Neuropatia é a complicação mais comum e mais debilitante da Diabetes Mellitus, a longo prazo presente em mais de 50% dos pacientes que possuem a doença. A hiperglicemia induz estresse oxidativo nos neurônios de diabéticos acarretando a ativação de múltiplas vias bioquímicas, as quais são potenciais alvos terapêuticos para a neuropatia diabética. Está claro que compostos carbonil reativos são mediadores glicotóxicos do estresse oxidativo através da formação de produtos finais de glicação avançada como resultado direto da hiperglicemia. Metilglioxal e glicolaldeído são compostos carbonil reativos inevitavelmente produzidos pelo metabolismo, os quais são encontrados em maior quantidade em situações de hiperglicemia. Recentemente, tem sido dada muita atenção para o envolvimento de espécies reativas na toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído, e tem-se demonstrado que essas glicotoxinas têm potencial para induzir estresse oxidativo, parar o crescimento celular e promover morte por apoptose ou necrose. O metilglioxal e o glicolaldeído interagem com grupamentos sulfidril de moléculas de glutationa e de enzimas, inibindo sua atividade; entretanto, os mecanismos moleculares relacionados aos efeitos tóxicos dessas glicotoxinas e as vias pelas quais elas levam a formação de espécies reativas não estão completamente elucidados. Neste estudo nós buscamos esclarecer a relação entre o metabolismo do metilglioxal e do glicolaldeído e a produção de espécies reativas, e investigamos as possíveis rotas de morte celular envolvidas. Utilizamos a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada, pois este é um modelo neuronal bem caracterizado para estudos de compostos neurotóxicos. Nós avaliamos a produção de espécies reativas induzida por metilglioxal e glicolaldeído através da técnica da diclorofluoresceína, e avaliamos, também, seus efeitos sob o conteúdo de glutationa celular. Além disso, investigamos a ativação das caspase-3, -8 e -9 e a contribuição de diferentes sistemas peroxidases (glutationa-redutase e a tioredoxina-redutase), na defesa neuronal contra essas glicotoxinas. Como resultados encontramos que o tratamento com ambas glicotoxinas rapidamente provocou um aumento na produção de espécies reativas e diminuição do conteúdo de glutationa, com concomitante ativação das caspases-8 e -9 e, posteriormente, também houve ativação da caspase-3 pelo tratamento com metilglioxal. Vimos que a tioredoxina-redutase possui um papel mais importante na defesa celular contra a toxicidade do metilglioxal do que contra o glicolaldeído, enquanto que a glutationa-redutase tem papel semelhante na defesa celular contra ambas glicotoxinas. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo é um importante mecanismo da toxicidade do metilglioxal e do glicolaldeído nas células diferenciadas SHSY5Y e, que enzimas redutoras de grupamentos sulfidril contribuem de diferentes formas na defesa celular contra cada uma dessas glicotoxinas. / Neuropathy is the most common and debilitating complication of Diabetes Mellitus present in more than 50% of the patients with long-standing disease. Hyperglycemia induces oxidative stress in neurons from diabetic patients and results in activation of multiple biochemical pathways. These activated pathways are a major source of damage and are potential therapeutic targets in diabetic neuropathy. A large body of evidence has implicated reactive carbonyl compounds as glycotoxic mediators of oxidative stress by forming advanced glycation endproducts as a direct result of hyperglycemia. Methylglyoxal and glycolaldehyde are reactive carbonil compounds inevitably produced by the metabolism, but they are found in increased rates under hyperglycemia condition. Recently, the attention has been focused on the involvement of reactive species in methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities, resulting in oxidative stress and leading to cell growth arrest, apoptotic or necrosis death. These glycotoxins interact with sulfhydryl-groups of glutathione molecules enzymes, inhibiting their activity; however, the molecular mechanism underlying methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxic effects and reactive species generation are not fully understood. In this study we have pursued to establish the role of methylglyoxal and glycolaldehyde metabolisms and reactive species production, and have looked for the possible death routes involved with the toxic effects of these glycotoxins. Here we used the differentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells as neuronal experimental model to investigate the pathological effects of various neurotoxic compounds. We have evaluated the methylglyoxal and glycolaldehyde capacity to reactive species generation by dichlorofluorescein assay and their effects upon cellular glutathione content. Also, we have assessed the caspase-3, -8 and -9 activation and the contribution of different peroxidases systems (glutathione reductase and thioredoxin reductase) in the neuronal defense against methylglyoxal and glycolaldehyde cytotoxicities. We found that both glycotoxins promptly provoke reactive species generation and decrease the cell glutathione content, as well induce caspase-8 and -9 activation. Later caspase-3 activation was found in methylglyoxal treatment. We demonstrate that thioredoxin reductase has a most important role in cell defense against methylglyoxal toxicity than against glycolaldehyde, meanwhile there is no difference in the glutathione reductase role. Our results show that oxidative stress is an important mechanism in the methylglyoxal and glycolaldehyde toxicities and sulfhydryl reductases contributes differently in the cellular defense against these glycotoxins.

