elucidate the underlying mechanisms involved in methylation process, contributing to breast cancer development and progression.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_CintiaMarques_M.pdf: 2054933 bytes, checksum: 39195c141e4cd2e600f9454a1cfc8781 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A síndrome de Down (SD) é uma aberração cromossômica atribuída à presença de três cópias dos genes localizados no cromossomo 21. Ocorre com uma freqüência estimada de um indivíduo em 600 nascidos vivos e de uma em 150 concepções. Os mecanismos relacionados com a não-disjunção do cromossomo 21 não foram ainda elucidados e embora a idade materna avançada seja um fator de risco, a maioria das crianças com SD nasce de mães com menos de 30 anos. Um mecanismo proposto para explicar a não-disjunção cromossômica consiste na hipometilação do centrômero levando à formação anormal do cinetócoro e ligação anormal dos microtúbulos. Tal mecanismo teria uma etiologia multifatorial e entre os fatores genéticos estariam as variantes polimórficas de enzimas envolvidas no metabolismo do folato. A via bioquímica do folato pode influenciar a estabilidade do DNA de dois modos: o primeiro está relacionado com a função que o folato desempenha na transferência de unidades de 1-carbono para a biosíntese de novo de nucleotídeos. Baixa concentração intracelular de 5, 10-metilenoTHF leva a uma diminuição da síntese de timidilato e a incorporação errônea de dUTP durante a replicação do DNA; o segundo modo envolve a produção de S-adenosilmetionina (SAM), o principal doador de grupos metil para a maioria das reações de metilação, incluindo a metilação CpG. Baixa concentração intracelular de 5,10-metilenoTHF é associado com baixa produção de SAM e conseqüentemente com a hipometilação do DNA. Diante disso, o objetivo do trabalho foi determinar se os polimorfismos MTHFD-1 1958G>A, TCII 776C>G, MTR 2756A>G, MTRR 66 A>G, RFC-1 80G>A e SHMT-1 1420C>T representam fatores de risco para gestações com SD. Para isso foi realizada a técnica de PCR utilizando 200 amostras de DNAs de mães de portadores de SD (MSD) e 340 amostras de DNAs controles seguida por digestão enzimática dos produtos obtidos e análise estatística dos resultados. Comparando a distribuição genotípica no grupo MSD e controle foi observado que o polimorfismo TCII 776C>G apresentou uma diferença estatisticamente significativa: ?2 (2) = 13,10 e p=0,0014. Nossos resultados indicam que mulheres com genótipo heterozigoto para o polimorfismo TCII 776C>G possuem um risco duas vezes maior de gerarem crianças com SD / Abstract: Down syndrome is a chromosome abnormality caused by the presence of three copies of genes located in the chromosome 21. It occurs in an estimated frequency of one out of 600 liveborns and one out of 150 conceptions. The mechanism related to the non-disjunction of the chromosome 21 has not been totally understood and even though the mother's age is a risk factor, most DS children are born to mothers aged less than 30. One mechanism proposed to explain the chromosome non-disjunction is the centromeic hypomethylation that causes abnormal formation of kinetochore and abnormal links of the microtubules. Such a mechanism is thought to have a multifactorial etiology and among the genetic factors are polymorphic variants of enzymes involved in folate metabolism. The biochemical pathway of the folate influnces the DNA stability in two ways: the first is related to the role of folate in one carbon unit transfer during "de novo" synthesis of nucleotides. Low levels of 5, 10-methylenetetrahydrofolate (5, 10-methyleneTHF) lead to a decrease in thymidylate synthesis and the misincorporation of the dUTP during replication of DNA; the second way involves the production of S-adenosyl methionine (SAM), the main donor of methyl to most methylation processes, incluing CpG methylation. Low intracellular 5,10-methyleneTHF is associated with low SAM production and consequently with DNA hypomethylation. Therefore, the purpose of the study was determining if the polymorfisms MTHFD-1 1958G>A, TCII 776C>G, MTR 2756A>G, MTRR 66A>G, RFC-1 80G>A e SHMT-1 1420C>T represent risk factors for DS pregnancies. So we used techniques of PCR followed by restriction enzyme analysis of 200 DNAs of mothers of DS children (MSD) and 340 DNAs of control mothers with statistic analyses of the results. Comparing the genotypic distribution in the groups MSD and control it has been observed that polymorphism TCII 776C>G