Mutações no gene Hfe causam a forma mais comum da hemocromatose hereditária, doença caracterizada por acúmulo progressivo de ferro nos tecidos parenquimatosos. Um estudo prévio conduzido em nosso laboratório (Am J Cardiol 88(4):388-91, 2001) encontrou associação entre mutação do gene Hfe e cardiomiopatia isquêmica, sugerindo que o acúmulo de ferro no tecido cardíaco pode ser um fator que potencializa as agressões ao sistema cardiovascular. O objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que o ferro aumenta a susceptibilidade ao risco cardiovascular. A análise de dados de 318 pacientes seguidos durante 10 anos indicou que variantes genéticas do Hfe estão associadas com maior mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca de diferentes etiologias. Em seguida, verificou-se o acúmulo de ferro no coração, aorta e fígado ao longo de 1, 3, 6 e 12 meses em camundongos FVB. Para mimetizar os efeitos deletérios do ferro no ser humano, validamos proteínas envolvidas no metabolismo do ferro em camundongos e tratamos os animais com 10 mg diárias de ferro dextrano durante 4 semanas. Os resultados sem a sobrecarga de ferro já apontaram acúmulo de ferro significativo no coração e no fígado ao longo de 12 meses de vida, consistente com a ideia de aumento progressivo de risco cardiovascular associado ao envelhecimento. A sobrecarga de ferro foi associada com maior mortalidade e deterioração da função cardíaca. Os camundongos tratados com ferro apresentaram diminuição da fração de ejeção, redução da espessura do septo, maior remodelamento cardíaco e aumento do volume nuclear dos cardiomiócitos. Para entender as modulações gênicas causadas pelo ferro no coração, foi medida a expressão dos transcritos primários de mRNA relativo para os genes Hfe e para a hepcidina, encontrando-se ambos os genes significativamente menos expressos nos animais tratados com ferro em comparação ao grupo que só recebeu salina. Por fim, com o intuito de estudar em condições mais controladas o comportamento cardíaco frente à sobrecarga de ferro, foram comparados dois protocolos de extração primária de cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos para testes farmacológicos com ferro in vitro. O enriquecimento de cardiomiócitos in vitro se estabeleceu por dois métodos: separação por gradiente de percoll (Per) e por uma pré-seleção nomeada pre plating (PP). As células cardíacas foram mantidas por 8 dias em cultura e avaliações do metabolismo, produção de espécies reativas de oxigênio e contratilidade foram medidas. Ambos os métodos foram eficientes para a obtenção de células cardíacas, entretanto, as células extraídas por protocolo PP apresentaram metabolismo aumentado, com maior consumo de glicose e produção de lactato. Por diferentes parâmetros testados o protocolo PP apresentou maior estresse oxidativo, porém sem modular a quantidade de glutationas reduzidas e oxidadas. Notadamente, o protocolo PP apresentou maior atividade contrátil com aumento dos batimentos e maior influxo intracelular de cálcio. Células cardíacas extraídas pelo método PP foram tratadas com citrato de amônia férrico com doses de 50 ?g/mL e 100 ?g/mL e, após 24 horas, foi possível observar aumento significativo de apoptose. Desta forma, os modelos celulares em questão apresentam-se como importantes ferramentas para a identificação de mecanismos moleculares e celulares associados aos efeitos deletérios causados pelo ferro. Em conjunto, os resultados do presente trabalho apoiam a hipótese de que o acúmulo de ferro no tecido cardíaco aumenta a susceptibilidade cardiovascular. Trabalhos futuros permitirão melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no acúmulo de ferro no coração ao longo do envelhecimento em pacientes com insuficiência cardíaca / Mutations in Hfe gene lead to the most common form of hereditary hemochromatosis, an autosomal recessive disease associated with iron accumulation in parenchymal tissues. In a previous study conducted in our laboratory (Am J Cardiol 88(4):388-91, 2001), genetic variation in the Hfe gene was associated with ischemic cardiomyopathy, suggesting that higher cardiac concentrations of iron aggravates injuries on the cardiovascular system. The aim of the present study was to test the hypothesis that iron increases susceptibility to cardiovascular risk. Analysis of data from 318 patients with 10-year follow-up showed that genetic variation in the Hfe gene was associated with higher mortality among patients with heart failure due to cardiomyopathy of different etiologies. Next, we demonstrated iron accumulation in heart, aorta, and liver in mice (FVB background) aged 1, 3, 6, and 12 months. To mimic the deleterious effect of iron observed in humans, we validated proteins playing a major role in iron metabolism and treated mice with 10 mg of iron-dextran daily for 4 weeks. Results showed that even without iron overload there is significant iron accumulation in the heart and liver with time, at 12 months of age, consistent with the idea that there is a progressive age-related increase in cardiovascular risk. Iron overload was associated with higher mortality in mice and impairment of cardiac function; in response to iron treatment ejection fraction and septum thickness were reduced, while cardiac remodeling and myocyte nuclear volume were increased. To understand the underlying mechanisms associated with iron-mediated modulation of genes in the heart, we assessed Hfe and hepcidin mRNA expression and found that these genes were significantly less expressed in iron-treated animals compared with the saline solution group. Lastly, to study cardiac behavior in the face of iron overload under well-controlled conditions we compared two protocols for primary extraction of neonatal rat cardiomyocytes for in vitro pharmacological tests: Percoll (Per) and pre plating (PP) extraction methods. Cardiac cells were used after 8 days and we measured metabolism, ROS production, and contractility. Both methods were effective in obtaining a high yield of cardiomyocytes. Nevertheless, cells extracted using PP protocol presented higher metabolic rate, as suggested by increased lactate production and glycolysis rate. In the PP protocol there was an increased oxidative stress, notwithstanding without modulating the amount of oxidized and reduced glutathione peroxidase. Notably, we found an increased contractile activity for pre-platting-prepared cells, with increased beating rate and higher calcium influx. Cardiac cells extracted by PP exposed to ferric ammonium citrate with doses of 50?g/mL and 100?g/mL, after 24 hours, displayed significant increased apoptosis. The cell models examined can be considered important tools for the identification of cell and molecular mechanisms associated with the harmful effects caused by iron. Taken together, the results of the present study support the hypothesis that cardiac tissue iron accumulation increases cardiovascular susceptibility. Further studies will help to unravel the mechanisms involved in cardiac iron accumulation throughout the aging process in patients with heart failure