Peroxinitrito é um potente agente oxidante, nitrante e nucleofilico formado in vivo pela reação difusional do radical ânion superóxido com óxido nítrico, cuja produção exacerbada em situações de estresse oxidativo e nitrosativo pode resultar em danos a biomoléculas e estruturas sub-celulares. Por outro lado, vários compostos carbonílicos reativos tais como acroleína e compostos α-dicarbonílicos são descritos como citotóxicos e genotóxicos, pois reagem com biomoléculas aminadas resultando em perda de funções nativas, situação esta denominada de \"estresse carbonílico\". Dentre os metabólitos α-dicarbonílicos, altamente suscetíveis a adições nucleofílicas, destacam-se o biacetilo, derivado do metabolismo hepático de etanol e contaminante de alimentos, e metilglioxal e glioxal, ambos catabólitos de glicose, proteínas e lipídios acumulados em doenças relacionadas ao envelhecimento. Neste trabalho, observou-se que, em tampão fosfato normalmente aerado de pH próximo à neutralidade, (i) estes três compostos sofrem adição nucleofílica de peroxinitrito com constantes de velocidade de segunda ordem uma a três ordens de grandeza acima dos valores relatados para compostos monocarbonílicos (k2 ≈ 4-100 M-1s-1); (ii) os sistemas biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito consomem o oxigênio dissolvido com produção de acetato ou acetato e formiato, respectivamente, via radical acetila capaz de acetilar histidina, lisina e 2\'-desoxiguanosina se adicionados à mistura reacional; e (iii) o sistema glioxal/peroxinitrito gera sucessivamente radical formila e radical formilhidroperoxila, cujo desproporcionamento a formiato e gás carbônico é acompanhado da emissão de luz no infra-vermelho próximo (λmax = 1270 nm), atribuída a oxigênio molecular no estado singlete (O21Δg) (Reação de Russell). Estes estudos evidenciam que a reação de metabólitos α-dicarbonílicos com peroxinitrito gera radicais livres e embasam a hipótese de que possam contribuir para a acetilação radicalar, não-enzimática intracelular, de proteínas (epigenética) e DNA, portanto potencialmente implicadas na fisiologia e patologia do envelhecimento e desordens metabólicas, nas quais a participação de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e compostos carbonílicos foi relatada. Deve-se ainda notar que a descoberta de acetilação radicalar de biomoléculas por metabólitos α-dicarbonilicos e peroxinitrito prepara o caminho para a identificação de novas reações químicas de biomoléculas, não catalisadas por enzimas, que possam eventualmente revelar novos biomarcadores teciduais em doenças adquiridas e inatas. / Peroxynitrite is a strong biological oxidant, nitrating and nucleophilic agent, formed by the diffusion-controlled reaction of the superoxide anion radical with nitric oxide, whose exacerbated production in oxidative and nitrosative stress leads to chemical damage to biomolecules and sub-cellular structures. On the other hand, various reactive carbonyl compounds like acrolein and α-dicarbonyls are reportedly cytotoxic and genotoxic for their ability to react with amino biomolecules resulting in loss of native functions, a situation named \"carbonyl stress\". Among very reactive α-dicarbonyls highly prone to nucleophilic additions, we highlight biacetyl, a hepatic alcohol metabolite and food contaminant, and methylglyoxal and glyoxal, both catabolites of glucose, proteins and lipids that accumulate in ageing-related disorders. Here, we report that, in normally aerated phosphate buffer near the physiological pH, (i) these three dicarbonyls undergo nucleophilic addition of peroxynitrite whose second order rate constants are one to three orders of magnitude than those documented for monocarbonyls (k2 ≈ 4-100 M-1s-1); (ii) the biacetyl or methylglyoxal/peroxynitrite systems consume the dissolved oxygen yielding the acetate anion or acetate plus formate anion, respectively, from acetyl radical intermediate which was found to acetylate added histidine, lysine and 2\'-deoxyguanosine; and (iii) the glyoxal/peroxynitrite system ultimately generate formyl radical and formylperoxyl radical, whose dismutation to formate and carbonic oxide is accompanied by near infrared monomol emission (λmax = 1270 nm) characteristic of singlet molecular oxygen (O21Δg) (Russell reaction). Our studies strongly attest that the reaction of α-dicarbonyls with peroxynitrite release free radicals that can potentially contribute for the radical, non-enzymatic acetylation of proteins (epigenetics) and DNA bases possibly implicated in the ageing physiopathology and metabolic disorders, where participation of reactive oxygen, nitrogen and carbonyl species is well recognized. Also noteworthy is that our findings may pave the way to the discovery of novel biochemical reactions whose products can eventually be useful as biomarkers of acquired and innate maladies.