showed a statistically remarkable difference: ?2 (2) = 13,10 e p=0,0014. Our results show that women that have heterozigote genotype for polymorphism TCII 776C>G have two times higher risk of generating DS children / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Ana Paula de Souza Pardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T15:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Planello_AlineCristiane_D.pdf: 1888206 bytes, checksum: 00e43f6f072e313fafc04b5a4406af8b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A inflamação crônica é conhecida por induzir alterações epigenéticas, em particular, alterações na metilação do DNA. A ilha CpG do gene SOCS1 tem sido observada hipermetilada em diferentes tipos de câncer e em doenças associadas à inflamação. No entanto, pouco se sabe sobre essas alterações epigenéticas associadas à periodontite crônica. A fim de abordar essa questão, nós investigamos a metilação do DNA no exon 2 da Ilha CpG do SOCS1 e sua relevância funcional para a periodontite crônica em 90 amostras de tecidos gengivais usando a técnica de comparação de melting sensível a metilação (MS-HRM). Nós observamos que a região analisa se encontra hipermetilada quando comparada com amostras de indivíduos saudáveis. Alterações na expressão no SOCS1 não foram encontradas. Posteriormente foram realizadas investigações da sequencia do SOCS1 que revelaram marcadores de enhancer na região. Analise de sítios hipersensíveis a Dnase I (Dnase I hipersensitivity site ¿ DHS), que são associados com região regulatória, mostraram um DHS dentro do exon2 do SOCS1, que cobre a mesma região estudada na técnica MS-HRM. Esse DHS correlacionou-se com vários promotores na vizinhança do SOCS1, sendo considerados os genes alvos. Fragmentos desmetilados e metilados cobrindo a região encontrada com diferença de metilação no SOCS1 foram clonados em um plasmídeo repórter que possui um promotor e é livre de qualquer CpG.. Os fragmentos desmetilados aumentaram a atividade da luciferase, demonstrando a atividade de enhancer da região. Já os fragmentos metilados, além de não exercerem atividade de enhancer, foram capazes de reprimir a função do promotor. Corroborando essas informações, foi observada correlação negativa entre a metilação no SOCS1 nas amostras com inflamação e a expressão de genes. Os dados apresentados indicam que a função principal da metilação do DNA em um enhancer é controlar sua função regulatória e consequentemente os níveis de transcrição dos genes alvo, o que pode ser evidenciado pela hipermetilação do exon do SOCS1 na inflamação crônica / Abstract: Chronic inflammation is known to induce epigenetic alterations, in particular alterations in DNA methylation. SOCS1 CpG island (CGI) has been demonstrated hypermethylated in many types of cancer and inflammation-associated diseases. However, little is known about the epigenetic changes associated with chronic periodontitis. In order to address this question, we investigated DNA methylation of oxon 2 of SOCS1 CGI and its functional relevance to chronic periodontitis in 90 gingival tissue samples using methylation sensitive high resolution melting (MS-HRM). We found this region to be hypermethylated when compared with healthy controls. No changes in gene expression were observed. Further investigations of SOCS1 sequence showed enhancer marker at SOCS1 region. Correlation analysis of Dnase I hypersensitivity site (DHS), which is associated with regulatory region, showed a DHS inside exon2 SOCS1 correlated with several promoter in the neighboring region, considered target genes. Fragments harboring the SOCS1 region found to be differentially methylated, were cloned into a CpG free-Luc reporter vector just upstream the promoter. Unmethylated and methylated fragments were tested. The unmethyalted fragment enhanced the promoter activity of the promoter. Strikingly, not only the exon2 of SOCS1 CGI presented enhancer activity but also it had its activity disrupted by DNA methylation. Accordingly, negative correlation between SOCS1 methylation and expression of neighboring genes was observed in chronic inflammation. The data indicate that the primary function of enhancer DNA methylation is to control its regulatory function and the transcription levels of enhancer target genes, which can be evidenced by exon 2 SOCS1 CGI hypermethylation on chronic inflammation / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