Mutações no gene Hfe causam a forma mais comum da hemocromatose hereditária, doença caracterizada por acúmulo progressivo de ferro nos tecidos parenquimatosos. Um estudo prévio conduzido em nosso laboratório (Am J Cardiol 88(4):388-91, 2001) encontrou associação entre mutação do gene Hfe e cardiomiopatia isquêmica, sugerindo que o acúmulo de ferro no tecido cardíaco pode ser um fator que potencializa as agressões ao sistema cardiovascular. O objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que o ferro aumenta a susceptibilidade ao risco cardiovascular. A análise de dados de 318 pacientes seguidos durante 10 anos indicou que variantes genéticas do Hfe estão associadas com maior mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca de diferentes etiologias. Em seguida, verificou-se o acúmulo de ferro no coração, aorta e fígado ao longo de 1, 3, 6 e 12 meses em camundongos FVB. Para mimetizar os efeitos deletérios do ferro no ser humano, validamos proteínas envolvidas no metabolismo do ferro em camundongos e tratamos os animais com 10 mg diárias de ferro dextrano durante 4 semanas. Os resultados sem a sobrecarga de ferro já apontaram acúmulo de ferro significativo no coração e no fígado ao longo de 12 meses de vida, consistente com a ideia de aumento progressivo de risco cardiovascular associado ao envelhecimento. A sobrecarga de ferro foi associada com maior mortalidade e deterioração da função cardíaca. Os camundongos tratados com ferro apresentaram diminuição da fração de ejeção, redução da espessura do septo, maior remodelamento cardíaco e aumento do volume nuclear dos cardiomiócitos. Para entender as modulações gênicas causadas pelo ferro no coração, foi medida a expressão dos transcritos primários de mRNA relativo para os genes Hfe e para a hepcidina, encontrando-se ambos os genes significativamente menos expressos nos animais tratados com ferro em comparação ao grupo que só recebeu salina. Por fim, com o intuito de estudar em condições mais controladas o comportamento cardíaco frente à sobrecarga de ferro, foram comparados dois protocolos de extração primária de cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos para testes farmacológicos com ferro in vitro. O enriquecimento de cardiomiócitos in vitro se estabeleceu por dois métodos: separação por gradiente de percoll (Per) e por uma pré-seleção nomeada pre plating (PP). As células cardíacas foram mantidas por 8 dias em cultura e avaliações do metabolismo, produção de espécies reativas de oxigênio e contratilidade foram medidas. Ambos os métodos foram eficientes para a obtenção de células cardíacas, entretanto, as células extraídas por protocolo PP apresentaram metabolismo aumentado, com maior consumo de glicose e produção de lactato. Por diferentes parâmetros testados o protocolo PP apresentou maior estresse oxidativo, porém sem modular a quantidade de glutationas reduzidas e oxidadas. Notadamente, o protocolo PP apresentou maior atividade contrátil com aumento dos batimentos e maior influxo intracelular de cálcio. Células cardíacas extraídas pelo método PP foram tratadas com citrato de amônia férrico com doses de 50 ?g/mL e 100 ?g/mL e, após 24 horas, foi possível observar aumento significativo de apoptose. Desta forma, os modelos celulares em questão apresentam-se como importantes ferramentas para a identificação de mecanismos moleculares e celulares associados aos efeitos deletérios causados pelo ferro. Em conjunto, os resultados do presente trabalho apoiam a hipótese de que o acúmulo de ferro no tecido cardíaco aumenta a susceptibilidade cardiovascular. Trabalhos futuros permitirão melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no acúmulo de ferro no coração ao longo do envelhecimento em pacientes com insuficiência cardíaca / Mutations in Hfe gene lead to the most common form of hereditary hemochromatosis, an autosomal recessive disease associated with iron accumulation in parenchymal tissues. In a previous study conducted in our laboratory (Am J Cardiol 88(4):388-91, 2001), genetic variation in the Hfe gene was associated with ischemic cardiomyopathy, suggesting that higher cardiac concentrations of iron aggravates injuries on the cardiovascular system. The aim of the present study was to test the hypothesis that iron increases susceptibility to cardiovascular risk. Analysis of data from 318 patients with 10-year follow-up showed that genetic variation in the Hfe gene was associated with higher mortality among patients with heart failure due to cardiomyopathy of different etiologies. Next, we demonstrated iron accumulation in heart, aorta, and liver in mice (FVB background) aged 1, 3, 6, and 12 months. To mimic the deleterious effect of iron observed in humans, we validated proteins playing a major role in iron metabolism and treated mice with 10 mg of iron-dextran daily for 4 weeks. Results showed that even without iron overload there is significant iron accumulation in the heart and liver with time, at 12 months of age, consistent with the idea that there is a progressive age-related increase in cardiovascular risk. Iron overload was associated with higher mortality in mice and impairment of cardiac function; in response to iron treatment ejection fraction and septum thickness were reduced, while cardiac remodeling and myocyte nuclear volume were increased. To understand the underlying mechanisms associated with iron-mediated modulation of genes in the heart, we assessed Hfe and hepcidin mRNA expression and found that these genes were significantly less expressed in iron-treated animals compared with the saline solution group. Lastly, to study cardiac behavior in the face of iron overload under well-controlled conditions we compared two protocols for primary extraction of neonatal rat cardiomyocytes for in vitro pharmacological tests: Percoll (Per) and pre plating (PP) extraction methods. Cardiac cells were used after 8 days and we measured metabolism, ROS production, and contractility. Both methods were effective in obtaining a high yield of cardiomyocytes. Nevertheless, cells extracted using PP protocol presented higher metabolic rate, as suggested by increased lactate production and glycolysis rate. In the PP protocol there was an increased oxidative stress, notwithstanding without modulating the amount of oxidized and reduced glutathione peroxidase. Notably, we found an increased contractile activity for pre-platting-prepared cells, with increased beating rate and higher calcium influx. Cardiac cells extracted by PP exposed to ferric ammonium citrate with doses of 50?g/mL and 100?g/mL, after 24 hours, displayed significant increased apoptosis. The cell models examined can be considered important tools for the identification of cell and molecular mechanisms associated with the harmful effects caused by iron. Taken together, the results of the present study support the hypothesis that cardiac tissue iron accumulation increases cardiovascular susceptibility. Further studies will help to unravel the mechanisms involved in cardiac iron accumulation throughout the aging process in patients with heart failure