Danos induzidos por hiperglicemia em tecidos no diabetes são caracterizados por quatro mecanismos conectados: aumento do fluxo metabólico através da via do poliol, ativação da proteína quinase C (PKC), aumento da atividade da via das hexosaminas e aumento da produção intracelular dos precursores dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Entre eles, os derivados de metilglioxal, um potente agente de modificação de proteínas e DNA, têm sido associados a complicações microvasculares no diabetes: nefropatia, retinopatia e neuropatia. O metilglioxal é produzido a partir das trioses fosfato, acetona e aminoacetona, um catabólito de treonina e glicina, gerado na matriz mitocondrial. A aminoacetona sofre oxidação enzimática, catalisada por aminoxidase sensível a semicarbazida (SSAO), ou química, catalisada por íons de cobre e ferro, produzindo metilglioxal, H2O2 e NH4 +. Sabendo que metilglioxal e H2O2 são capazes de induzir apoptose e/ou necrose em células produtoras de insulina (RINm5f) propomos uma possível atividade pró-oxidante da aminoacetona sobre células beta do pâncreas. O tratamento destas linhagens com aminoacetona/Cu(II) aumentou a morte celular, fluxo de Ca2+ intracelular, produção de NO, fragmentação do DNA, depleção dos níveis de glutationa reduzida (GSH), expressão gênica da proteína apoptótica Bax, enzimas antioxidantes - glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GRd), catalase e isoformas de superóxido dismutases (CuZnSOD e MnSOD) - e óxido nítrico sintase induzida (iNOS). Embora as concentrações normais e patológicas da aminoacetona, provavelmente seja muito menores que as usadas nos experimentos, sugerimos que, em tecidos de diabéticos, um acúmulo da aminoacetona em longo prazo pode conduzir a danos oxidativos e eventualmente morte das células beta do pâncreas / Tissue damages induced by hyperglycemia in diabetics are characterized by four linked mechanisms: increased flux through the polyol pathway, protein kinase C (PKC) activation, increased hexosamine pathway activity and intracellular production of advanced glycation end product (AGE) precursors. The production of AGEs by modifying proteins and DNA agent, such as methylglyoxal, has been implicated in microvascular complications in diabetes: nephropathy, retinopathy and neuropathy. Methylglyoxal is putatively produced in vivo from trioses phosphate, acetone and aminoacetone, a catabolite of threonine and glycine synthesized in the mitochondrial matrix. Aminoacetone has been reported to undergo semicarbazide sensitive amine oxidase- catalyzed and copper- and iron-catalyzed oxidations by molecular oxygen to methylglyoxal, NH4 + ion and H2O2. Considering that methylglyoxal and H2O2 have been found to promote apoptosis/necrosis to insulin-producing cells (RINm5f), we propose a possible pro-oxidant role of aminoacetone in pancreatic beta-cells. Treatment of RINm5f cells with aminoacetone plus Cu(II) ion promotes an increase of non-viable cells, influx of Ca2+ ions, NO production, DNA fragmentation, depletion of reduced glutathione (GSH) levels, and increased mRNA expression of pro-apoptotic protein (Bax), antioxidant enzymes - glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GRd), MnSOD, CuZnSOD and catalase - and inducible nitric oxide synthase (iNOS). Although both normal and pathological concentrations of aminoacetone are probably much lower than those used here, it is tempting to propose that excess aminoacetone in diabetic patients, at long term, may drive oxidative damage and eventually death of pancreatic beta-cells

Aminoacetona (AA) é um catabólito de Thr e Gly que se acumula nas síndromes cri-du-chat e treoninemia. Atualmente, a oxidação de AA é considerada uma das fontes alternativas de metilglioxal (MG), agente citotóxico e genotóxico, em diabetes mellitus. Em estados de deficiência metabólica, tal como o diabetes, há acúmulo de AA que, por sua vez, sofre oxidação na presença de amino oxidases sensíveis à semicarbazida (SSAO) com a produção de MG, H2O2 e NH4+. As SSAO são enzimas Cu-dependentes, cujo mecanismo de atuação ainda é pouco conhecido e possui como substrato, além de AA, metilamina (endógena) e a benzilamina (xenobiótico). AA possui um grupo amino vicinal à uma carbonila, o que sugere que ela possa sofrer enolização e oxidação catalisada por metal, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs), inclusive radicais HO•. A presente tese tem por objetivo esclarecer o mecanismo pelo qual AA sofre oxidação aeróbica, direta e catalisada por metal, com concomitante produção de EROs. Foi dada ênfase à catalise por ferro por sua implicação em desordens associadas com diabetes. Serão apresentados resultados que implicam AA como promotora de danos a membrana de mitocôndrias isoladas, bem como a estrutura proteica de ferritina e ceruloplasmina (CP). Como ferritina e CP estão envolvidas na homeostase de ferro, os danos causados a estas proteínas por AA possivelmente afetam o estado redox de plasma de diabéticos, contribuindo significantemente para o aumento do estresse oxidativo no diabetes. / Aminoacetone (AA) is a threonine and glycine catabolite long known to accumulate in cri-du-chat and threoninemia syndromes and, more recent1y, implicated as a contributing source of methylglyoxal (MG) in diabetes mellitus. AcetylCoA overproduction in diabetes also leads to AA accumulation. AA as well as many other endogenous (e.g., methylamine) and xenobiotic amines (e.g., benzylamine) are oxidized by dioxygen in the presence of SSAO, a group of poorly understood plasma circulating and membrane bound Cu-dependent enzymes, yielding an aldehyde, H2O2 and NH4+ ions. With AA, SSAO activity paradoxally produces the cytotoxic and genotoxic MG. AA bears an amino group vicinal to the carbonyl function and therefore is expected to undergo phosphate-catalyzed enolization and iron-catalyzed oxidation to yield reactive oxygen species (ROS), including HO• radicals. The present work aims to clarify the mechanisms by which AA undergoes direct and metal-catalyzed aerobic oxidation to yield deleterious ROS, with emphasis on the catalytic role of iron given its well-known implications in diabetes. In the present work we show that ROS generated through the aerobic oxidation of AA are able to induce damage in isolated rat liver mitochondria as well as in horse spleen ferritin (HoSF) and human ceruloplasmin (CP). The current findings of changes in HoSF and CP may contribute to explain intracellular iron-induced oxidative stress during AA accumulation in diabetes mellitus patients.