Orientador: Sérgio Roberto Peres Line / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-23T22:35:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mofatto_LucianaSouto_D.pdf: 2939657 bytes, checksum: 161ea0e68091cc76485826424b41aab0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os G-quadruplexes são estruturas secundárias de DNA altamente organizadas, constituídas por sequências ricas em guaninas capazes de formar tétrades ligadas por pontes de hidrogênio. Essas sequências são capazes de modular a transcrição gênica e o splicing alternativo de éxons. Além disso, estudos também mostraram que os G-quadruplexes estão presentes na região promotora de oncogenes (como c-MYC) e nas regiões terminais dos telômeros, indicando que o G-quadruplex pode ser um possível alvo terapêutico contra o câncer. A metilação do DNA é uma modificação bioquímica que frequentemente aparece na posição C5 de citosinas da sequência do dinucleotídeo 5'- citosina guanina - 3' (CpG) em células eucarióticas. As alterações no padrão normal de metilação do DNA estão associadas a situações patológicas, como inflamação e câncer. Assim, a metilação anormal de citosinas pode ser responsável pela indução de câncer através de mutações pontuais em genes supressores de tumor presentes em células somáticas e germinativas. Este trabalho propôs estudar a estrutura e estabilidade de Gquadruplexes de DNA e sua influência na metilação do DNA. Neste intuito foram realizadas análises para verificar se a formação de G-quadruplex no DNA dupla fita poderia influenciar no padrão de metilação de citosinas, utilizando oligonucleotídeos (ricos em guaninas e com sítio para metilação) que mimetizam a fita dupla de DNA. Também foi estudado: (1) a estabilidade de G-quadruplexes contendo mais de quatro tríades de G e a possível formação de G-quadruplexes em DNA fita dupla em ensaio "in vitro"; (2) a interação entre extratos de própolis e G-quadruplexes de DNA e (3) o efeito de estabilizadores de G-quadruplex (TMPyP4 e 360A) no padrão de metilação do DNA em cultura de linhagens de células normais e tumorais / Abstract: G-quadruplexes are highly organized secondary structures of DNA, consisting of guanine rich sequences that form tetrads linked by hydrogen bonds. These sequences can modulate gene transcription and the alternative splicing of exons. Studies also showed that G-quadruplexes are present in the promoter of oncogenes (such as c-MYC) and terminal telomere regions, suggesting that the Gquadruplex can be a therapeutic target in cancer. DNA methylation is a frequent biochemical modification that appears in C5 position of cytosine in the dinucleotide sequence 5' - cytosine guanine - 3' (CpG) in eukaryotic cells. Changes in the normal patterns of DNA methylation are frequently associated with patologic situations, such as inflammation and cancer. Abnormal methylated cytosine may be responsible for induction of cancer due to mutations in tumor suppressor genes of somatic and germline cells. The aim of this study was to analyze the structure and stability of Gquadruplexes of DNA and its influence on DNA methylation. It was verified if Gquadruplex formation of double-stranded DNA could influence the pattern of cytosine methylation, using oligonucleotides (sequences with methylation site and rich in guanine) that simulated double-stranded DNA. We also evaluated: (1) the stability of G-quadruplexes containing more than four triads of guanine and the possible formation of G-quadruplexes in double-stranded DNA by "in vitro" test; (2) the interaction between propolis ethanolic extracts and DNA G-quadruplexes and (3) the effect of G-quadruplex ligands (TMPyP4 and 360A) for DNA methylation in normal and tumor cell lines / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

Orientador: Fabio Tebaldi Silveira Nogueira / Banca:?? / Resumo: A metilação do DNA está relacionada à regulação gênica, memória celular, silenciamento de elementos transponíveis, imprinting genômico e repressão de pseudoelementos provenientes de sequências duplicadas. Os padrões de metilação são estabelecidos, mantidos e traduzidos em estados funcionais apropriados da maquinaria de metilação do DNA, a qual inclui uma família classificada em três grupos de enzimas do tipo metiltransferases: DNMT1, DNMT3 e DNMT2. A DNA metiltransferase 2 (DNMT2) foi identificada na busca de novos candidatos à uma segunda DNA metiltransferase. Esta enzima não possui função biológica definida, porém, é capaz de metilar tanto DNA quanto RNA, em especial RNA transportadores (tRNAs). A DNMT2 está localizada tanto no núcleo quanto no citoplasma em células humanas, sendo capaz de migrar do núcleo para o citoplasma em resposta a estresses celulares. É provável que a enzima metile o tRNA no citoplasma, possivelmente para protegê-lo contra clivagens em situações de estresse. Quando estas clivagens ocorrem de forma específica, pequenos fragmentos de RNA são gerados (denominados tRFs), fato observado em diversas espécies, incluindo Arabidopsis thaliana. Aparentemente, estes fragmentos de RNA fazem parte de uma nova via de interferência por RNA (RNAi). Contudo, seu papel biológico ainda não foi definido. O objetivo deste trabalho foi determinar a função da enzima DNMT2 de plantas durante o desenvolvimento e em resposta a estresses, além de estabelecer seu possível papel na proteção de tRNAs. Até o momento, foi demonstrado que a enzima AtDNMT2 possuí localização, tanto nuclear quanto citoplasmática e também pode ser visualizada em estruturas que aparentam ser citoesqueletos. Foi possível determinar que AtDNMT2 não atua na proteção do tRNA AspGTC durante estresse oxidativo, porém é positivamente regulada durante diferentes tipos de estresse. A planta mutante dnmt2 não possui... / Abstract: DNA methylation is associated with genetic regulation, cell memory, silencing of transposable elements, genomic imprinting and repression of pseudo-elements coming from duplicate sequences. Methylation patterns are established, kept and translated via an appropriate functional DNA methylation machinery, which includes a family of proteins classified into three methyltransferase enzyme groups: DNMT1, DNMT3 e DNMT2. DNA methyltransferase 2 (DNMT2) was first identified by searching for novel DNA methyltransferase candidates. DNMT2 is highly conserved in different kingdoms and does not have a biological function well defined so far; however, it has been shown that DNMT2 can methylate both DNA and RNA in animal cells, most specifically transfer RNA (tRNA). In human cells, DNMT2 is localized both in the nucleus and in the cytoplasm, being capable to migrate from nucleus to cytoplasm under stress conditions. In the cytoplasm, DNMT2 methylates tRNAs, possibly to protect against cleavage events that occur under stress conditions. When these cleavages occur in a specific pattern, small RNA fragment emerges (tRFs). tRFs are found in several species, including Arabidopsis thaliana. It seems that these tRNA fragments are part of a new RNAi pathway. However, its biological role has not been reveal yet. The aim of this work is to evaluate the possible role(s) of DNMT2 in plant development and stress response and also establish its possible role in tRNA protection. So far we demonstrated that AtDNMT2 has both nuclear and cytoplasmic cellular localization and can also be visualized in what seen to be the cytoskeleton. We determined that AtDNMT2 does not play role in tRNA AspGTC protection under oxidative stress, though AtDNMT2 is up regulated in different stresses. The mutant plant Atdnmt2 does not have obvious phenotype, what makes harder to understand its biological role, leading us to deeper molecular studies. In this context, the present work reveals... / Doutor

A depressão é uma doença com alta incidência na população mundial e os antidepressivos atualmente disponíveis não são completamente eficazes. Esses fármacos apresentam uma latência de 2-4 semanas para induzir uma melhora significativa dos sintomas e cerca de 45% dos pacientes não respondem ao tratamento, cujo mecanismo é baseado na facilitação da neurotransmissão monoaminérgica no SNC. Por outro lado, recentemente tem sido demonstrado que a ketamina, antagonista do receptor de glutamato do tipo NMDA induz um efeito antidepressivo rápido e sustentado em animais e pacientes. No entanto, o uso dessa droga para o tratamento da depressão possui diversas limitações e, assim, o entendimento dos mecanismos subjacentes à sua ação antidepressiva pode contribuir para o desenvolvimento de novas e melhores alternativas terapêuticas. Estes mecanismos parecem ser mais complicados do que simplesmente o bloqueio do receptor NMDA, dado que tal bloqueio com o antagonista MK-801, por exemplo, induz efeito tipo-antidepressivo no teste do nado forçado (FST) por até 3 horas, mas sem reproduzir os efeitos prolongados da ketamina. Por isso, a cascata de eventos neuroquímicos iniciada após a administração de ketamina que culmina com a regulação da expressão gênica e síntese de proteínas relacionadas aos processos de plasticidade neural têm sido alvo de grande investigação a fim de se compreender o mecanismo de ação subjacente ao efeito antidepressivo rápido e sustentado dessa droga. A expressão desses genes pode ser modulada por mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA, um processo realizado por DNA metiltransferases (DNMTs), que também tem apresentado grande relevância para a neurobiologia da depressão. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da administração de antagonistas do receptor NMDA, ketamina e MK-801, em doses e protocolos de tratamento que promovam efeito tipo-antidepressivo no FST, sobre a metilação do DNA em estruturas encefálicas importantes para a neurobiologia da depressão, em animais submetidos ou não ao estresse de nado forçado. Para tanto, primeiramente, foram delineados protocolos experimentais para análise do efeito tipo-antidepressivo destas drogas: Em ratos, administração sistêmica aguda de S(+)-ketamina 10 mg/Kg ou MK-801 0,025 mg/Kg 23 horas após a sessão pré-teste e 1 hora ou 7 dias antes da sessão teste do FST, permitiu a análise de um efeito tipo-antidepressivo rápido e sustentado induzido pela ketamina e apenas rápido pelo MK-801. Em seguida, utilizando estes protocolos, avaliou-se os efeitos do estresse do pré-teste do FST e do tratamento com tais antagonistas do receptor NMDA sobre os níveis de metilação global do DNA e expressão de DNMT3a e DNMT3b no córtex frontal, hipocampo ventral e dorsal dos animais. Foram encontradas alterações nas quantificações realizadas, sugerindo que o estresse e o tratamento podem induzir efeitos importantes sobre a metilação do DNA nas estruturas analisadas. Além disso, o tratamento com ketamina ou MK-801 parecem induzir efeitos diferenciais em algumas regiões, o que poderia estar associado aos efeitos também distintos que apresentam sobre a ação antidepressiva / Although depression presents a high incidence in the world population, currently available antidepressants exhibit a latency of 2-4 weeks to induce a significant improvement of symptoms and around 45% of patients do not respond to these drugs. On the other hand, it has been recently shown that ketamine, a NMDA receptor antagonist, induces a rapid and sustained antidepressant effect in animals and patients. However, the use of this drug for depression treatment has several limitations and, thus, the understanding of the mechanisms underlying its antidepressant action could present a significant importance for the development of new and better therapeutic alternatives. These mechanisms appear to be more complex than the initial blockade of the NMDA receptor, since such blockade by MK-801, for example, reduces the immobility time of mice submitted the forced swimming test (FST) for up to 3 hours, without reproducing the sustained effects of ketamine. Therefore, the cascade of neurochemical events that are initiated after ketamine administration that culminate in the regulation of gene expression and syntehsis of proteins related to neuronal plasticity has been the focus of intense investigation. These genes, in turn, can be modulated by epigenetic mechanisms such as DNA methylation, a process performed by DNA methyltransferase (DNMTs), which has also shown a high relevance to the neurobiology of depression and its treatment. Based on that, the present study aimed at investigating the effects induced by ketamine and MK-801, at doses and treatment protocols that promote antidepressant-like effect in the FST, upon DNA methylation in brain structures of animals submitted or not to the forced swim stress. The first experimental protocols were designed for the analysis of acute and sustained drug-induced antidepressant-like effects: In rats, acute systemic administration of S(+)-Ketamine 10 mg/Kg or MK-801 0.025 mg/Kg 23 hours after the pretest session and 1 hour or 7 days before the test session of FST was investigated. Based on these protocols, the effects of stress (FST) and of treatment with NMDA receptor antagonists were investigated on global DNA methylation levels and DNMT3a and Dnmt3b expression in the rat frontal cortex, ventral and dorsal hippocampus. Both, stress and treatment, induced changes in DNA methylation and DNMT3 expression in some of the brain regions analised. In addition, treatment with MK-801 and ketamine seem to induce differential effects in some areas, which could also be associated with different effects that they present on antidepressant action.