Orientadores: Jose Wilson Magalhaes Bassani, Rosana Almada Bassani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-15T01:38:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_AlexandraValenzuelaSantelicesda_M.pdf: 1311974 bytes, checksum: ab061a6f8d63a1175d6a3c9281e0704e (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O procedimento mais efetivo para reverter arritmias cardíacas consiste na aplicação de choques elétricos de alta intensidade, como e o caso da desfibrilação. Estimulação com campos elétricos (E) elevados, entretanto, exerce efeitos deletérios sobre o músculo cardíaco, podendo causar disfunções elétrica e contrátil e até a morte celular. Privilegiar a estimulação na direção longitudinal, para qual o limiar de excitação das células cardíacas e menor, seria uma forma de se reduzir a amplitude do estimulo sem perder a efetividade da estimulação. Para isto, foi desenvolvido e testado, em miócitos ventriculares orientados de maneira aleatória, um sistema de estimulação multidirecional automática que permite o chaveamento controlado de estímulos sequênciais para três diferentes pares de eletrodos (cada um correspondendo a uma direção) em um intervalo de tempo inferior a duração do potencial de ação (período em que a célula se encontra eletricamente refrataria). A estimulação multidirecional com uma intensidade de E 20% acima do limiar estimulatório (1,2× ETM) dobrou o recrutamento (excitação) de células (80 vs. 40% com estimulação unidirecional, p<0,001). Adicionalmente, o recrutamento com a estimulação multidirecional automática foi maior (p< 0,001) do que a soma dos recrutamentos obtidos com a estimulação em cada direção individualmente (sem intersecção), o que sugere que a estimulação sublimiar durante o procedimento automático pode aumentar a excitabilidade celular. Foi observado também que, para uma dada amplitude do estimulo, o uso da forma de onda bipolar (para a qual o valor de ETM foi menor que para pulsos monopolares: 3,2 ± 0,1 vs. 3,9 ± 0,1 V/cm; p< 0,001) promoveu um recrutamento maior do que com o pulso monopolar (recrutamento de 50% das células foi obtido com 2,97 ± 0,04 e 4,18 ± 0,05 V/cm para pulsos bipolares e monopolares, respectivamente; p< 0,05). A combinação da estimulação multidirecional automática com o uso da forma de onda bipolar permitiu, portanto, uma redução de cerca de 50% no valor do E absoluto (3,8 vs. 7,8 V/cm com estimulação unidirecional e pulso monopolar) para um recrutamento de ~80% das células. A aplicação destes procedimentos na estimulação cardíaca (marcapasso e desfibrilação) pode otimizar o processo, levando a uma melhor eficiência e uma menor incidência de lesão. / Abstract: The most effective procedure to revert cardiac arrhythmias consists in the application of high intensity electric discharge, such as in cardiac defibrillation. Nevertheless, stimulation using high electric fields (E) may cause injury to the cardiac muscle, generating electric and contractile dysfunctions and even cell death. A possible way to reduce the stimulus intensity while maintaining the stimulation effectiveness would be stimulate cardiac cells with E applied parallel to the cell major axis, in which case the stimulation threshold is lower. To test this possibility, a multidirectional stimulation system was developed and tested on randomly-oriented rat ventricular myocytes. The system allows the controlled switching of sequential stimuli delivered to three different pairs of electrodes (each one corresponding to one direction), in a period shorter than the action potential duration (when cell is electrically refractory). The multidirectional stimulation with E intensity 20% above the stimulation threshold (1.2× ETM) doubled the percentage of recruited (excited) cells (~80 vs. ~40 % with unidirectional stimulation, p<0.001). Additionally, recruitment with automatic multidirectional stimulation was greater (p< 0.001) than the sum of recruitments obtained from stimulation of each direction individually (without intersection), which is suggestive that subthreshold stimulation during the automatic procedure might enhance cell excitability. Moreover, it was observed that for a given absolute stimulus amplitude, the use of biphasic waveforms (for which ETM was lower than for monophasic pulses: 3.2 ± 0.1 vs. 3.9 ± 0.1 V/cm; p< 0.001) promoted higher recruitment than monophasic stimuli (50% recruitment was attained with 2.97 ± 0.04 and 4.18 ± 0.05 V/cm with biphasic and monophasic pulses, respectively; p< 0.05). Thus, the association of automatic multidirectional stimulation and biphasic waveform enabled a 50% reduction of the absolute E value (3.8 vs. 7.8 V/cm with unidirectional stimulation and monopolar pulse) to evoke excitation in ~80% of the cells. The application of these procedures to cardiac stimulation (pacemaker and defibrillation) might optimize the process, leading to greater efficiency and lower injury incidence. / Mestrado / Engenharia Biomedica / Mestre em Engenharia Elétrica

O aumento da pressão arterial não é a única consequência da sobrecarga de sal na dieta. Independente dos efeitos hemodinâmicos, o excesso de sal pode induzir alterações estruturais no miocárdio. A avaliação dos mecanismos destas alterações foi o objetivo do presente estudo. Para tanto, ratos Wistar machos foram alimentados com dieta: normossódica (NR: 1,3% de NaCl), hipersódica 1 (HR1: 4%) e hipersódica 2 (HR2: 8%) desde o desmame até a 18a semana de idade. O grupo HR2 foi dividido em HR2, HR2+Hidralazina (HZ: 15mg/ kg/ dia) e HR2+Losartan (LOS: 20mg/ kg/ dia). As drogas foram administradas a partir da 7a semana de idade. Foram avaliados pressão arterial caudal (PAc), atividade de renina plasmática (ARP), aldosterona sérica, ecocardiograma, massa ventricular esquerda (MVE) e direita (MVD), medida do diâmetro transverso do miócito (DTM), fibrose intersticial (FI), expressão protéica do receptor de angiotensina II do tipo I (AT1) e tipo 2 (AT2), dosagem de angiotensina II (AII) e ligação do anticorpo que reconhece a conformação ativada dos receptores AT1 e AT2 no ventrículo esquerdo (VE) e direito (VD). A PAc foi maior no grupo HR1 e HR2 comparado com o grupo NR. A PAc do grupo HR2+HZ e HR2+LOS não diferiu do grupo NR. ARP e ALDO foram menores nos grupos HR1, HR2, HR2+HZ e HR2+LOS. A espessura do septo interventricular na diástole e da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole foram maiores nos grupos HR1, HR2, HR2+HZ e HR2+LOS comparado com o grupo NR. A MVE e MVD foram maiores nos grupos HR2, HR2+HZ e HR2+LOS comparado com o grupo NR. O DTM do VE foi maior nos grupos HR1, HR2, HR2+HZ comparado com o grupo NR e HR2+LOS. DTM do VD foi maior no grupo HR2 e HR2+HZ comparado com o grupo NR, HR1 e HR2+LOS. A FI no VE e VD foi maior nos grupos HR1, HR2 e HR2+LOS comparado com o grupo NR e HR2+HZ. A expressão da proteína do receptor AT1 no VE e VD foi maior nos animais do grupo HR2 e HR2+HZ quando comparado com o grupo NR, HR1 e HR2+LOS. A expressão da proteina do receptor AT2 não foi alterada pelo alto consumo de sal, mas foi menor no grupo HR2+LOS. A ligação do anticorpo que reconhece a conformação ativada do receptor AT1 no VE e VD foi menor nos grupos HR1, HR2, HR2+HZ e HR2+LOS comparado com o grupo NR. A ligação do anticorpo que reconhece a conformação ativada do receptor AT2 não foi alterada no VE e VD dos grupos HR1, HR2 e HR2+LOS. No entanto, a ligação do anticorpo no receptor AT2 foi menor no VE e VD no grupo HR2+LOS. O conteúdo de AII foi maior em ambos os ventrículos nos grupos HR1, HR2, HR2+HZ e HR2+LOS. O elevado consumo de sal induz hipertrofia e fibrose miocárdica independente do efeito sobre a pressão arterial. A hipertrofia do cardiomiócito e a FI induzida pelo sal ocorre por mecanismos diferentes. Algumas evidências deste estudo sugerem a internalização do receptor AT1 induzido pelo sal provavelmente devido à ligação da AII. / Increased blood pressure is not the only consequence of salt overload. Independently from the hemodynamic effect, salt excess may induce structural alterations in the myocardium. The aim of the present study was to evaluate the mechanisms of the myocardium structural alteration in response to high salt intake. Male Wistar rats were fed normal (NR: 1.3% NaCl), high 1 (HR1 4%) or high 2 (HR2 8%) salt diet since weaning until 18th week of age. HR2 group was divided in HR2, HR2+hydralazine (HZ: 15mg/ kg/ dia) and HR2+losartan (LOS: 20mg/ kg/ dia). Drugs were administered since the 7th week of age. Tail-cuff blood pressure (Tc-BP), plasma renin activity (PRA), serum aldosterone (ALDO), echocardiography, left (LV) and right (RV) ventricular mass, cardiomyocyte transverse diameter (CTD), interstitial fibrosis (IF), protein expression of AT1 and AT2 receptors, angiotensin II content (AII), binding of the conformational specific anti-AT1 and anti-AT2 antibody in both ventricles were determined in the LV and RV. Tc-BP was higher in the HR1 and HR2 groups when compared to NR. Tc-BP on HR2+HZ and HR2+LOS did not differ from NR. PRA and ALDO were lower in the HR1, HR2, HR2+HZ and HR2+LOS when compared to NR. Interventricular septal and left ventricular posterior wall thicknesses were higher on HR1, HR2, HR2+HZ and HR2+LOS compared to NR. LV and RV mass was higher in the HR2, HR2+HZ and HR2+LOS when compared to NR. CTD in the LV was higher on HR1, HR2 and HR2+HZ groups than on NR and HR2+LOS groups. CTD in the RV was higher in the HR2 and HR2+HZ when compared to NR, HR1 and HR2+LOS groups. IF was higher in the LV and RV in HR1, HR2 and HR2+LOS groups than in NR and HR2+HZ groups. AT1 protein expression was higher in the HR2 and HR2+HZ compared to NR, HR1 and HR2+LOS groups. High salt intake did not increase AT2 protein expression in the HR1, HR2 and HR2+HZ groups. However, losartan induced a decrease in AT2 protein expression. In response to high salt intake, the binding of an AT1 conformational specific antibody was lower in both ventricles. Binding of the conformational specific anti-AT2 antibody in both ventricles did not change in response to HR1 and HR2. However, binding of the conformational specific anti-AT2 antibody was lower in both ventricles in the HR2+LOS group. AII was higher in both ventricles in the HR1, HR2, HR2+HZ and HR2+LOS groups. Myocardial structural alterations in response to high salt intake are independent of the effect on blood pressure. Salt induced cardiomyocyte hypertrophy and interstitial fibrosis are due to different mechanisms. Some evidences from the present study are in favor of salt induced AT1 receptor internalization probably due to AII binding.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T03:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AnaHelenaMacedo_D.pdf: 4791935 bytes, checksum: 1afe275f0fa4f53003b18816bc5c27cb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os fatores MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) pertencem à família MADS Box (MCM1-Agamous-Deficiens-Serum response factor) e foram descritos pela primeira vez como fatores de transcrição que se ligam a sequencias de DNA ricas em A/T nos promotores de vários genes músculo específicos. Existem 4 genes da família MEF2 que foram identificados em vertebrados: MEF2A, B, C e D que são expressos de forma distinta durante a embriogênese e nos tecidos adultos. Estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que o fator de transcrição MEF2 é ativado por estiramento mecânico e influencia a expressão de genes relacionados à hipertrofia cardíaca. Utilizando a tecnologia de siRNA para MEF2C (siRNAMEF2C) demonstramos a atenuação da hipertrofia cardíaca induzida por coarctação da aorta nos animais que receberam o siRNAMEF2C. Por outro lado trabalhos demonstraram que animais transgênicos com a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C e submetidos à sobrecarga de pressão por coarctação da aorta, não apresentam hipertrofia cardíaca compensatória. Nesses animais a superexpressão de MEF2A ou de MEF2C no coração está associada à deterioração cardíaca funcional e estrutural e o desenvolvimento de cardiomiopatia dilatada. Contudo, a caracterização fenotípica e os mecanismos moleculares envolvidos na superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos ainda são desconhecidos. Da mesma forma não é conhecido o papel do fator de transcrição MEF2C na resposta hipertrófica do miócito cardíaco após coarctação da aorta. No presente trabalho foi demonstrado que a superexpressão de MEF2C em miócitos cardíacos de ratos neonatos (NRMV), com o uso de partículas adenovirais, induziu a desdiferenciação celular e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, proteoma, PCR em tempo real e western blotting. A análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão demonstra que NRMV possuem aumento na binucleação e desorganização sarcomérica, alterações coerentes com o quadro de desdiferenciação celular e ativação da progressão do ciclo celular. Por meio da técnica de incorporação de iodeto de propídeo e citometria de fluxo confirmamos o aumento de células em ciclo celular. Para confirmar os achados nos cardiomiócitos neonatos passamos a investigar o efeito da superexpressão de MEF2C em cardiomiócitos de ratos adultos. Para isso padronizamos a técnica de isolamento destas células e tratamos com AdMEF2C. Sendo assim o tratamento com AdMEF2C em miócitos cardíacos de ratos adultos resultou em aumento da expressão de MEF2C após 48 horas de tratamento. O efeito observado foi semelhante ao encontrado em cardiomiócitos neonatos, sendo que os adultos apresentaram aumento da expressão de genes relacionados ao ciclo celular e diminuição dos genes estruturais. O nível ultraestrutural observado por microscopia eletrônica de transmissão no tempo de 48 horas de tratamento não observamos diferenças na estrutura sarcomérica das células tratadas com AdMEF2C. Por fim demonstramos que o silenciamento de MEF2C pela injeção de lentivírus no coração demonstrou ser capaz de impedir o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca em camundongos coarctados por 15 dias. A hipertrofia do coração foi avaliada por meio da espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo e gravimetria do ventrículo esquerdo e dos pulmões. O conjunto de dados demonstra que a superexpressão de MEF2C leva a alterações estruturais no miócito cardíaco compatíveis com quadro de deterioração e insuficiência cardíaca e que o silenciamento de MEF2C no coração impede o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca decorrente da coarctação da aorta / Abstract: The factors MEF2 (myocyte enhancer factor 2) belong to the family MADS box (MCM1-Agamous-deficiens-Serum response factor) and were first described as transcription factors that bind DNA sequences rich in A / T in the promoters of multiple muscle-specific genes. There are four MEF2 family genes that were identified in vertebrates MEF2A, B, C and D are expressed differently during embryogenesis and in adult tissues. Previous studies from our laboratory demonstrated that the transcription factor MEF2 is activated by mechanical stretch and influences the expression of genes related to cardiac hypertrophy. Using siRNA technology to MEF2C (siRNAMEF2C) demonstrated attenuation of cardiac hypertrophy induced by aortic coarctation in animals that received siRNAMEF2C. On the other hand studies have demonstrated that transgenic mice with overexpression of MEF2A or MEF2C and subjected to pressure overload by aortic coarctation show no compensatory cardiac hypertrophy. In these animals the overexpression of MEF2A or MEF2C in the heart is associated with structural and functional cardiac deterioration and development of dilated cardiomyopathy. However, the phenotypic and molecular mechanisms involved in the overexpression of MEF2C in cardiac myocytes are still unknown. Likewise, there is known the role of the transcription factor MEF2C in cardiac myocyte hypertrophic response after aortic coarctation. In the present study it was shown that overexpression of MEF2C in neonatal rat cardiac myocytes (NRMV) with the use of adenoviral particles, and cellular dedifferentiation induced activation mechanisms involved in cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, proteomics, real time PCR and western blotting. The analysis of cell phenotype by light microscopy, confocal and transmission electron shows that NRMV have increased binucleation and sarcomeric disorganization, changes consistent with the framework of cellular dedifferentiation and activation of cell cycle progression. By means of the propidium iodide incorporation technique and flow cytometry, confirmed increasing cells in the cell cycle. To confirm the findings in neonatal cardiomyocytes we investigate the effect of overexpression of MEF2C in cardiomyocytes of adult rats. For this standardized technique and isolation of these cells treated with AdMEF2C. Thus treatment with AdMEF2C in adult rat cardiac myocytes resulted in increased expression of MEF2C after 48 hours of treatment. The observed effect was similar to that found in cardiomyocytes neonates, adults who showed increased expression of genes related to cell cycle and decreased structural genes. The ultrastructural level observed by transmission electron microscopy in the time of 48 hours of treatment showed no difference in sarcomeric structure of cells treated with AdMEF2C. Finally we show that MEF2C silencing by lentivirus injection in the heart has been shown to prevent the development of cardiac hypertrophy in mice after 15 days of pressure overload. The heart hypertrophy was evaluated by the thickness of the posterior wall of the left ventricle and the left ventricle gravity and lungs. The data set shows that overexpression of MEF2C leads to structural changes in the cardiac myocyte compatible framework of deterioration and failure, and MEF2C silencing of the heart prevents the development of cardiac hypertrophy due to aortic coarctation / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Ciências

O estudo de mutações genéticas como causa das cardiomiopatias teve início com a descoberta de mutações em proteínas sarcoméricas que levavam à Cardiomiopatia Hipertrófica, desde então, alterações em diversos genes, de proteínas contráteis ou não, foram descobertas e listadas como a responsável pelo desenvolvimento de diferentes cardiomiopatias. Estudar o efeito destas mutações nos cardiomiócitos destes pacientes permanecia um desafio devido ao difícil acesso às células cardíacas. Em 2007, a técnica de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes foi descoberta. Pelo fato das células-tronco pluripotentes serem capazes de ser diferenciadas em cardiomiócitos, surgiu-se a possibilidade de se estudar essas células de indivíduos portadores das mutações genéticas. Esta tese teve como objetivo a criação de um modelo celular para estudar a Cardiomiopatia Hipertrófica causada por mutações genéticas. Inicialmente foi estabelecido um protocolo de reprogramação celular para se estabelecer linhagens celulares das células-tronco induzidas de um paciente com mutação no gene MYH7. Tendo as células caracterizadas, elas foram diferenciadas em cardiomiócitos através de um protocolo adaptado de protocolos de diferenciação direta em cardiomiócitos. Os cardiomiócitos gerados apresentaram características moleculares e funcionais semelhantes à cardiomiócitos primários humanos e foi visualizado, através de microscopia eletrônica de transmissão, que os cardiomiócitos do paciente com alteração genética possuíam grande proporção de sarcômeros desorganizados em comparação a cardiomiócitos de indivíduos saudáveis. Em conclusão, o modelo celular desenvolvido sugere ser possível o estudo do efeito de mutações genéticas em Cardiomiopatia Hipertrófica. / The study of genetic mutations as the cause of cardiomyopathies initiates with the discovery of mutations in sarcomeric proteins genes that lead to Hypertrophic Cardiomyopathy. Since then, mutations in several genes, coding to sarcomeric proteins or not, were discovered and listed as the reason to the cardiomyopathies. To study the effect of these mutations was a challenge due the difficulty to accesses cardiac cells. In 2007, the technique of reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells was discovered. The fact that the pluripotent stem cells are capable of differentiating into cardiomyocytes opened the opportunity to study these cells from individuals with genetic mutations. This thesis aimed to create a cellular model to study Hypertrophic Cardiomyopathy caused by genetic mutations. Initially we established a cell reprogramming protocol to establish induced stem cells lines from a patient with mutation in MYH7 gene. Having characterized the cells, they were differentiated into cardiomyocytes using an adapted protocol from direct differentiation protocols. Cardiomyocytes generated showed molecular and functional characteristics similar to human primary cardiomyocytes and were visualized by means of transmission electron microscopy. The patient\'s cardiomyocytes had a large proportion of disorganized sarcomeres compared to cardiomyocytes from healthy individuals. In conclusion, the cell model developed suggests that it is possible to study the effect of genetic mutation in Hypertrophic Cardiomyopathy using induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.

A substituição de cardiomiócitos na vida pós-natal tem sido um dos maiores desafios da medicina regenerativa. O conceito de que os cardiomiócitos proliferam ativamente durante o desenvolvimento, mas perdem completamente esse potencial logo após o nascimento, foi recentemente questionado quando as primeiras evidências mostraram a existência de mecanismos endógenos de regeneração cardíaca em camundongos com um dia de vida. Nós avaliamos esse fenômeno em ratos de um dia de vida (P1) e investigamos o impacto da regeneração inicial na perfusão tecidual em longo prazo e a função cardíaca global em resposta ao stress. A homogeneidade da cirurgia de ressecção apical foi comprovada através do exame de ressonância magnética (MRI) e demonstramos que os ratos P1 apresentaram evidências de neoformação de cardiomiócitos a partir da marcação de Troponina I e Conexina 43 na àrea da lesão 21 dias após a cirurgia de ressecção, enquanto os ratos de sete dias de idade (P7) apresentaram a substituição do tecido principalmente por deposição de colágeno. De maneira interessate, as células recém-formadas apresentaram uma aparente falta de alinhamento uniforme nos ratos P1, e a hipoperfusão do tecido cardíaco foi detectada para ambos os grupos de pós-ressecção 21 e aos 60 dias do exame de SPECT. A função cardíaca basal direta aos 60 dias apresentou-se preservada em todos os grupos, enquanto sob estresse hemodinâmico, o grau de mudança na LVDEP, Volume Sitólico e Trabalho Sistólico indicaram função cardíaca diminuída nos ratos P7. Além disso, a relação pressão-volume diastólica final e o aumento da deposição de colágeno intersticial no P7 são consistentes com o aumento da rigidez da câmara. Coletivamente, nós mostramos que o potencial regenerativo com ausência de remodelamento cardíaco adverso é restrito aos ratos P1. Em seguida, procurou-se avaliar os mecanismos moleculares que regulam esse fenômeno através da combinação de ferramentas exploratórias. Embora tenha sido descrito anteriormente que o sistema imunológico não é totalmente maduro ao nascimento, o sequenciamento do RNA total de corações de ratos sham-operados, P1 e P7 mostrou que o procedimento cirúrgico foi suficiente para ativar algumas vias ligadas à resposta inflamatória e considerando as subpopulações de macrófagos pró (M1) e anti-inflamatórios (M2), sugerimos que o perfil de macrófagos anti-inflamatórios (M2) infiltrados no coração de ratos P1 são diferentes das células adultas pró-fibróticas regulares. Os meios condicionados M1 e M2 elevaram a taxa de proliferação de cardiomiócitos em condições de normóxia, mas somente o M2 apresentou resposta proliferativa em hipóxia e preveniu a diferenciação-induzida de fibroblastos cardíacos por menor expressão ?SMA. Por membranas array de citocinas, 15 citocinas apresentaram-se comuns aos dois meios condicionados, mas apenas 4 citocinas, sendo elas IL-4, IL-1?, IL-6 e Fractalkine, foram exclusivas ao meio condicionado M2, e que poderiam ser possíveis candidatos aos efeitos regenerativos encontrados. Nesse sentido, experimentos futuros fazem-se necessários a fim de explorar os efeitos dessas citocinas e desenvolver novas estratégias terapêuticas / The replacement of cardiomyocytes in postnatal life has proven to be one of the biggest challenges in regenerative medicine. The concept that cardiomyocytes proliferate actively during development but cease completely right after birth has been recently questioned when first evidences showed the existence of endogenous mechanisms of cardiac regeneration in one-day-old mice. We sought to evaluate this phenomenon in one-day-old rats (P1) and to assess the impact of the early regenerative process on long-term tissue perfusion and overall cardiac function in response to stress. We confirmed the successful apical resection surgery through magnetic resonance imaging (MRI) and that P1 heart was associated with evidence of cardiomyocytes neoformation as indicated by Troponin I and Connexin 43 expression at 21 days postresection, while in seven-day-old rats (P7) mainly scar tissue replacement ensued. Interestingly, there was an apparent lack of uniform alignment of newly formed cells in P1, and cardiac tissue hypoperfusion has been detected for both groups at 21 postresection and at 60 days through SPECT scanning. Direct basal cardiac function at 60 days, was preserved in all groups, whereas under hemodynamic stress the degree of change on LVDEP, Stroke Volume and Stroke Work indicated diminished overall cardiac function in P7. Furthermore, the End-Diastolic Pressure-Volume relationship and increased interstitial collagen deposition in P7 is consistent with increased chamber stiffness. Collectively, we showed that regenerative potential with slight collagen deposition is restricted to P1 rats. Then we sought to evaluate the molecular mechanisms that regulate this phenomenon through explorative tools. Although it has been previously described that the immune system is not fully mature at birth, total RNA sequenced from sham-operated, P1 and P7 heart rats showed that surgery is sufficient to activate inflammatory pathways, and considering pro (M1) and anti-inflammatory (M2) macrophages subpopulations, we suggested that invaded macrophages in resected P1 hearts are different from the traditional pro-fibrotic M2-like adult cells. Conditioned M1 and M2 medium elevated cardiomyocytes proliferative rate under basal conditions, but only M2 produced the same effect in cardiomyocytes under hypoxia and prevented myofibroblasts-induced differentiation through ?SMA intensity expression. Membrane array for cytokines showed 15 common cytokines for both M1 and M2 conditioned medium, but only 4, as IL-4, IL-1?, IL-6 and Fractalkine, were M2 exclusive and possible candidates to the regenerative potential. Additional experiments are needed to further explore these cytokines and to maybe develop new therapeutic strategies

O sulforafano (SFN) é um composto natural que possui propriedades antioxidantes, estimulando, principalmente, o sistema antioxidante endógeno celular. Este composto está associado a uma via clássica de ativação, a via do fator eritroide nuclear tipo 2 (Nrf2). Entretanto, estudos mais recentes têm demonstrado que a ação do SFN também pode se dar pela via do coativador 1-alfa do receptor ativado por proliferador do peroxissoma (PGC-1α). A diferença da via de ativação pelo SFN parece ter relação com o tempo de exposição das células a este composto. Visto que o SFN é uma importante estratégia terapêutica no combate ao estresse oxidativo, que está relacionado ao desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares, a investigação do seu mecanismo de ação é necessária. A análise in vitro é uma ferramenta importante para a investigação das vias e tempos de incubação envolvidos na ação antioxidante do SFN. Sendo assim, a cultura primária de cardiomiócitos de ratos adultos é um dos modelos que pode ser utilizado, sendo a sua principal vantagem, o fato da fisiologia destas células se aproximar mais das condições fisiológicas in vivo. O objetivo deste estudo, então, foi analisar a estimulação de defesas antioxidantes feita pelo SFN, através das vias do Nrf2 e do PGC-1α, em tempos diferentes, utilizando a técnica de cultura de cardiomiócitos adultos. Ratos Wistar machos foram eutanasiados, para que seus corações fossem retirados e submetidos ao processo de isolamento de células cardíacas, em aparelho de Langendorff modificado. As células foram isoladas através da perfusão do coração com solução de Krebs e colagenase tipo II, por um período de 30 minutos. Após isso, as células isoladas foram plaqueadas e mantidas em incubadora a 37°C e 5% de CO2. Foi realizado o tratamento com 5 μM de SFN e/ou 5 μM de peróxido de hidrogênio (H2O2). As células foram divididas nos seguintes grupos experimentais: Controle, SFN, H2O2 e SFN+H2O2. Os grupos foram subdivididos em dois tempos de incubação: 1 e 24 horas. Foram realizadas as análises dos níveis totais de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de lipoperoxidação (LPO); atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa s-transferase (GST); expressão proteica das isoformas citosólica (SOD-1) e mitocondrial (SOD-2) da SOD, e dos fatores Nrf2 e PGC-1α. Os resultados do trabalho mostram que, em relação ao tempo de 1 hora, o SFN incubado por 24 horas aumentou em 59% a atividade da SOD, 55% a expressão proteica da SOD-1, 24% a expressão proteica da SOD-2 e 69% a expressão proteica do PGC-1α. A expressão do Nrf2 foi 17% maior no tempo de 1 hora, em relação a 24 horas. Em relação à atividade da catalase e aos níveis de ROS e de LPO, houve diferença somente nos grupos incubados por 1 hora, nos quais a atividade da CAT foi menor no grupo H2O2, os níveis de ROS estavam diminuídos no grupo SFN, e os níveis de LPO estavam maiores no grupo H2O2. Não foram encontradas diferenças em relação à atividade da GST. Como conclusão, o SFN demonstrou um papel protetor nos grupos 1 hora, impedindo a geração de ROS e de dano a lipídeos, apesar de não apresentar um efeito expressivo sobre as enzimas antioxidantes. O efeito dos tempos de incubação na expressão do Nrf2 (aumentada em 1 hora) e do PGC-1α (aumentada em 24 horas) mostrou que realmente há uma relação temporal entre a sinalização destas duas vias, ativadas pelo SFN. Este resultado é instigante para que futuras análises dessa relação temporal das vias do SFN sejam realizadas. / Sulforaphane (SFN) is a natural compound that has antioxidant properties, mainly stimulating the endogenous cellular antioxidant system. This compound is associated with a classical pathway of activation, the nuclear erythroid factor 2 (Nrf2) pathway. However, more recent studies have shown that the action of SFN can also occur through the peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1-alpha (PGC-1α). The difference in the pathway of activation by SFN seems to be related to the time of exposure of the cells to this compound. Since SFN is an important therapeutic strategy in the fight against oxidative stress, which is related to the development of various cardiovascular diseases, the investigation of its mechanism of action is necessary. In vitro analysis is an important tool for investigating the pathways and incubation times involved in the antioxidant action of SFN. Thus, a primary culture of adult mouse cardiomyocytes is one of the models that can be used, the main advantage being that the physiology of these cells are closer to the physiological conditions in vivo. The objective of this study was to use adult cardiomyocyte culture technique to analyze the stimulation of antioxidant defenses by SFN through Nrf2 and PGC-1α pathways at different times. Male Wistar rats were euthanized, so that their hearts were removed and submitted to the process of isolation of cardiac cells, in modified Langendorff apparatus. Cells were isolated by perfusion of the heart with Krebs solution and type II collagenase for a period of 30 minutes. After that, the isolated cells were plated and incubated at 37°C and 5% CO2. Treatment was performed with 5μM SFN and/or 5μM hydrogen peroxide (H2O2). Cells were divided into the following experimental groups: Control, SFN, H2O2 and SFN+H2O2. The groups were subdivided into two incubation times: 1 and 24 hours. Analyzes of total oxygen reactive species (ROS) and lipoperoxidation (LPO) levels were performed; activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione s-transferase (GST); protein expression of citosolic (SOD-1) and mitochondrial (SOD-2) isoforms of SOD, as well as Nrf2 and PGC-1α factors. The results of this work show that, compared to 1 hour time, SFN incubated for 24 hours increased SOD activity by 59%, SOD-1 protein expression by 55%, SOD-2 protein expression by 24%, and 69% PGC-1α protein expression. Expression of Nrf2 was 17% higher at 1 hour, over 24 hours of incubation. Regarding catalase activity and ROS and LPO levels, there were differences only in the groups incubated for 1 hour, in which the CAT activity was lower in H2O2 group, the ROS levels were decreased in SFN group, and levels of LPO were higher in H2O2 group. No differences were found in relation to GST activity. In summary, SFN demonstrated a protective role in 1 hour groups, preventing generation of ROS and lipid damage, although it does not present an expressive effect on the expression of antioxidant enzymes. The effect of incubation times on expression of Nrf2 (increased by 1 hour) and PGC-1α (increased by 24 hours) showed that there is actually a temporal relationship between the signaling of these two pathways, activated by SFN. This result is instigating for future analyzes of this temporal relationship of SFN pathways to be performed.

A substituição de cardiomiócitos na vida pós-natal tem sido um dos maiores desafios da medicina regenerativa. O conceito de que os cardiomiócitos proliferam ativamente durante o desenvolvimento, mas perdem completamente esse potencial logo após o nascimento, foi recentemente questionado quando as primeiras evidências mostraram a existência de mecanismos endógenos de regeneração cardíaca em camundongos com um dia de vida. Nós avaliamos esse fenômeno em ratos de um dia de vida (P1) e investigamos o impacto da regeneração inicial na perfusão tecidual em longo prazo e a função cardíaca global em resposta ao stress. A homogeneidade da cirurgia de ressecção apical foi comprovada através do exame de ressonância magnética (MRI) e demonstramos que os ratos P1 apresentaram evidências de neoformação de cardiomiócitos a partir da marcação de Troponina I e Conexina 43 na àrea da lesão 21 dias após a cirurgia de ressecção, enquanto os ratos de sete dias de idade (P7) apresentaram a substituição do tecido principalmente por deposição de colágeno. De maneira interessate, as células recém-formadas apresentaram uma aparente falta de alinhamento uniforme nos ratos P1, e a hipoperfusão do tecido cardíaco foi detectada para ambos os grupos de pós-ressecção 21 e aos 60 dias do exame de SPECT. A função cardíaca basal direta aos 60 dias apresentou-se preservada em todos os grupos, enquanto sob estresse hemodinâmico, o grau de mudança na LVDEP, Volume Sitólico e Trabalho Sistólico indicaram função cardíaca diminuída nos ratos P7. Além disso, a relação pressão-volume diastólica final e o aumento da deposição de colágeno intersticial no P7 são consistentes com o aumento da rigidez da câmara. Coletivamente, nós mostramos que o potencial regenerativo com ausência de remodelamento cardíaco adverso é restrito aos ratos P1. Em seguida, procurou-se avaliar os mecanismos moleculares que regulam esse fenômeno através da combinação de ferramentas exploratórias. Embora tenha sido descrito anteriormente que o sistema imunológico não é totalmente maduro ao nascimento, o sequenciamento do RNA total de corações de ratos sham-operados, P1 e P7 mostrou que o procedimento cirúrgico foi suficiente para ativar algumas vias ligadas à resposta inflamatória e considerando as subpopulações de macrófagos pró (M1) e anti-inflamatórios (M2), sugerimos que o perfil de macrófagos anti-inflamatórios (M2) infiltrados no coração de ratos P1 são diferentes das células adultas pró-fibróticas regulares. Os meios condicionados M1 e M2 elevaram a taxa de proliferação de cardiomiócitos em condições de normóxia, mas somente o M2 apresentou resposta proliferativa em hipóxia e preveniu a diferenciação-induzida de fibroblastos cardíacos por menor expressão ?SMA. Por membranas array de citocinas, 15 citocinas apresentaram-se comuns aos dois meios condicionados, mas apenas 4 citocinas, sendo elas IL-4, IL-1?, IL-6 e Fractalkine, foram exclusivas ao meio condicionado M2, e que poderiam ser possíveis candidatos aos efeitos regenerativos encontrados. Nesse sentido, experimentos futuros fazem-se necessários a fim de explorar os efeitos dessas citocinas e desenvolver novas estratégias terapêuticas / The replacement of cardiomyocytes in postnatal life has proven to be one of the biggest challenges in regenerative medicine. The concept that cardiomyocytes proliferate actively during development but cease completely right after birth has been recently questioned when first evidences showed the existence of endogenous mechanisms of cardiac regeneration in one-day-old mice. We sought to evaluate this phenomenon in one-day-old rats (P1) and to assess the impact of the early regenerative process on long-term tissue perfusion and overall cardiac function in response to stress. We confirmed the successful apical resection surgery through magnetic resonance imaging (MRI) and that P1 heart was associated with evidence of cardiomyocytes neoformation as indicated by Troponin I and Connexin 43 expression at 21 days postresection, while in seven-day-old rats (P7) mainly scar tissue replacement ensued. Interestingly, there was an apparent lack of uniform alignment of newly formed cells in P1, and cardiac tissue hypoperfusion has been detected for both groups at 21 postresection and at 60 days through SPECT scanning. Direct basal cardiac function at 60 days, was preserved in all groups, whereas under hemodynamic stress the degree of change on LVDEP, Stroke Volume and Stroke Work indicated diminished overall cardiac function in P7. Furthermore, the End-Diastolic Pressure-Volume relationship and increased interstitial collagen deposition in P7 is consistent with increased chamber stiffness. Collectively, we showed that regenerative potential with slight collagen deposition is restricted to P1 rats. Then we sought to evaluate the molecular mechanisms that regulate this phenomenon through explorative tools. Although it has been previously described that the immune system is not fully mature at birth, total RNA sequenced from sham-operated, P1 and P7 heart rats showed that surgery is sufficient to activate inflammatory pathways, and considering pro (M1) and anti-inflammatory (M2) macrophages subpopulations, we suggested that invaded macrophages in resected P1 hearts are different from the traditional pro-fibrotic M2-like adult cells. Conditioned M1 and M2 medium elevated cardiomyocytes proliferative rate under basal conditions, but only M2 produced the same effect in cardiomyocytes under hypoxia and prevented myofibroblasts-induced differentiation through ?SMA intensity expression. Membrane array for cytokines showed 15 common cytokines for both M1 and M2 conditioned medium, but only 4, as IL-4, IL-1?, IL-6 and Fractalkine, were M2 exclusive and possible candidates to the regenerative potential. Additional experiments are needed to further explore these cytokines and to maybe develop new therapeutic strategies

O sulforafano (SFN) é um composto natural que possui propriedades antioxidantes, estimulando, principalmente, o sistema antioxidante endógeno celular. Este composto está associado a uma via clássica de ativação, a via do fator eritroide nuclear tipo 2 (Nrf2). Entretanto, estudos mais recentes têm demonstrado que a ação do SFN também pode se dar pela via do coativador 1-alfa do receptor ativado por proliferador do peroxissoma (PGC-1α). A diferença da via de ativação pelo SFN parece ter relação com o tempo de exposição das células a este composto. Visto que o SFN é uma importante estratégia terapêutica no combate ao estresse oxidativo, que está relacionado ao desenvolvimento de diversas doenças cardiovasculares, a investigação do seu mecanismo de ação é necessária. A análise in vitro é uma ferramenta importante para a investigação das vias e tempos de incubação envolvidos na ação antioxidante do SFN. Sendo assim, a cultura primária de cardiomiócitos de ratos adultos é um dos modelos que pode ser utilizado, sendo a sua principal vantagem, o fato da fisiologia destas células se aproximar mais das condições fisiológicas in vivo. O objetivo deste estudo, então, foi analisar a estimulação de defesas antioxidantes feita pelo SFN, através das vias do Nrf2 e do PGC-1α, em tempos diferentes, utilizando a técnica de cultura de cardiomiócitos adultos. Ratos Wistar machos foram eutanasiados, para que seus corações fossem retirados e submetidos ao processo de isolamento de células cardíacas, em aparelho de Langendorff modificado. As células foram isoladas através da perfusão do coração com solução de Krebs e colagenase tipo II, por um período de 30 minutos. Após isso, as células isoladas foram plaqueadas e mantidas em incubadora a 37°C e 5% de CO2. Foi realizado o tratamento com 5 μM de SFN e/ou 5 μM de peróxido de hidrogênio (H2O2). As células foram divididas nos seguintes grupos experimentais: Controle, SFN, H2O2 e SFN+H2O2. Os grupos foram subdivididos em dois tempos de incubação: 1 e 24 horas. Foram realizadas as análises dos níveis totais de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de lipoperoxidação (LPO); atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa s-transferase (GST); expressão proteica das isoformas citosólica (SOD-1) e mitocondrial (SOD-2) da SOD, e dos fatores Nrf2 e PGC-1α. Os resultados do trabalho mostram que, em relação ao tempo de 1 hora, o SFN incubado por 24 horas aumentou em 59% a atividade da SOD, 55% a expressão proteica da SOD-1, 24% a expressão proteica da SOD-2 e 69% a expressão proteica do PGC-1α. A expressão do Nrf2 foi 17% maior no tempo de 1 hora, em relação a 24 horas. Em relação à atividade da catalase e aos níveis de ROS e de LPO, houve diferença somente nos grupos incubados por 1 hora, nos quais a atividade da CAT foi menor no grupo H2O2, os níveis de ROS estavam diminuídos no grupo SFN, e os níveis de LPO estavam maiores no grupo H2O2. Não foram encontradas diferenças em relação à atividade da GST. Como conclusão, o SFN demonstrou um papel protetor nos grupos 1 hora, impedindo a geração de ROS e de dano a lipídeos, apesar de não apresentar um efeito expressivo sobre as enzimas antioxidantes. O efeito dos tempos de incubação na expressão do Nrf2 (aumentada em 1 hora) e do PGC-1α (aumentada em 24 horas) mostrou que realmente há uma relação temporal entre a sinalização destas duas vias, ativadas pelo SFN. Este resultado é instigante para que futuras análises dessa relação temporal das vias do SFN sejam realizadas. / Sulforaphane (SFN) is a natural compound that has antioxidant properties, mainly stimulating the endogenous cellular antioxidant system. This compound is associated with a classical pathway of activation, the nuclear erythroid factor 2 (Nrf2) pathway. However, more recent studies have shown that the action of SFN can also occur through the peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1-alpha (PGC-1α). The difference in the pathway of activation by SFN seems to be related to the time of exposure of the cells to this compound. Since SFN is an important therapeutic strategy in the fight against oxidative stress, which is related to the development of various cardiovascular diseases, the investigation of its mechanism of action is necessary. In vitro analysis is an important tool for investigating the pathways and incubation times involved in the antioxidant action of SFN. Thus, a primary culture of adult mouse cardiomyocytes is one of the models that can be used, the main advantage being that the physiology of these cells are closer to the physiological conditions in vivo. The objective of this study was to use adult cardiomyocyte culture technique to analyze the stimulation of antioxidant defenses by SFN through Nrf2 and PGC-1α pathways at different times. Male Wistar rats were euthanized, so that their hearts were removed and submitted to the process of isolation of cardiac cells, in modified Langendorff apparatus. Cells were isolated by perfusion of the heart with Krebs solution and type II collagenase for a period of 30 minutes. After that, the isolated cells were plated and incubated at 37°C and 5% CO2. Treatment was performed with 5μM SFN and/or 5μM hydrogen peroxide (H2O2). Cells were divided into the following experimental groups: Control, SFN, H2O2 and SFN+H2O2. The groups were subdivided into two incubation times: 1 and 24 hours. Analyzes of total oxygen reactive species (ROS) and lipoperoxidation (LPO) levels were performed; activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione s-transferase (GST); protein expression of citosolic (SOD-1) and mitochondrial (SOD-2) isoforms of SOD, as well as Nrf2 and PGC-1α factors. The results of this work show that, compared to 1 hour time, SFN incubated for 24 hours increased SOD activity by 59%, SOD-1 protein expression by 55%, SOD-2 protein expression by 24%, and 69% PGC-1α protein expression. Expression of Nrf2 was 17% higher at 1 hour, over 24 hours of incubation. Regarding catalase activity and ROS and LPO levels, there were differences only in the groups incubated for 1 hour, in which the CAT activity was lower in H2O2 group, the ROS levels were decreased in SFN group, and levels of LPO were higher in H2O2 group. No differences were found in relation to GST activity. In summary, SFN demonstrated a protective role in 1 hour groups, preventing generation of ROS and lipid damage, although it does not present an expressive effect on the expression of antioxidant enzymes. The effect of incubation times on expression of Nrf2 (increased by 1 hour) and PGC-1α (increased by 24 hours) showed that there is actually a temporal relationship between the signaling of these two pathways, activated by SFN. This result is instigating for future analyzes of this temporal relationship of SFN pathways to be performed.