Há algum tempo, o laboratório de eletrossíntese orgânica do Instituto de Química vem estudando reações de halociclização na obtenção de compostos heterocíclicos de enxofre. No presente trabalho foram utilizados γ-δ e ;-δ-ε alquenil benzil sulfetos e realizados experimentos seguindo duas metodologias diferentes: a química (reações dos substratos com bromo) e a eletroquímica (reações dos substratos com bromo gerado eletroquimicamente). Os experimentos eletroquímicos são mais vantajosos porque dispensam a manipulação de bromo que, neste método, é gerado in situ através da oxidação eletroquímica de íons brometo. As misturas de reação obtidas nestes experimentos foram submetidas à oxidação com ácido m-cloro-perbenzóico ou oxone antes de isolar e caracterizar os produtos formados. Obteve-se resultados diferentes dependendo da metodologia empregada. Para os experimentos realizados com os 2-(1-ciclopentenil)-etilbenzil sulfeto (1a), 2-(1-cicloexenil)-etil-benzil sulfeto (1b) e (5-fenil-4pentenil)-benzil sulfeto (1c) em que foi utilizado bromo, os produtos principais foram os compostos heterocíclicos esperados a saber, hexa-hidro-3a-bromociclopenta[b]tiofeno-S-dióxido (6a), octa-hidro-3a-bromo-benzo[b]tiofeno-Sdióxido (6b) e 2-(1-bromo-1-fenilmetil)-tetra-hidro-tiofeno-S-dióxido (6c) respectivamente, porém o (3-metil-3-butenil)-benzil sulfeto (1d), nas mesmas condições, conduziu à (3,4-dibromo-3-metil-butil)-benzil sulfona (3d). Nos experimentos eletroquímicos, os resultados dependeram do eletrólito de suporte e do tipo de cela utilizados. Em cela dividida, utilizando Et4NClO4 na presença de pequenas quantidades de Et4NBr, o sulfeto (1b) forneceu como produto principal o composto heterocíclico (6b) e o sulfeto (1d) forneceu o perclorato de 3-bromo-3-metil-tetra-hidro-tiofeno-S-benzil sulfônio (4d). Quando apenas Et4NBr foi empregado o produto principai para o sulfeto (1b) foi o composto de adição de bromo à ligação dupla 2-(1,2-dibromocicloexil)-etil-benzil sulfona (7b). Este mesmo substrato fornece como produto principal a 2-(1,2-epóxi-1-cicloexil)-etil-benzil sulfona (11b) quando a eletrólise é realizada em cela não dividida. / The laboratory of organic electrosynthesis of the Instituto de Química has studied halocyclisation reactions to obtain of sulfur heterocyclic compounds. In the present work, γ-δ and δ-ε alkenyl benzyl sulfides were employed and experiments were carried out using two methodologies, a chemical (substrate reactions with bromine) and an electrochemical (substrate reactions with bromine generated electrochemically). The electrochemical experiments are more suitable because they avoid handling of bromine which is generated in situ by electrochemical oxidation. The crude reaction products were oxidized with m-chloroperbenzoic acid or oxone before their separation and characterization. Different results were obtained depending upon the methodology used. When 2-benzylthio-1-(1-cyclopentene)-ethane (1a), 2-benzylthio-1-(1-cyclo hexene)-ethane (1b) and 5-benzylthio-1-phenyl-1-pentene (1c) reacted with bromine the expected cyclic compounds hexahydro-3a-bromocyclopentan [b]thiophene-S-dioxide (6a), octahydro-3a-bromobenzo[b]thiophene-S-dioxide (6b) and 2-(1-bromo-1-phenylmethyl)tetrahydro-thiophene-S-dioxide (6c) respectively, were obtained, but (3-methyl-3-butenyl) benzyl sulfide (1d) yielded (3,4-dibromo-3-methylbutyl) benzyl sulfone (3d). In the electrochemical experiments, the structure of the products depends on the salt used as electrolyte and the type of cell used in the electrolyses. In a divided cell, when Et4NClO4 in the presence of small amounts of Et4NBr was employed, the main product from sulfide (1b) was compound (6b) whereas (3-methyl-3-butenyl) benzyl sulfide (1d) yielded 3-bromo-3-methyltetrahydrothiophene-S-benzyl sulfonium perchlorate (4d). Using only Et4NBr as electrolyte (1b) gave 2-(1,2-dibromocyclohexyl)ethyl benzyl sulfone (7b). The same substrate (1b) when electrolysed in an undivided cell, and otherwise same experimental conditions, afforded, as major product, 2-(1,2-epoxy-1-cyclohexyl)ethyl benzyl sulfone (11b).

Acetoacetato (AA) e 2-metilacetoacetato (MAA) são compostos β-cetoácidos acumulados em diversas desordens metabólicas como no diabetes e na isoleucinemia, respectivamente. Examinamos o mecanismo de oxidação aeróbica de AA e MAA iniciada por intermediários reativos de mioglobina de coração de cavalo (Mb) gerados pela adição de H2O2. Uma rota quimioluminescente que envolve um intermediário dioxetânico cuja termólise gera espécies α-dicarbonílicas (metilglioxal e biacetilo) foi proposta e estudada. Emissão de luz ultra fraca acompanha a reação, e sua intensidade aumenta linearmente pelo aumento da concentração tanto de Mb (10-500 µM) quando AA (10-100 mM). Estudos de consumo de oxigênio mostraram que MAA é, como esperado, quase uma ordem de grandeza mais reativo que AA. Estudos de EPR com captação de spin, utilizando MNP, possibilitaram detectar adutos de MAA atribuíveis a um radical centrado no Cα (aN = 1.55 mT) e ao radical acetila (aN = 0.83 mT). O sinal do radical acetila é totalmente suprimido por sorbato, um conhecido e eficiente supressor de espécies tripletes, o que é consistente com uma rota reacional envolvendo um intermediário dioxetânico. Clivagem-α da ligação carbonila-carbonila do produto biacetilo triplete produziria, de fato, radicais acetila. Além disso, utilizando AA como substrato para Mb/H2O2, um sinal de EPR atribuível ao aduto MNP-AA• (aN = 1.46 mT e aH = 0.34 mT) foi observado e confirmado por efeito isotópico. O consumo de oxigênio e o rendimento de compostos α-dicarbonílicos foram dose-dependentes à concentração de AA ou MAA (1-50 mM) bem como à concentração de H2O2 adicionado às misturas de reação contendo Mb (até 1:10 quando medido o consumo de oxigênio, e até 1:25 quando medido o rendimento de compostos α-dicarbonílicos) e tert-butilhidroperóxido (até 1:200). Os perfis de pH (5,8-7,8) para consumo de oxigênio e rendimento de compostos α-dicarbonílicos mostraram maiores rendimentos para baixos valores de pH, indicativo de ferrilMb formada no ciclo peroxidático da proteína. Avaliando os níveis de lesão de Mb, os β-cetoácidos diminuíram o nível de desorganização protéica na estrutura secundária e terciária elicitada por H2O2. Ainda, houve maior preservação da estrutura primária da proteína, sendo que MAA protegeu mais em comparação a AA, embora quando utilizado este último composto, foi mostrado que há acetilação dose-dependente de Mb. Acetoacetato aumentou a velocidade de descoramento da hemeproteína, provavelmente por ataque de espécies tripletes geradas no sistema. Músculos de rato, plantar e sóleo, expostos ex vivo a concentrações citotóxicas de glicose oxidase (GOX, gera H2O2 em fluxo), foram protegidas pelos ésteres etílicos AAE e MAAE. Foi detectado biacetilo no meio intracelular em músculos expostos a MAAE e GOX. A concentração deste composto α-dicarbonílico é claramente relacionada à abundância de Mb em cada um dos tipos de músculos estudados. Em resumo, Mb tratada com metabólitos β-cetoácidos (AA e MAA) gera radicais centrados em carbono e produtos α-dicarbonílicos altamente reativos no estado triplete. Experimentos realizados com tecido muscular ex vivo sugerem que esta reação possivelmente ocorra in vivo. Levantamos a hipótese de que a geração de espécies carbonílicas reativas e seus adutos em condições de desbalanço metabólico possam contribuir para a compreensão das bases moleculares de desordens cetogênicas. / Acetoacetate (AA) and 2-methylacetoacetate (MAA) are β-ketoacids accumulated in several metabolic disorders such as diabetes and isoleucinemia, respectively. Here we examine the mechanism of AA and MAA aerobic oxidation initiated by the reactive enzyme intermediates formed by the reaction of muscle horse myoglobin (Mb) with H2O2. A chemiluminescent route involving a dioxetane intermediate whose thermolysis yields triplet α-dicarbonyl species (methylglyoxal and diacetyl) is envisaged. Accordingly, the ultraweak light emission that accompanies the reaction increases linearly by raising the concentration of both Mb (10-500 µM) and AA (10- 100 mM). Oxygen uptake studies revealed that MAA is, expectedly, almost one order of magnitude more reactive than AA. EPR spin-trapping studies with MNP detected spin adducts from MAA attributable to an α-carbon-centered radical (aN = 1.55 mT) and to an acetyl radical (aN = 0.83 mT). As the acetyl radical signal is totally suppressed by sorbate, a well-known efficient triplet species quencher, the dioxetane hypothesis seems to be reliable. The α-cleavage of the carbonyl-carbonyl bond of a putative excited triplet diacetyl product would, in fact, leads to an acetyl radical. Furthermore, using AA as substrate for Mb/H2O2, an EPR signal assignable to a MNP-AA• adduct (aN = 1.46 mT and aH = 0.34 mT) was observed and confirmed by isotope effect. Oxygen consumption and α-dicarbonyl yield were also dependent on AA or MAA concentrations (1-50 mM) as well as on the concentration of peroxide added to the Mb-containing reaction mixtures: H2O2 (up to 1:10 when measuring oxygen uptake and up to 1:25 when measuring the α-dicarbonyl yield) and t-butOOH (up to 1:200). The pH profiles (5.8-7.8) of oxygen consumption and α-dicarbonyl yield show higher reaction rates at lower pHs, indicative of a ferrylMb intermediate. Evaluating Mb lesion, both β-ketoacids reduced disorganization of the secondary and tertiary protein structure elicited by H2O2. Therefore, Mb primary structure was more preserved, and MAA was more protective than AA. Moreover using the later compound, it was shown that Mb acetylation is dose-dependent. Acetoacetate increased the rate of the hemeprotein bleaching, probably due to the attack of triplet products generated in the system. Plantaris and soleous rat muscles exposed to damaging concentrations of glucose oxidase (GOX, generates H2O2 in flux), was cytoprotected by AAE and MAAE. Intracellular diacetyl was detected in muscle samples exposed to MAAE and GOX. The α-dicarbonyl concentration is clearly related to the Mb abundance in the muscle types. In summary, Mb treated with peroxides reacts with β-ketoacid metabolites (AA and MAA), yielding carbon-centered radicals and highly reactive α-dicarbonyl products in the triplet state. Experiments carried out ex vivo with muscle tissue showed that this reaction possibly occurs in vivo. A new route for generation and accumulation of carbonyl reactive species and adducts is here proposed to occur in unbalanced metabolic situations, such as is the case of ketogenic disorders.

Aminoacetona (AA) é um catabólito de Thr e Gly que se acumula nas síndromes cri-du-chat e treoninemia. Atualmente, a oxidação de AA é considerada uma das fontes alternativas de metilglioxal (MG), agente citotóxico e genotóxico, em diabetes mellitus. Em estados de deficiência metabólica, tal como o diabetes, há acúmulo de AA que, por sua vez, sofre oxidação na presença de amino oxidases sensíveis à semicarbazida (SSAO) com a produção de MG, H2O2 e NH4+. As SSAO são enzimas Cu-dependentes, cujo mecanismo de atuação ainda é pouco conhecido e possui como substrato, além de AA, metilamina (endógena) e a benzilamina (xenobiótico). AA possui um grupo amino vicinal à uma carbonila, o que sugere que ela possa sofrer enolização e oxidação catalisada por metal, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs), inclusive radicais HO•. A presente tese tem por objetivo esclarecer o mecanismo pelo qual AA sofre oxidação aeróbica, direta e catalisada por metal, com concomitante produção de EROs. Foi dada ênfase à catalise por ferro por sua implicação em desordens associadas com diabetes. Serão apresentados resultados que implicam AA como promotora de danos a membrana de mitocôndrias isoladas, bem como a estrutura proteica de ferritina e ceruloplasmina (CP). Como ferritina e CP estão envolvidas na homeostase de ferro, os danos causados a estas proteínas por AA possivelmente afetam o estado redox de plasma de diabéticos, contribuindo significantemente para o aumento do estresse oxidativo no diabetes. / Aminoacetone (AA) is a threonine and glycine catabolite long known to accumulate in cri-du-chat and threoninemia syndromes and, more recent1y, implicated as a contributing source of methylglyoxal (MG) in diabetes mellitus. AcetylCoA overproduction in diabetes also leads to AA accumulation. AA as well as many other endogenous (e.g., methylamine) and xenobiotic amines (e.g., benzylamine) are oxidized by dioxygen in the presence of SSAO, a group of poorly understood plasma circulating and membrane bound Cu-dependent enzymes, yielding an aldehyde, H2O2 and NH4+ ions. With AA, SSAO activity paradoxally produces the cytotoxic and genotoxic MG. AA bears an amino group vicinal to the carbonyl function and therefore is expected to undergo phosphate-catalyzed enolization and iron-catalyzed oxidation to yield reactive oxygen species (ROS), including HO• radicals. The present work aims to clarify the mechanisms by which AA undergoes direct and metal-catalyzed aerobic oxidation to yield deleterious ROS, with emphasis on the catalytic role of iron given its well-known implications in diabetes. In the present work we show that ROS generated through the aerobic oxidation of AA are able to induce damage in isolated rat liver mitochondria as well as in horse spleen ferritin (HoSF) and human ceruloplasmin (CP). The current findings of changes in HoSF and CP may contribute to explain intracellular iron-induced oxidative stress during AA accumulation in diabetes mellitus patients.

Há algum tempo, o laboratório de eletrossíntese orgânica do Instituto de Química vem estudando reações de halociclização na obtenção de compostos heterocíclicos de enxofre. No presente trabalho foram utilizados γ-δ e ;-δ-ε alquenil benzil sulfetos e realizados experimentos seguindo duas metodologias diferentes: a química (reações dos substratos com bromo) e a eletroquímica (reações dos substratos com bromo gerado eletroquimicamente). Os experimentos eletroquímicos são mais vantajosos porque dispensam a manipulação de bromo que, neste método, é gerado in situ através da oxidação eletroquímica de íons brometo. As misturas de reação obtidas nestes experimentos foram submetidas à oxidação com ácido m-cloro-perbenzóico ou oxone antes de isolar e caracterizar os produtos formados. Obteve-se resultados diferentes dependendo da metodologia empregada. Para os experimentos realizados com os 2-(1-ciclopentenil)-etilbenzil sulfeto (1a), 2-(1-cicloexenil)-etil-benzil sulfeto (1b) e (5-fenil-4pentenil)-benzil sulfeto (1c) em que foi utilizado bromo, os produtos principais foram os compostos heterocíclicos esperados a saber, hexa-hidro-3a-bromociclopenta[b]tiofeno-S-dióxido (6a), octa-hidro-3a-bromo-benzo[b]tiofeno-Sdióxido (6b) e 2-(1-bromo-1-fenilmetil)-tetra-hidro-tiofeno-S-dióxido (6c) respectivamente, porém o (3-metil-3-butenil)-benzil sulfeto (1d), nas mesmas condições, conduziu à (3,4-dibromo-3-metil-butil)-benzil sulfona (3d). Nos experimentos eletroquímicos, os resultados dependeram do eletrólito de suporte e do tipo de cela utilizados. Em cela dividida, utilizando Et4NClO4 na presença de pequenas quantidades de Et4NBr, o sulfeto (1b) forneceu como produto principal o composto heterocíclico (6b) e o sulfeto (1d) forneceu o perclorato de 3-bromo-3-metil-tetra-hidro-tiofeno-S-benzil sulfônio (4d). Quando apenas Et4NBr foi empregado o produto principai para o sulfeto (1b) foi o composto de adição de bromo à ligação dupla 2-(1,2-dibromocicloexil)-etil-benzil sulfona (7b). Este mesmo substrato fornece como produto principal a 2-(1,2-epóxi-1-cicloexil)-etil-benzil sulfona (11b) quando a eletrólise é realizada em cela não dividida. / The laboratory of organic electrosynthesis of the Instituto de Química has studied halocyclisation reactions to obtain of sulfur heterocyclic compounds. In the present work, γ-δ and δ-ε alkenyl benzyl sulfides were employed and experiments were carried out using two methodologies, a chemical (substrate reactions with bromine) and an electrochemical (substrate reactions with bromine generated electrochemically). The electrochemical experiments are more suitable because they avoid handling of bromine which is generated in situ by electrochemical oxidation. The crude reaction products were oxidized with m-chloroperbenzoic acid or oxone before their separation and characterization. Different results were obtained depending upon the methodology used. When 2-benzylthio-1-(1-cyclopentene)-ethane (1a), 2-benzylthio-1-(1-cyclo hexene)-ethane (1b) and 5-benzylthio-1-phenyl-1-pentene (1c) reacted with bromine the expected cyclic compounds hexahydro-3a-bromocyclopentan [b]thiophene-S-dioxide (6a), octahydro-3a-bromobenzo[b]thiophene-S-dioxide (6b) and 2-(1-bromo-1-phenylmethyl)tetrahydro-thiophene-S-dioxide (6c) respectively, were obtained, but (3-methyl-3-butenyl) benzyl sulfide (1d) yielded (3,4-dibromo-3-methylbutyl) benzyl sulfone (3d). In the electrochemical experiments, the structure of the products depends on the salt used as electrolyte and the type of cell used in the electrolyses. In a divided cell, when Et4NClO4 in the presence of small amounts of Et4NBr was employed, the main product from sulfide (1b) was compound (6b) whereas (3-methyl-3-butenyl) benzyl sulfide (1d) yielded 3-bromo-3-methyltetrahydrothiophene-S-benzyl sulfonium perchlorate (4d). Using only Et4NBr as electrolyte (1b) gave 2-(1,2-dibromocyclohexyl)ethyl benzyl sulfone (7b). The same substrate (1b) when electrolysed in an undivided cell, and otherwise same experimental conditions, afforded, as major product, 2-(1,2-epoxy-1-cyclohexyl)ethyl benzyl sulfone (11b).