Gliomas s~ao tumores heterog^eneos, o que contribui para seu alto grau de mortalidade, apesar de avan¸cos na classifica¸c~ao e tratamento. Desde 2016, a incorpora¸c~ao do estado dos genes IDH e da integridade dos cromossomos 1p e 19q na classifica¸c~ao de gliomas fornece aplica¸c~oes cl´?nicas importantes para o diagn´ostico e tratamento deste tumor; entretanto, a procura por assinaturas moleculares que possam refinar ainda mais os subtipos de glioma em subgrupos mais homog^eneos ´e um esfor¸co cont´?nuo. Este estudo utilizou o maior n´umero de amostras de gliomas adultos (n=932) at´e a atualidade, variando dos graus II ao IV, a fim de definir subgrupos de glioma utilizando assinaturas de metila¸c~ao do DNA, indepentemente de grau e histologia. No total, 7 subtipos foram identificados: Classiclike, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, PA-like, Codels, G-CIMP-low and G-CIMP-high. A maior parte dos subgrupos com IDH tipo selvagem, isto ´e, Classic-like, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, possuem padr~ao de baixa metila¸c~ao do DNA e um pior risco progn´ostico; caracter´?sticas cl´?nicas t´?picas de glioblastomas, o tipo mais agressivo de gliomas. Uma descoberta interessante foi a identifica¸c~ao do subgrupo PA-like dentre gliomas com IDH tipo selvagem, o qual compartilha aspectos gen^omicos similares a astrocitoma piloc´?tico, um glioma pedi´atrico benigno com bom quadro cl´?nico entre gliomas com IDH tipo selvagem. Codels, os quais abragem pacientes com muta¸c~ao em IDH e codele¸c~ao dos cromossomos 1p e 19, possuem o melhor progn´ostico dentre os gliomas difusos em adultos. Uma descoberta importante em rela¸c~ao a gliomas com muta¸c~ao em IDH, por´em sem codele¸c~ao dos cromossomos 1p e 19q, foi a estratifica¸c~ao de gliomas com fen´otipo metilador de ilhas CpG (G-CIMP) em G-CIMP-low, com n´?veis mais baixos de metila¸c~ao do DNA e pior quadro cl´?nico, e G-CIMP-high, com n´?veis mais altos de metila¸c~ao do DNA e melhor risco progn´ostico. Curiosamente, o grau de metila¸c~ao do DNA (-low e -high) estava associado com altera¸c~oes distintas em elementos regulat´orios e modifica¸c~oes de histona aberrantes na regi~ao promotora de genes do ciclo celular. Estes achados consolidaram a import^ancia cl´?nica da epigen´etica, particularmente da metila¸c~ao do DNA, em gliomas, como tamb´em levantou a possibilidade de que a sobrevida m´edia ruim de G-CIMP-low pode ser associada a elementos regulat´orios. Al´em disso, a hip´otese de que enhancers ativos podem agir na regula¸c~ao g^enica de G-CIMP-low fornece mais evid^encias de que elementos regulat´orios podem levar `a maior agressividade e prolifera¸c~ao de G-CIMP-low. Este estudo visa 1) identificar e caracterizar subtipos de gliomas difusos em adultos baseados na metila¸c~ao do DNA, e 2) avaliar a associa¸c~ao entre modifica¸c~oes de histona com um subtipo mais agressivo de G-CIMP / Gliomas are heterogeneous tumors which contribute to their high mortality despite advancements in classification and treatment. As of 2016, the incorporation of IDH status and the integrity of chromosomes 1p and 19q to glioma classification have provided important clinical application for diagnostics and treatment; however, the search for molecular signatures that further refine glioma subtypes into more homogeneous subgroups is an ongoing effort. This study used the largest sample cohort (n=932) of adult gliomas to date, ranging from grades II to IV, in order to define gliomas subgroups using DNA methylation signatures, independent of histopathological grading. In total, 7 subtypes were identified: Classic-like, Mesenchymal-like, LGm6-GBM, PA-like, Codels, G-CIMP-low and G-CIMP-high. Most IDH -wildtype subgroups, e.g. Classic-like, Mesenchymal-like and LGm6-GBM, had low DNA methylation pattern and a poor outcome, typical of glioblastomas, the most aggressive phenotype of gliomas. An interesting finding was the identification of the PA-like subgroup within IDH -wildtype samples, which shared similar genomic features with pilocytic astrocytoma, a rare pediatric benign glioma, with a good overall survival (OS) among IDH -wildtype gliomas. Codels, which comprise IDH mutant gliomas with codeletion of chromosomes 1p/19q have the best OS across all adult gliomas. An important finding regarding IDH mutant gliomas with no codeletion of chromosomes 1p/19q, was the further segregation of the Glioma-CpG Island Methylator Phenotype (G-CIMP) into G-CIMP-low, with lower levels of DNA methylation and worse OS, and G-CIMP-high, characterized by higher DNA methylation profile and better OS. Interestingly, the degree of G-CIMP methylation (-low and -high) was associated with distinct alterations in regulatory elements and aberrant histone modifications at promoter regions of cell cycle genes. These findings consolidated the clinical importance of epigenetics, particularly DNA methylation, in gliomas, as well as the possibility that aggressive OS in G-CIMP-low may be driven by regulatory elements. Moreover, our results suggest that active enhancers that might be acting in gene regulation in G-CIMP-low provide more evidence of the regulatory elements that might be driving aggressiveness and proliferation in G-CIMP-low. This study aims 1) to identify and characterize adult diffuse glioma DNA methylation subtypes, and 2) evaluate the association of histone modifications with a more aggressive G-CIMP subtype

O linfoma não-Hodgkin (LNH) é bastante prevalente em cães e atualmente é aceito como modelo comparativo da doença em humanos. Padrões aberrantes de metilação de DNA parecem exercer um papel chave no desenvolvimento de tumores hematopoiéticos nos seres humanos, constituem um mecanismo especial de controle transcricional e podem ser influenciados por alterações genéticas e ambientais. Os efeitos da metilação global do DNA têm sido raramente investigados em cães, principalmente em processos neoplásicos. O objetivo do presente estudo foi quantificar a metilação global do DNA em leucócitos sanguíneos de cães portadores de LNH, comparando com a metilação global do DNA de leucócitos sanguíneos de cães sadios e identificar genes diferentemente metilados nas mesmas amostras. Para isto, utilizou-se o DNA obtido da capa leucocitária de amostras de sangue venoso periférico de 10 cães sadios e 9 cães com LNH multicêntrico. Para imunofenotipagem dos linfomas, aplicou-se o painel imunocitoquímico de anticorpos anti-CD79a, anti-PAX5 e anti-CD3. O índice de proliferação celular foi obtido por meio da contagem de núcleos positivos para Ki-67. A metilação global do DNA dos leucócitos foi quantificada pelo método High Performance Liquid Chromatography (HPLC) e visualmente (por escores) em amostras submetidas a imunocitoquímica (ICQ) com o anticorpo anti-5-metil citosina (5MetCyt). Para a identificação de genes diferentemente metilados entre ambos os grupos avaliados, utilizou-se a técnica de beadchip com o ensaio Infinium Methylation EPIC BeadChip humano (850K). Como resultados, em ambos os métodos (HPLC e ICQ), os leucócitos sanguíneos de cães portadores de LNH apresentaram metilação global do DNA significantemente inferior à dos cães sadios (HPLC: p= 0,027 / ICQ: p= 0,015). Das 853.307 ilhas