O sulforafano (SFN) é um composto natural que possui propriedades antioxidantes, estimulando, principalmente, o sistema antioxidante endógeno celular. Este composto está associado a uma via clássica de ativação, a via do fator eritroide nuclear tipo 2 (Nrf2). Entretanto, estudos mais recentes têm demonstrado que a ação do SFN também pode se dar pela via do coativador 1-alfa do receptor ativado por proliferador do peroxissoma (PGC-1α). A diferença da via de ativação pelo SFN parece ter relação com o tempo de exposição das células a este composto. Visto que o SFN é uma importante estratégia terapêutica no combate ao estresse oxidativo, que está relacionado ao desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares, a investigação do seu mecanismo de ação é necessária. A análise in vitro é uma ferramenta importante para a investigação das vias e tempos de incubação envolvidos na ação antioxidante do SFN. Sendo assim, a cultura primária de cardiomiócitos de ratos adultos é um dos modelos que pode ser utilizado, sendo a sua principal vantagem, o fato da fisiologia destas células se aproximar mais das condições fisiológicas in vivo. O objetivo deste estudo, então, foi analisar a estimulação de defesas antioxidantes feita pelo SFN, através das vias do Nrf2 e do PGC-1α, em tempos diferentes, utilizando a técnica de cultura de cardiomiócitos adultos. Ratos Wistar machos foram eutanasiados, para que seus corações fossem retirados e submetidos ao processo de isolamento de células cardíacas, em aparelho de Langendorff modificado. As células foram isoladas através da perfusão do coração com solução de Krebs e colagenase tipo II, por um período de 30 minutos. Após isso, as células isoladas foram plaqueadas e mantidas em incubadora a 37°C e 5% de CO2. Foi realizado o tratamento com 5 μM de SFN e/ou 5 μM de peróxido de hidrogênio (H2O2). As células foram divididas nos seguintes grupos experimentais: Controle, SFN, H2O2 e SFN+H2O2. Os grupos foram subdivididos em dois tempos de incubação: 1 e 24 horas. Foram realizadas as análises dos níveis totais de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de lipoperoxidação (LPO); atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa s-transferase (GST); expressão proteica das isoformas citosólica (SOD-1) e mitocondrial (SOD-2) da SOD, e dos fatores Nrf2 e PGC-1α. Os resultados do trabalho mostram que, em relação ao tempo de 1 hora, o SFN incubado por 24 horas aumentou em 59% a atividade da SOD, 55% a expressão proteica da SOD-1, 24% a expressão proteica da SOD-2 e 69% a expressão proteica do PGC-1α. A expressão do Nrf2 foi 17% maior no tempo de 1 hora, em relação a 24 horas. Em relação à atividade da catalase e aos níveis de ROS e de LPO, houve diferença somente nos grupos incubados por 1 hora, nos quais a atividade da CAT foi menor no grupo H2O2, os níveis de ROS estavam diminuídos no grupo SFN, e os níveis de LPO estavam maiores no grupo H2O2. Não foram encontradas diferenças em relação à atividade da GST. Como conclusão, o SFN demonstrou um papel protetor nos grupos 1 hora, impedindo a geração de ROS e de dano a lipídeos, apesar de não apresentar um efeito expressivo sobre as enzimas antioxidantes. O efeito dos tempos de incubação na expressão do Nrf2 (aumentada em 1 hora) e do PGC-1α (aumentada em 24 horas) mostrou que realmente há uma relação temporal entre a sinalização destas duas vias, ativadas pelo SFN. Este resultado é instigante para que futuras análises dessa relação temporal das vias do SFN sejam realizadas. / Sulforaphane (SFN) is a natural compound that has antioxidant properties, mainly stimulating the endogenous cellular antioxidant system. This compound is associated with a classical pathway of activation, the nuclear erythroid factor 2 (Nrf2) pathway. However, more recent studies have shown that the action of SFN can also occur through the peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1-alpha (PGC-1α). The difference in the pathway of activation by SFN seems to be related to the time of exposure of the cells to this compound. Since SFN is an important therapeutic strategy in the fight against oxidative stress, which is related to the development of various cardiovascular diseases, the investigation of its mechanism of action is necessary. In vitro analysis is an important tool for investigating the pathways and incubation times involved in the antioxidant action of SFN. Thus, a primary culture of adult mouse cardiomyocytes is one of the models that can be used, the main advantage being that the physiology of these cells are closer to the physiological conditions in vivo. The objective of this study was to use adult cardiomyocyte culture technique to analyze the stimulation of antioxidant defenses by SFN through Nrf2 and PGC-1α pathways at different times. Male Wistar rats were euthanized, so that their hearts were removed and submitted to the process of isolation of cardiac cells, in modified Langendorff apparatus. Cells were isolated by perfusion of the heart with Krebs solution and type II collagenase for a period of 30 minutes. After that, the isolated cells were plated and incubated at 37°C and 5% CO2. Treatment was performed with 5μM SFN and/or 5μM hydrogen peroxide (H2O2). Cells were divided into the following experimental groups: Control, SFN, H2O2 and SFN+H2O2. The groups were subdivided into two incubation times: 1 and 24 hours. Analyzes of total oxygen reactive species (ROS) and lipoperoxidation (LPO) levels were performed; activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione s-transferase (GST); protein expression of citosolic (SOD-1) and mitochondrial (SOD-2) isoforms of SOD, as well as Nrf2 and PGC-1α factors. The results of this work show that, compared to 1 hour time, SFN incubated for 24 hours increased SOD activity by 59%, SOD-1 protein expression by 55%, SOD-2 protein expression by 24%, and 69% PGC-1α protein expression. Expression of Nrf2 was 17% higher at 1 hour, over 24 hours of incubation. Regarding catalase activity and ROS and LPO levels, there were differences only in the groups incubated for 1 hour, in which the CAT activity was lower in H2O2 group, the ROS levels were decreased in SFN group, and levels of LPO were higher in H2O2 group. No differences were found in relation to GST activity. In summary, SFN demonstrated a protective role in 1 hour groups, preventing generation of ROS and lipid damage, although it does not present an expressive effect on the expression of antioxidant enzymes. The effect of incubation times on expression of Nrf2 (increased by 1 hour) and PGC-1α (increased by 24 hours) showed that there is actually a temporal relationship between the signaling of these two pathways, activated by SFN. This result is instigating for future analyzes of this temporal relationship of SFN pathways to be performed.

O estudo de mutações genéticas como causa das cardiomiopatias teve início com a descoberta de mutações em proteínas sarcoméricas que levavam à Cardiomiopatia Hipertrófica, desde então, alterações em diversos genes, de proteínas contráteis ou não, foram descobertas e listadas como a responsável pelo desenvolvimento de diferentes cardiomiopatias. Estudar o efeito destas mutações nos cardiomiócitos destes pacientes permanecia um desafio devido ao difícil acesso às células cardíacas. Em 2007, a técnica de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes foi descoberta. Pelo fato das células-tronco pluripotentes serem capazes de ser diferenciadas em cardiomiócitos, surgiu-se a possibilidade de se estudar essas células de indivíduos portadores das mutações genéticas. Esta tese teve como objetivo a criação de um modelo celular para estudar a Cardiomiopatia Hipertrófica causada por mutações genéticas. Inicialmente foi estabelecido um protocolo de reprogramação celular para se estabelecer linhagens celulares das células-tronco induzidas de um paciente com mutação no gene MYH7. Tendo as células caracterizadas, elas foram diferenciadas em cardiomiócitos através de um protocolo adaptado de protocolos de diferenciação direta em cardiomiócitos. Os cardiomiócitos gerados apresentaram características moleculares e funcionais semelhantes à cardiomiócitos primários humanos e foi visualizado, através de microscopia eletrônica de transmissão, que os cardiomiócitos do paciente com alteração genética possuíam grande proporção de sarcômeros desorganizados em comparação a cardiomiócitos de indivíduos saudáveis. Em conclusão, o modelo celular desenvolvido sugere ser possível o estudo do efeito de mutações genéticas em Cardiomiopatia Hipertrófica. / The study of genetic mutations as the cause of cardiomyopathies initiates with the discovery of mutations in sarcomeric proteins genes that lead to Hypertrophic Cardiomyopathy. Since then, mutations in several genes, coding to sarcomeric proteins or not, were discovered and listed as the reason to the cardiomyopathies. To study the effect of these mutations was a challenge due the difficulty to accesses cardiac cells. In 2007, the technique of reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells was discovered. The fact that the pluripotent stem cells are capable of differentiating into cardiomyocytes opened the opportunity to study these cells from individuals with genetic mutations. This thesis aimed to create a cellular model to study Hypertrophic Cardiomyopathy caused by genetic mutations. Initially we established a cell reprogramming protocol to establish induced stem cells lines from a patient with mutation in MYH7 gene. Having characterized the cells, they were differentiated into cardiomyocytes using an adapted protocol from direct differentiation protocols. Cardiomyocytes generated showed molecular and functional characteristics similar to human primary cardiomyocytes and were visualized by means of transmission electron microscopy. The patient\'s cardiomyocytes had a large proportion of disorganized sarcomeres compared to cardiomyocytes from healthy individuals. In conclusion, the cell model developed suggests that it is possible to study the effect of genetic mutation in Hypertrophic Cardiomyopathy using induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_D.pdf: 34867811 bytes, checksum: 839d8dbb3d76170bebebbc5e8619b847 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos do nosso laboratório demonstraram que a quinase de adesão focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação dos mecanismos de sinalização que determinam as alterações fenotípicas de cardiomiócitos submetidos a estímulos mecânicos. Em estudo anterior demonstramos através da inibição farmacológica da Shp2, que a mesma contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina (atividade) da FAK e regulação da expressão de genes associados ao fenótipo hipertrófico em células em cultura. O presente estudo foi realizado para examinar o impacto da depleção da Shp2,induzida por silenciamento gênico, na atividade da FAK e nas alterações fenotípicas de Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) em condições basais e de estímulo mecânico e os efeitos da introdução de mutações no gene da Shp2, que resultem em perda, ganho ou deleção da proteína, sobre a atividade da FAK e sobre as alterações fenotípicas nos corações de camundongos. A depleção dos níveis protéicos da Shp2 por siRNA específico induziu ao aumento da fosforilação da Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, e S6 quinase Thr389, à re-expressão do gene fetal marcador molecular de hipertrofia cardíaca (?-MHC) e à um fenótipo hipertrófico dos MVRNS não estirados. A inibição da atividade do complexo FAK/Src através do tratamento dos MVRNs com PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine}aboliu o aumento na fosforilação da AKT, TSC2, e S6 quinase, bem como a hipertrofia dos MVRNs induzida pela depleção da Shp2. A inibição da mTOR (mammalian target of rapamycin) com rapamicina bloqueou o surgimentos da hipertrofia nos MNRNs tratados com siShp2. Os MVRNs tratados com PP2 ou com RNA de interferência, específico para a FAK, apresentaram-se deficientes na ativação e aumento da fosforilação da FAK, Src, ERK (extracellular signal-regulated kinase), AKT, TSC2, e S6 quiinase, e na indução de aumento da área celular em resposta ao estimulo mecânico de estiramento cíclico prolongado in vitro. A Hipertrofia em resposta ao estiramento prolongado também foi prevenida pelo tratamento dos MVRNs com rapamicina. Os resultados são consistentes em apontar que a perda ou diminuição da função da Shp2 (por depleção, mutação ou deleção gênica cardíaco-específica) induz ao aumento da ativação da FAK, AKT e via da mTOR/S6K , que são vias de sinalização sabidamente envolvidas nos processos hipertróficos do miocárdio. Interessantemente os animais portadores de mutação LS-Shp2 apresentaram redução de 50% da atividade fosfatase relacionada ao imunoprecipitado de Shp2 no miocárdio, recapitularam a desordem humana apresentando baixa estatura, dismorfia craniofacial, evidências morfológica, histopatológica, ecocardiográficas e molelculares de presença de cardiomiopatia hipertrófica. Notavelmente o tratamento desses animais com o inibidor específico da mTOR, rapamicina, foi capaz de reverter completamente o fenótipo hipertrófico dos animais LS-Shp2. Consistentemente, o ganho de função da Shp2 (no miocárdio), induzido por mutação NS (Noonan Syndrome), foi acompanhado de diminuição da atividade basal da FAK, bem como da AKT e de proteínas envolvidas na via da mTOR e de redução da área total e largura dos cardiomiócitos adultos quando comparados aos extraídos de animais selvagens. Em conjunto, os dados, aqui apresentados, indicam que a tirosino-fosfatase Shp2 contribui para regular o nível de fosforilação da FAK em cardiomiócitos e para a regulação da expressão de gêneses do programa hipertrófico e do tamanho celular através da modulação da atividade da FAK e mTOR. Sugere também, que a inibição prolongada de Shp2 pode, por si só, induzir ao aparecimento de hipertrofia cardíaca através da FAK pela modulação da via mTOR/S6K / Abstract: Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces, which drive changes in cardiac myocyte function and structure, in response to hemodynamic overload, into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether Shp2 (Src homology region 2, phosphatase 2) controls Focal Adhesion Kinase (FAK) activity and its trophic actions in cardiomyocytes. Our study was performed in neonatal rat ventricular myocytes subjected to depletion of Shp2 by RNA interference and genetically modified mice carrying mutations that induce gain and loss of function and Shp2 cardiac-specific conditional gene deletion.Depletion of Shp2 by specific small interfering RNA increased the phosphorylation of FAK Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 and induced hypertrophic gene expression pattern (?- MHC) and phenotype of nonstretched NRVMs. Inhibition of FAK/Src activity by PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7- (t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine} abolished the phosphorylation of AKT, TSC2, and S6 kinase, as well as the hypertrophy of NRVMs induced by Shp2 depletion. Inhibition of mTOR (mammalian target of rapamycin) with rapamycin blunted the hypertrophy in NRVMs depleted of Shp2. NRVMs treated with PP2 or depleted of FAK by specific small interfering RNA were defective in FAK, Src, extracellular signal-regulated kinase, AKT, TSC2, and S6 kinase phosphorylation, as well as in the hypertrophic response to prolonged stretch. The stretch-induced hypertrophy of NRVMs was also prevented by rapamycin. Subsequently we tested the hypothesis that the introduction of mutations in the Shp2 gene, causing protein deletion or loss of protein function, would contribute to increase the levels of tyrosine phosphorylation of FAK resulting in a hypertrophic phenotype in mice hearts. Likewise, we investigated the possibility that the introduction of a mutation in the Shp2 gene, which leads to gain of function, would result in decrease phosphorylation of FAK. The results were consistent in pointing out that the loss of protein or impairment of the function of Shp2 (gene deletion, depletion or mutation) induces increased activation of FAK, AKT and a the mTOR/S6K pathways, which are signaling pathways known to be involved in controlling cardiac growth and hypertrophy. Ls-Shp2 mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphological, histological, echocardiographic and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS-Shp2 mice showed decreased Shp2 catalytic activity, consistent with previous reports that LS mutants have dominant negative effects. Remarkably, the cardiac hypertropic phenotype in LS-Shp2 mice were completely reversed by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin. Consistently, the gain of function of Shp2 (induced by mutation) was accompanied by decreased basal activity of FAK and AKT and proteins involved in the mTOR signaling pathway. These findings demonstrate that basal Shp2 tyrosine phosphatase activity controls the size of cardiomyocytes by downregulating a pathway that involves FAK/Src and mTOR signaling pathways. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by Shp-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_M.pdf: 14587191 bytes, checksum: b8bac41b29ca5081a5bcb225f83e4773 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Arrazoado. A Quinase de Adesão Focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação da sinalização que determina as alterações fenotípicas de cardiomiócitos estimulados mecanicamente. A regulação da atividade da FAK é complexa e depende de mecanismos intramoleculares e da cooperação com a tirosino-quinase Src. Há evidências de que a tirosino-fosfatase SHP-2 contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina e, portanto da atividade da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Este estudo objetivou examinar se a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs. Examinamos se em MVRNs controle (i.e. não submetido a estímulo mecânico), a atividade da SHP-2 contribui para o baixo nível de fosforilação em tirosina da FAK e se em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos a inibição da atividade da SHP-2 paralela a dissociação FAK/SHP-2 exerce papel permissivo na elevação da fosforilação da FAK. Material e Métodos. Utilizou-se modelo de sobrecarga pressora por coarctação da aorta em ratos (miocárdio-VE) e estiramento in vitro em MVRNs. As abordagens experimentais incluíram técnicas de imunoprecipitação, western blot, imunohistoquímica, atividade de tirosino fosfatase in vitro, expressão de SHP-2 recombinante e avaliação da expressão do gene da cadeia pesada de beta-miosina (ß- miosina). Resultados. A coarctação da aorta (miocárdio-VE) e o estiramento (MVRNs) aumentaram a fosforilação da FAK no resíduo tirosina 397, em miocárdio-VE (200%) e em MVRNs estirados (75%). A FAK imunoprecipitada de amostras controles, encontrou-se associada a SHP-2 e o estímulo mecânico acompanhou-se de redução dessa associação, no miocárdio (60%) e em MVRNs (84%). Experimentos com imunohistoquímica e microscopia confocal demonstraram co-localização da FAK e da SHP-2 em MVRNs controle. Ocorreu redução da atividade de tirosino-fosfatase em imunoprecipitados de anticorpo anti-FAK (25%) e anticorpo anti-SHP-2 (25%) de miocárdio-VE de animais submetidos à coarctação da aorta, e anti-FAK (20%) e anti-SHP-2 (40%) de MVRNs estirados. A SHP-2 recombinante foi capaz de reduzir (70%) in vitro a fosforilação da FAK ativada por estímulo mecânico. Ocorreu aumento (125%) da quantidade de FAK fosforilada em MVRNs controles tratados com TFMS (inibidor seletivo da atividade da SHP-2); naqueles submetidos ao estiramento, o aumento em relação aos MVRNs estirados, mas não tratados com TFMS, foi menor (40%). Ocorreu paralelamente, diminuição (40%) da associação FAK/SHP-2 e aumento da expressão do gene fetal da cadeia pesada da ß - miosina (110%) em MVRNs tratados com TFMS; Os MVRNs tratados concomitantemente com TFMS e PP2 (inibidor farmacológico da FAK), apresentaram atenuação desse aumento (25%). Conclusão. Os dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs, exercendo papel inibitório na ativação da FAK, contribuindo para o seu baixo nível de fosforilação em MVRNs e miocárdio na ausência de estímulo mecânico. A diminuição da associação FAK/SHP-2, da atividade específica da SHP-2 em MVRNs ou miocárdio submetidos a estímulos mecânicos e o aumento da fosforilação da FAK mediante tratamento dos MVRNs com TFMS, indicam que a redução da atividade da SHP-2 e da associação a FAK, é um importante mecanismo que colabora para o aumento de fosforilação da FAK em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos sustentados. O aumento da expressão da cadeia pesada da ß ¿ miosina conseqüente à inibição da atividade da SHP-2 e a atenuação desse aumento, perante a concomitante inibição da atividade da FAK, corrobora nossa hipótese de que a SHP-2 modula a ativação da FAK em cardiomiócitos, influenciando a reprogramação gênica característica da ativação da sinalização hipertrófica, por estímulo mecânico / Abstract: Mechanical forces drive changes in cardiac myocyte function and structure that occur in response to hemodynamic overload. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether the protein tyrosine-phosphatase SHP-2 plays a role in baseline and stretch induced FAK activation and signaling in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs).NRVMs were subjected to cyclic stretch up to 60 min, studied by coimmunoprecipitation, immunoblotting, tyrosine-phosphatase activity assay, RT-PCR, and used in assays utilizing recombinant SHP-2 catalytic domain. Analysis was extended to NRVMs treated with Shp2 inhibitor TFMS and with FAK/Src Inhibitor PP2. FAK had a relatively low basal level of phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs. Cyclic stretch (1HZ, 10%) induced rapid and sustained (up to 60 min) increases in phosphorylation of FAK at Tyr397. The results of coimmunoprecipitation assays indicated that FAK and SHP-2 are associated in non-stretched NRVMs, but cyclic stretch markedly reduced (to 25% and 60% after 10 and 60 min, respectively) the amount of SHP-2 recovered from the anti-FAK antibody precipitates. The tyrosine phosphatase activity of the anti-SHP-2 immunocomplex taken from non-stretched cardiac myocytes was relatively high, but it was markedly reduced (to 60% after 10 and 60 min) in samples of stretched cells. The recombinant PTP domain of SHP-2 was demonstrated to be able to dephosphorylate the native FAK immunoprecipitated from NRVMs. The inhibition of SHP-2 activity by the pharmacological inhibitor TFMS markedly increased FAK phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs to levels comparable to those seen in stretched cells. Treatment with TFMS lasting for 4h was accompanied by a marked increase (to 200) the expression of beta-myosin heavy chain mRNA in non-stretched NRVMs. This effect was attenuated by 25% in NRVMs simultaneous treated with the FAK/Src inhibitor PP2.In conclusion, the present data demonstrated that the basal FAK phosphorylation at Tyr397 is modulated by SHP-2 and that inhibition of SHP-2 during cyclic stretch has a permissive role on FAK activation by mechanical stress. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by SHP-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadores: José Wilson Magalhães Bassani, Rosana Almada Bassani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-26T11:22:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milan_HugoFernandoMaia_M.pdf: 2735459 bytes, checksum: 650eb9ee4f85d8ff73ae612f72ae3534 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Tendo em vista que a estimulação com campos elétricos externos (E) é utilizada na prática clínica para tratamento de arritmias cardíacas, é necessário um melhor entendimento do fenômeno de polarização da membrana plasmática de cardiomiócitos por E. O disparo de potencial de ação, e subsequente contração celular, induzido por E em cardiomiócitos depende da indução de variação do potencial elétrico transmembrana (?Vm) que leve este potencial ao valor limiar. Devido às limitações dos métodos atualmente disponíveis para medir ?Vm e seu valor máximo, ?Vmax, os modelos eletromagnéticos representam uma importante ferramenta para sua estimativa. Porém, os valores calculados dependem de como o fenômeno de polarização da membrana é modelado. Os modelos eletromagnéticos encontrados na literatura aproximam a forma irregular do cardiomiócito a formas geométricas regulares. Entretanto, até o momento, não se sabe qual destes modelos é o mais adequado para se estimar ?Vm. As células miocárdicas apresentam irregularidades em sua forma e, tanto a forma quanto as dimensões das células alteram-se com o desenvolvimento pós-natal. Neste trabalho, foi desenvolvido um modelo numérico tridimensional (MN3D) da forma irregular da célula, e comparou-se as estimativas de ?Vm induzida por E limiar (?VL) feitas com este modelo e com modelos simplificados, entre estes o modelo numérico bidimensional (MN2D) e os modelos analíticos para cilindro (MACil), esfera (MAEsf), esferóide prolato (MAEsPr) e elipsóide (MAElip). Para estimar ?VL, E limiar e as dimensões celulares foram medidos em células cardíacas isoladas de ratos neonatos (5-7 dias), infantes (28-32 dias) e adultos (4-6 meses), em 6 faixas de ângulos entre a direção de aplicação do campo e o eixo maior da célula. Os modelos foram calibrados do ponto de vista eletromagnético, o que mostrou que, MN2D e MACil são inadequados para estimar ?Vmax. Enquanto as estimativas de ?VL com MN3D e MAEsPr não variaram com o ângulo, mas sim com a idade, o oposto ocorreu com as estimativas feitas com o MAElip. Dentro de certas condições, as estimativas de ?VL feitas com MAEsPr foram as mais próximas daquelas feitas com MN3D. Conclui-se que o MAEsPr, menos complexo tecnicamente, pode fornecer estimativas confiáveis de ?VL, desde que o ângulo de aplicação de E seja pequeno (até 30º) / Abstract: Considering that stimulation with external electrical fields (E) is clinically used for arrhythmia treatment, it is important to understand the phenomenon of membrane polarization by E. Action potential and contraction triggering by E in cardiomyocytes depends on the induction of a transmembrane potential variation (?Vm) sufficient for the attainment of the excitation threshold. Due to the limitations of the methods currently available for measurement of ?Vm and its maximum value, ?Vmax, electromagnetic models represent an important tool for this purpose. However, the calculated values depend on how the membrane polarization phenomenon is modeled. The electromagnetic models available in the literature approximate the cardiomyocyte irregular shape to regular geometries. Nevertheless, it has not been ascertained yet which model is the most appropriated to estimate ?Vmax in these cells, of which both dimensions and shape vary markedly during postnatal development, and often present geometric irregularities. Thus, approximation of the cell shape to regular geometries may result in a considerable error in the ?Vm estimation. The aim of this study was to develop a three-dimensional numerical model (MN3D) based on the irregular cell shape and to compare the values of ?Vmax induced by the threshold E (?VL) estimated with this model with those calculated with simplified models, such as the twodimensional numerical model (MN2D) and the analytical models for cylinder (MACil), sphere (MAEsf), prolate spheroid (MAEsPr), and ellipsoid (MAElip). To estimate ?VL, the threshold E and cell dimensions were measured in cardiomyocytes isolated from neonatal (5-7 days), weaning (28-32 days) and adult (4-6 months) rats, for 6 ranges of the angle between the directions of E and the cell major axis. Electromagnetic calibration of the models showed that MN2D and MACil were not suitable for ?Vmax estimation in these cells. While ?VL estimated with MN3D and MAEsPr were angle-independent, but dependent on the animal's age, the opposite was observed regarding the estimates made with MAElip. Under certain conditions, ?VL values estimated with MAEsPr were the closest to those obtained with MN3D. It is concluded that MAEsPr, a less technically complex model, can provide reliable ?VL estimates provided that the angle between the directions of E and the cell major axis is small (up to 30º) / Mestrado / Engenharia Biomedica / Mestre em Engenharia Elétrica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Consonni_SilvioRoberto_D.pdf: 7954683 bytes, checksum: 766ce32e5bbb5a5c0b8cc78fd2735dc0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Há um crescente avanço no desenvolvimento das tecnologias que permitam a localização de proteínas em células por microscopias de luz e eletrônica combinadas, com o uso das sondas moleculares miniSOG e Apex2, por exemplo. Adicionalmente busca-se compreender como proteínas são responsáveis pelas funções celulares e teciduais. A Quinase de Adesão Focal (FAK), proteína da cascata de sinalização das integrinas é considerada uma mediadora em potencial do estresse mecânico nos cardiomiócitos. Sabe-se que em cardiomiócitos submetidos a estímulos hipertróficos, ocorre rápida ativação da FAK e sua redistribuição subcelular, contudo são pouco conhecidos os mecanismos envolvidos nesses processos. Outra proteína de grande importância no coração é a Calsarcina-1 (CS1), regulador negativo da via de Calcineurina, crucial no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. Entretanto os mecanismos envolvidos nessa regulação negativa, assim como a distribuição subcelular de CS1 são pouco conhecidos. Visando à interação entre essas áreas para estudo da distribuição espaço-temporal dos componentes celulares e de proteínas, bem como a importância da FAK e CS1 no sarcômero e seu papel na sinalização hipertrófica sob estímulo mecânico, o objetivo geral desse trabalho foi explorar a capacidade das proteínas FAK e CS1 para incorporar geneticamente sondas moleculares que permitissem monitorar por meio de imagens o comportamento dessas moléculas-chave na biologia do disco Z em MVRNs submetida ao estiramento mecânico. Para isso, foram realizados ensaios de localização subcelular com uso de sondas moleculares aplicadas à microscopia correlativa, bem como ensaios bioquímicos, moleculares e de atividade enzimática. Os dados confirmaram a FAK associada às fibras de actina e adesões focais em células H9c2 e foi demonstrado à microscopia de luz que FAK wild-type (wt) translocou-se parcialmente para o compartimento nuclear após estimulação do agonista fenilefrina, enquanto que FAK Y397F (forma mutante inativa) não apresentou mesmo fenótipo. Por outro lado, apesar da padronização e expressão das construções com FAK e miniSOG ou Apex2 em células HEK 293T e H9c2, não foi conclusiva a localização subcelular da FAK, por meio do uso de microscopia eletrônica em MVRN. Provavelmente devido à distribuição difusa da maior parte das moléculas de FAK, não foi identificada uma região elétron-densa conclusiva à microscopia eletrônica de transmissão. No tocante à importância da CS1, observou-se que o estiramento cíclico não induziu o aumento na expressão proteica ou gênica relativa de CS1 e CnA, assim como não houve alteração na atividade fosfatase de CnA. No entanto houve redução da interação de CS1 e CnA, bem como alteração na localização de CS1 em MVRN sob estímulo mecânico. Dados de superexpressão e silenciamento de CS1 corroboram a regulação negativa de CS1 à CnA em MVRN sob estímulo mecânico. Baseando-se em dados estruturais, especulou-se que como o sítio de ligação de NFAT e CS1 à CnA são muito próximos e ao mesmo tempo distante do sítio ativo da fosfatase, é possível que o papel de CS1 na regulação negativa de CnA ocorra por impedimento espacial ao fator de transcrição NFAT. Portanto, esses resultados podem contribuir para uma possível inferência farmacológica, visto que a via de Calcineurina-NFAT é uma das principais mediadoras de hipertrofia em cardiomiócitos, mediante estímulos patológicos / Abstract: There is an increasing move towards the development of technologies that allow the localization of proteins in cells by combined electron and light microscopy, with the use of molecular probes such as miniSOG and APEX2. Additionally we seek to understand how proteins are responsible for the cellular and tissue functions. The Focal Adhesion Kinase (FAK) is protein of integrin signaling cascade considered as a potential mediator of mechanical stress in cardiomyocytes. It is known that in cardiomyocytes subjected to hypertrophic stimuli by rapid activation of FAK and its subcellular redistribution, however the mechanisms involved in these processes are poorly understood. Another very important protein in the heart is Calsarcin-1 (CS1), a negative regulator of the Calcineurin pathway which is crucial in the development of cardiac hypertrophy. However the mechanisms involved in the negative regulation as well as the subcellular distribution CS1 are poorly understood. Aiming at the interaction between these areas to study the spatial-temporal distribution of cellular and protein components, and the importance of FAK and CS1 in the sarcomere and its role in hypertrophic signaling under mechanical stimulation, the aim of this study was to explore the ability of FAK and CS1 to incorporate genetically molecular probes that allow monitoring through images the behavior of these key molecules in the Z disc biology in MVRNs subjected to mechanical stretch. To this end, we performed subcellular localization assays using molecular probes applied to the correlative microscopy, biochemical and molecular assays and enzymatic activity. These data confirm the FAK associated with actin and focal adhesions fibers in H9c2 cells and has been shown by light microscopy that FAK wild-type (wt) is partially translocated to the nuclear compartment after stimulation of the agonist phenylephrine, while FAK Y397F (inactive mutant form) did not show the same phenotype. Moreover, despite standardization and expression of FAK and miniSOG or APEX2 in HEK 293T cells and H9c2, it was inconclusive subcellular localization of FAK, through the use of electron microscopy, in MVRN. Probably due to the diffuse distribution of most FAK molecules, it has no conclusive electron-dense region in transmission electron microscopy. Regarding the importance of CS1, it was observed that the cyclic stretch did not induce an increase in protein expression or gene relative CS1 and CnA, as there was no change in the phosphatase activity of CnA. However there was less interaction CS1 and CnA and change in CS1 location in MVRN under mechanical stimulation. CS1 overexpression and silencing corroborate the negative regulation of the CS1 over CnA in MVRN under mechanical stimulation. Based on structural data, it has been speculated that as the NFAT and CS1 binding sites are very close in CnA and at the same time distant from the active site of the phosphatase, it is possible that the role of CS1 in the negative regulation of CnA occur by steric hindrance to the NFAT transcription factor. Therefore, these results may contribute to a possible pharmacological inference, whereas Calcineurin-NFAT pathway is a major mediator of hypertrophy in cardiac myocytes by pathologic stimuli / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

A cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) tem origem genética e é caracterizada pela substituição de células miocárdicas por tecido fibroadiposo. A doença tem uma prevalência aproximada de 1:3500, sendo mais frequentemente diagnosticada em indivíduos jovens, atletas e do sexo masculino. Atualmente, várias alterações genéticas associadas a CAVD foram descritas em 12 genes diferentes. No entanto, existem poucos estudos na literatura que descrevem o espectro mutacional da doença usando um painel abrangente de genes potencialmente causais, em populações diferentes das coortes descendentes de europeus. O sequenciamento de nova geração (NGS) como ferramenta para o diagnóstico molecular da doença, permite um avanço na correlação entre alterações genotípicas e fenotípicas e tem aportado potenciais benefícios que crescem juntamente com os desafios na sua interpretação. Além disso, o uso de hiPSCs como modelo in vitro de determinadas doenças cardíacas, permite avaliar especificamente a relação do genótipo com as diferentes consequências fenotípicas celulares da CAVD. Entretanto, os mecanismos moleculares da doença ainda são pouco esclarecidos e não há na literatura estudos que englobem ao mesmo tempo o perfil mutacional (com um painel extenso de genes) e estudo funcional das alterações encontradas com o uso de hiPSC-CMs. Esta tese teve como objetivo descrever a prevalência de variantes causais em genes associados à CAVD na população brasileira, e caracterizar, do ponto de vista funcional, os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) de pacientes com mutações identificadas, a fim de associar o perfil mutacional e a expressão fenotípica celular. Quarenta e sete indivíduos, não aparentados, sendo 38 (80,85%) pacientes do sexo masculino, idade média 40,2 ± 15,56 anos, com diagnóstico clínico de CAVD, foram submetidos ao sequenciamento de um painel genético relacionado à cardiomiopatias hereditárias, compreendendo os 12 genes previamente descritos como causadores de CAVD, utilizando sequenciamento de nova geração (NGS). As variantes foram interpretadas e classificadas de acordo com os critérios da ACMG. Variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas foram encontradas em dezoito probandos (38,3%), com maior número de ocorrências no gene PKP2 (38,8%). Entre os 18 casos positivos, treze variantes diferentes foram encontradas, quatro delas novas variantes em genes desmossomais, sem descrição prévia na literatura. Variantes de significado incerto (VSI) foram encontradas em 16 pacientes. A presença de uma variante causal ocorreu em todos os probandos assintomáticos e foi significativamente associada a probandos com histórico familiar de morte súbita cardíaca abaixo de 35 anos. Para a modelagem celular da CAVD, foram geradas hiPSCs de dois pacientes a partir de células progenitoras de urina (UPCs) e fibroblastos, por transfecção episomal. O primeiro paciente possuía alteração missense no gene PKP2 e o segundo, uma inserção no gene DSC2. As hiPSCs foram caracterizadas quanto ao seu potencial de pluripotência e posteriormente diferenciadas em cardiomiócitos (hiPSC-CMs). Nossos resultados demonstraram diferenças fenotípicas significativas entre os CAVD-CMs comparados com os controle-CMs, como: reduções significativas de expressão das proteínas desmossomais e desmossomos estruturalmente alterados; presença de marcadores do acúmulo de gotículas lipídicas e regulação aumentada do fator de transcrição proadipogênico PPAR-gama; aumento de duração do potencial de campo (FPD) e do potencial de ação em 90% de repolarização (APD90); velocidade de condução mais lenta e uma força de contração menor. Em conclusão, este é o primeiro trabalho a caracterizar o perfil genético da CAVD, abrangendo todos os genes descritos até o momento relacionados à doença, na população brasileira. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que, pacientes com história familiar de MSC ( < 35 anos) têm maior probabilidade de portar uma variante causal. Além disso, nossos achados sugerem que pacientes com alteração causal no gene PKP2 têm uma maior gravidade da apresentação fenotípica de arritmia. Nosso modelo celular, que contemplou células paciente-específicas com diferentes alterações das estudadas até o presente momento,sugere ser possível o estudo do efeito das alterações genéticas na CAVD e pode ser um acréscimo às ferramentas disponíveis para estudar o mecanismo desta doença complexa / Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) has a genetic origin and is mainly characterized by the replacement of myocardial cells with fibroadipose tissue. The disease has a prevalence of approximately 1: 3.500, being more frequently diagnosed in young individuals, athletes and males. Currently, several mutations associated with ARVC have been described in 12 different genes. However, there are few studies in the literature that describe the mutational spectrum of the disease using a comprehensive panel of potentially causal genes in populations other than European-descent cohorts. Next Generation Sequencing (NGS) as a tool for molecular diagnosis of the disease allows an advance in the correlation between genotypic and clinical phenotypic aspects and has potential benefits that grow along with the challenges in its interpretation. In addition, the use of hiPSCs as an in vitro model of certain heart diseases, allows to specifically evaluate the relationship of the genotype with the different cellular phenotypic consequences of ARVC. However, the molecular mechanisms of the disease are still poorly understood and there are no studies in the literature that include both the mutational profile (with an extensive panel of genes) and functional study of different causal variants, with the use of hiPSC-CMs. The aim of this thesis was to describe the prevalence of causal variants in ARVC-associated genes in the Brazilian population, and to characterize, from a functional point of view, cardiomyocytes derived from hiPSC (hiPSC-CMs) from patients with identified mutations, in order to associate the mutational profile and cellular phenotypic expression. Forty-seven unrelated probands, 38 (80.85%) male, mean age 40.2 ± 15.56 years, with clinical diagnosis of ARVC, were submitted to a cardiomyopathy-related gene panel sequencing, comprising 12 genes, using next-generation sequencing (NGS). Variants were interpreted and classified according to the ACMG criteria. Pathogenic or Likely Pathogenic variants were found in eighteen probands (38.3%), with the largest number of occurrences in the PKP2 gene (38.8%). Among the 18 positive cases, thirteen different variants were found, four of them novel mutations in desmosomal genes, without previous description in the literature. Variants of uncertain significance (VUS) were found in 16 patients. The presence of a causal variant was present in all asymptomatic probands and was significantly associated with probands who have a family history of sudden cardiac death under 35 years. For the cellular modeling, from urinary progenitor cells (UPCs) and fibroblasts, hiPSCs from two patients were generated by episomal transfection. The first patient had a missense variant in the PKP2 gene, while the second had an insertion in the DSC2 gene. The hiPSCs were characterized for its pluripotency potential and subsequently differentiated into cardiomyocytes (hiPSC-CMs). Our results demonstrated significant phenotypic differences between the ARVC-CMs compared to the control-CMs, such as: significant reductions in the expression of desmosomal proteins and structurally altered desmosomes; presence of lipid droplet accumulation markers and increased regulation of the proadipogenic transcription factor PPAR-gamma; prolonged field potential duration (FPD) and action potential in 90% repolarization (APD90); slower conduction velocity and a lower active contraction force. In conclusion, this is the first work to characterize the genetic profile of ARVC, covering all genes described to date related to the disease, in the Brazilian population. The data obtained in this study suggests that patients with a family history of sudden cardiac death ( < 35 years) are more likely to carry a causal variant. In addition, our findings suggest that patients with causal variant in the PKP2 gene have a greater severity of the phenotypic presentation of arrhythmia. Our cellular model, which contemplated patient-specific cells with different causal variants of the previous studies, suggests that it is possible to study the effect of the genetic changes in ARVC, and may be an addition to the tools available to study the mechanism of this complex disease