Acetoacetato (AA) e 2-metilacetoacetato (MAA) são compostos β-cetoácidos acumulados em diversas desordens metabólicas como no diabetes e na isoleucinemia, respectivamente. Examinamos o mecanismo de oxidação aeróbica de AA e MAA iniciada por intermediários reativos de mioglobina de coração de cavalo (Mb) gerados pela adição de H2O2. Uma rota quimioluminescente que envolve um intermediário dioxetânico cuja termólise gera espécies α-dicarbonílicas (metilglioxal e biacetilo) foi proposta e estudada. Emissão de luz ultra fraca acompanha a reação, e sua intensidade aumenta linearmente pelo aumento da concentração tanto de Mb (10-500 µM) quando AA (10-100 mM). Estudos de consumo de oxigênio mostraram que MAA é, como esperado, quase uma ordem de grandeza mais reativo que AA. Estudos de EPR com captação de spin, utilizando MNP, possibilitaram detectar adutos de MAA atribuíveis a um radical centrado no Cα (aN = 1.55 mT) e ao radical acetila (aN = 0.83 mT). O sinal do radical acetila é totalmente suprimido por sorbato, um conhecido e eficiente supressor de espécies tripletes, o que é consistente com uma rota reacional envolvendo um intermediário dioxetânico. Clivagem-α da ligação carbonila-carbonila do produto biacetilo triplete produziria, de fato, radicais acetila. Além disso, utilizando AA como substrato para Mb/H2O2, um sinal de EPR atribuível ao aduto MNP-AA• (aN = 1.46 mT e aH = 0.34 mT) foi observado e confirmado por efeito isotópico. O consumo de oxigênio e o rendimento de compostos α-dicarbonílicos foram dose-dependentes à concentração de AA ou MAA (1-50 mM) bem como à concentração de H2O2 adicionado às misturas de reação contendo Mb (até 1:10 quando medido o consumo de oxigênio, e até 1:25 quando medido o rendimento de compostos α-dicarbonílicos) e tert-butilhidroperóxido (até 1:200). Os perfis de pH (5,8-7,8) para consumo de oxigênio e rendimento de compostos α-dicarbonílicos mostraram maiores rendimentos para baixos valores de pH, indicativo de ferrilMb formada no ciclo peroxidático da proteína. Avaliando os níveis de lesão de Mb, os β-cetoácidos diminuíram o nível de desorganização protéica na estrutura secundária e terciária elicitada por H2O2. Ainda, houve maior preservação da estrutura primária da proteína, sendo que MAA protegeu mais em comparação a AA, embora quando utilizado este último composto, foi mostrado que há acetilação dose-dependente de Mb. Acetoacetato aumentou a velocidade de descoramento da hemeproteína, provavelmente por ataque de espécies tripletes geradas no sistema. Músculos de rato, plantar e sóleo, expostos ex vivo a concentrações citotóxicas de glicose oxidase (GOX, gera H2O2 em fluxo), foram protegidas pelos ésteres etílicos AAE e MAAE. Foi detectado biacetilo no meio intracelular em músculos expostos a MAAE e GOX. A concentração deste composto α-dicarbonílico é claramente relacionada à abundância de Mb em cada um dos tipos de músculos estudados. Em resumo, Mb tratada com metabólitos β-cetoácidos (AA e MAA) gera radicais centrados em carbono e produtos α-dicarbonílicos altamente reativos no estado triplete. Experimentos realizados com tecido muscular ex vivo sugerem que esta reação possivelmente ocorra in vivo. Levantamos a hipótese de que a geração de espécies carbonílicas reativas e seus adutos em condições de desbalanço metabólico possam contribuir para a compreensão das bases moleculares de desordens cetogênicas. / Acetoacetate (AA) and 2-methylacetoacetate (MAA) are β-ketoacids accumulated in several metabolic disorders such as diabetes and isoleucinemia, respectively. Here we examine the mechanism of AA and MAA aerobic oxidation initiated by the reactive enzyme intermediates formed by the reaction of muscle horse myoglobin (Mb) with H2O2. A chemiluminescent route involving a dioxetane intermediate whose thermolysis yields triplet α-dicarbonyl species (methylglyoxal and diacetyl) is envisaged. Accordingly, the ultraweak light emission that accompanies the reaction increases linearly by raising the concentration of both Mb (10-500 µM) and AA (10- 100 mM). Oxygen uptake studies revealed that MAA is, expectedly, almost one order of magnitude more reactive than AA. EPR spin-trapping studies with MNP detected spin adducts from MAA attributable to an α-carbon-centered radical (aN = 1.55 mT) and to an acetyl radical (aN = 0.83 mT). As the acetyl radical signal is totally suppressed by sorbate, a well-known efficient triplet species quencher, the dioxetane hypothesis seems to be reliable. The α-cleavage of the carbonyl-carbonyl bond of a putative excited triplet diacetyl product would, in fact, leads to an acetyl radical. Furthermore, using AA as substrate for Mb/H2O2, an EPR signal assignable to a MNP-AA• adduct (aN = 1.46 mT and aH = 0.34 mT) was observed and confirmed by isotope effect. Oxygen consumption and α-dicarbonyl yield were also dependent on AA or MAA concentrations (1-50 mM) as well as on the concentration of peroxide added to the Mb-containing reaction mixtures: H2O2 (up to 1:10 when measuring oxygen uptake and up to 1:25 when measuring the α-dicarbonyl yield) and t-butOOH (up to 1:200). The pH profiles (5.8-7.8) of oxygen consumption and α-dicarbonyl yield show higher reaction rates at lower pHs, indicative of a ferrylMb intermediate. Evaluating Mb lesion, both β-ketoacids reduced disorganization of the secondary and tertiary protein structure elicited by H2O2. Therefore, Mb primary structure was more preserved, and MAA was more protective than AA. Moreover using the later compound, it was shown that Mb acetylation is dose-dependent. Acetoacetate increased the rate of the hemeprotein bleaching, probably due to the attack of triplet products generated in the system. Plantaris and soleous rat muscles exposed to damaging concentrations of glucose oxidase (GOX, generates H2O2 in flux), was cytoprotected by AAE and MAAE. Intracellular diacetyl was detected in muscle samples exposed to MAAE and GOX. The α-dicarbonyl concentration is clearly related to the Mb abundance in the muscle types. In summary, Mb treated with peroxides reacts with β-ketoacid metabolites (AA and MAA), yielding carbon-centered radicals and highly reactive α-dicarbonyl products in the triplet state. Experiments carried out ex vivo with muscle tissue showed that this reaction possibly occurs in vivo. A new route for generation and accumulation of carbonyl reactive species and adducts is here proposed to occur in unbalanced metabolic situations, such as is the case of ketogenic disorders.

Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit produït com a conseqüència del pèptid beta-amiloide (A) contribueix l'augment de la relació A42/A40 que ocorre a la malaltia d'Alzheimer. L'A42 contribueix a l'aparició de la malaltia degut a la seva major toxicitat (quan es compara amb l'A40) que resulta d'una gran estabilitat i capacitat agregativa. A més el peroxinitrit incrementa la toxicitat d'aquest degut a què potencia la seva agregació en forma d'oligomers altament tòxics. De fet els oligomers formats de nitro-A42 presenten una major toxicitat que aquells formats de A42 . En conjunt aquest resultats senyalen l'important paper que l'A42 té en la malaltia d'Alzheimer. Per altra banda, des de la identificació dels agregats d'A i la subseqüent formació dels cabdells neurofibrilars (NFT) com a els dos trets distintius de la malaltia, un gran esforç s'ha dedicat a establir els mecanismes moleculars que uneixen ambdós processos. Aquesta tesi demostra que el peroxinitrit format a partir de l'agregació de d'Ai la conseqüent nitrotirosinació de proteïnes, potencia l'agregació de la proteïna tau en forma de fibres. D'aquesta forma, la nitrotirosinació de la proteïna triosafosfat isomerasa (TPI) podria ser el vincle entre la toxicitat derivada del agregats d'Ai la patologia derivada de la proteïna tau. Per tant, la nitrotirosinació de la TPI podria explicar la progressió temporal que ocorre als cervells de pacients amb la malaltia d'Alzheimer des de la toxicitat induïda per l'Ai l'aparició dels NFT. Els resultats presentats en aquesta tesi podrien obrir nous aspectes en la recerca de la malaltia d'Alzheimer així com en altres malalties que cursin amb estrès oxidatiu i plegament erroni de proteïnes. / This thesis demonstrates that amyloid ß-peptide (Aß)-induced peroxynitrite contributes to the switch of the Aβ42/Aβ40 ratio that occurs in Alzheimer's disease (AD). Since Aβ42 is more toxic due to its higher aggregation and stability, it contributes to the trigger of the disease. In addition the aggregation of Aβ42 in form of the highly toxic oligomers is incremented by the presence of peroxynitrite. Moreover, these nitro-Aß42 oligomers are more toxic than those non-nitrated. All these results support the important role of peroxynitrite in AD etiology. Furthermore, since the identification of Aß accumulation and the subsequent formation of neurofibrillary tangles (NFT) as the two defining pathological hallmarks of AD, a fair amount of research on AD has been driven by the need to find the molecular mechanism linking Aß and NFT. This thesis shows the Aß-induced peroxynitrite, and the consequent nitrotyrosination of proteins, promotes tau fibrillization. Thus triosephosphate isomerase (TPI) nitrotyrosination could be the link between Aß-induced toxicity and tau pathology. Therefore, TPI nitrotyrosination may explain the temporal progression from Aß toxicity to NFT formation in AD brain. The work presented in this thesis could open a novel angle in the research of the pathophysiology of AD and could also have an impact to the research in other neurodegenerative diseases involving oxidative stress and protein misfolding.