CpGs investigadas no microarranjo, houve hibridização de 34.574 sondas nas amostras caninas. Desse total, observou-se diferença significante em nível de metilação de 606 sondas, e por meio da análise das similaridades homólogas e ortólogas, identificou-se 550 genes diferentemente metilados entre os dois grupos. Nosso estudo foi pioneiro em sugerir que cães com LNH apresentam hipometilação global do DNA de leucócitos circulantes quando comparados a cães sadios. Apesar de termos usado amostras caninas em um ensaio desenvolvido especificamente para o DNA humano (Infinium Methylation EPIC BeadChip) foi possível a identificação de genes diferentemente metilados e possíveis novos alvos com potencial preventivo ou terapêutico. Futuros estudos epidemiológicos são necessários para correlacionar o padrão de metilação de leucócitos com o risco de desenvolver linfomas e utilizá-lo como biomarcador / Non-Hodgkin\'s lymphoma is quite prevalent in dogs and it is currently accepted as a comparative model for the disease in humans. Aberrant patterns of DNA methylation appear to play a key role in the development of hematopoietic tumors in humans, constitute a special mechanism of transcriptional control and may be influenced by genetic and environmental variations. The effects of methylation have been rarely investigated in dogs, especially in neoplastic processes. The aim of the current study is to quantify the global DNA methylation of blood from dogs bearing non-Hodgkin\'s lymphoma, comparing them with the methylation content and pattern of healthy dogs and identify differently methylated genes in the same samples. For this, the DNA obtained from the buffy coat of peripheral venous blood samples from 10 healthy dogs and 9 dogs with multicentric non-Hodgkin\'s lymphoma were used. For immunophenotyping of lymphomas, the immunocytochemical panel of anti-CD79a, anti-PAX5 and anti-CD3 antibodies were applied. The cell proliferation index was performed by counting positive nuclei with anti-Ki-67. The global methylation of leukocyte DNA was quantified by the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method and visually (by scoring) in samples subjected to immunocytochemistry (ICQ) with the anti-5-methyl cytosine antibody (5MetCyt). For the identification of differently methylated genes between both groups, the bead chip technique was used with the Infinium Methylation EPIC BeadChip human assay (850K). As a result, in both methods (HPLC and ICQ), dogs with non-Hodgkin\'s lymphoma had a lower amount of methylation than healthy dogs (HPLC: p = 0.027 / ICQ: p = 0.015). Of the 853,307 CpGs investigated in the microarray, there were 34,574 probes hybridized in the canine samples. From this total, significant difference was observed in the methylation level of 606 probes and through the homologous and orthologous similarities, 550 differently methylated genes were identified between the two groups. Our study was a pioneer in suggesting that dogs bearing non-Hodgkin\'s lymphoma presented DNA global hypomethylation of circulating leukocytes when compared to healthy dogs. Although we used canine samples in an assay developed specifically for human DNA (Infinium Methylation EPIC BeadChip) it was possible to identify differently methylated genes and possible new targets with preventive or therapeutic potential. Future epidemiological studies are needed to correlate the methylation pattern of leukocytes with the risk of developing lymphomas and to use it as a biomarker

A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse. / Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress.