Estudos envolvendo os glicocorticoides merecem destaque devido a serem hormônios responsáveis pela transferência de informações e instruções às células, desta forma regulando o metabolismo, desenvolvimento, crescimento, função imune e também auxiliam no controle das funções tanto reprodutivas quanto tecidual. Estes também são sintetizados e amplamente utilizados com finalidade terapêutica processos alérgicos, tratamento de doenças autoimunes, em transplantes no pré-operatório e/ou pós-operatório-, devido a sua eficiente ação como imunossupressores e anti-inflamatórios. Os dois primeiros capítulos deste trabalho exibem uma revisão da literatura com foco em considerações gerais sobre os glicocorticoides, metodologias empregadas na análise destes hormônios e fundamentos da eletroforese capilar. Na sequência, o quarto capitulo, mostra a otimização da separação de 17 glicocorticoides utilizando cromatografia eletrocinética micelar devido a alto grau hidrofóbico dos analitos. Para tal, a composição do eletrólito consistiu em 20mM de tetraborato de sódio (pH=9.3) e 30 mM de dodecil sulfato de sódio (como surfactante), e a interação soluto-micela e, portanto, retenção do soluto, foi manipulada com a adição (volume/volume) de solventes orgânicos na composição de até 20% acetonitrila (ACN), 20% etanol (EtOH) e 1% tetrahidrofurano (THF), a qual se baseia num modelo de desenho de misturas (totalizando dez diferentes eletrólitos), e através desta abordagem um ótimo de separação foi obtido (13,3% EtOH, 3,3% ACN e 0,17% THF). A melhor condição de separação foi testada qualitativamente numa amostra de urina de um voluntário que faz uso contínuo de prednisona como terapia corticoidal. As misturas de solventes estudadas neste trabalho afetam a solubilidade dos hormônios na fase aquosa e a estrutura micelar também sofre grande impacto,principalmente na camada de solvatação. O quarto capítulo busca racionalizar tais efeitos através da obtenção de descritores, e as informações contidas nos descritores hidrofóbicos e hidrofílicos são sempre relevantes e contribuem nas correlações encontradas. Obteve três grupos de comportamento distinto, onde a capacidade doadora e aceptora de prótons para a realização de ligações de hidrogênios foram as interações consideradas as mais relevantes para o comportamento observado da separação. E o capítulo final, apresenta possibilidades de aproveitamento no controle de qualidade na indústria farmacêutica, métodos baseados na injeção e tensão inversas foram propostos a fim de ganho de tempo de análise (máximo de 5 minutos), estes foram validados seguindo o protocolo preconizado pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) nos parâmetros: precisão, exatidão, seletividade, linearidade, limites de detecção e quantificação e robustez; e aplicados na quantificação de quatro (diferentes formulações comerciais contendo glicocorticoides (prednisona 20 mg, betametasona 4 mg, furoato de mometasona 200 mcg e dipropionato de beclometasona 200 mcg). / Studies involving glucocorticoids deserve to be highlighted because they are hormones responsible for the transfer of information and instructions to cells, thus regulating metabolism, development, growth, immune function and also assist in the control of both reproductive and tissue functions. These are also synthesized and widely used for therapeutic purposes - allergic processes, treatment of autoimmune diseases, in preoperative and/or postoperative transplants - due to their efficient action as immunosuppressants and anti-inflammatories. The first two chapters of this paper present a review of the literature focusing on general considerations about glucocorticoids, methodologies used in the analysis of these hormones and fundamentals of capillary electrophoresis. Subsequently, the fourth chapter shows the optimization of the separation of 17 glucocorticoids using micellar electrokinetic chromatography due to the high hydrophobic degree of the analytes. To this end, the electrolyte composition consisted of 20 mM sodium tetraborate (pH = 9.3) and 30 mM sodium dodecyl sulfate (as a surfactant), and the solute-micelle interaction and therefore solute retention was manipulated with organic solvent in the composition of up to 20% acetonitrile (ACN), 20% ethanol (EtOH) and 1% tetrahydrofuran (THF), which is based on a mixture design model (totaling ten different electrolytes), and through this approach an optimal separation was obtained (13.3% EtOH, 3.3% ACN and 0.17% THF). The best separation condition was qualitatively tested in a urine sample from a volunteer who makes continuous use of prednisone as corticosteroid therapy. The solvent mixtures studied in this work affect the solubility of the hormones in the aqueous phase and the micellar structure also has a great impact, especially on the solvation layer. The fourth chapter seeks to rationalize these effects by obtainingdescriptors, and the information contained in the hydrophobic and hydrophilic descriptors is always relevant and contributes to the correlations found. It obtained three groups of distinct behavior, where the donor and acceptor capacity of protons for the realization of hydrogen bonds were the interactions considered the most relevant for the observed behavior of the separation. And the final chapter presents possibilities of use in quality control in the pharmaceutical industry, methods based on injection and reverse voltage were proposed in order to gain analysis time (maximum of 5 minutes), these were validated following the protocol recommended by ANVISA (Brazilian National Agency of Sanitary Surveillance) in the parameters: precision, accuracy, selectivity, linearity, limits of detection and quantification and robustness; and applied in the quantification of four different commercial formulations containing glucocorticoids (prednisone 20 mg, betamethasone 4 mg, mometasone furoate 200 mcg and beclomethasone dipropionate 200 mcg).

Estudos envolvendo os glicocorticoides merecem destaque devido a serem hormônios responsáveis pela transferência de informações e instruções às células, desta forma regulando o metabolismo, desenvolvimento, crescimento, função imune e também auxiliam no controle das funções tanto reprodutivas quanto tecidual. Estes também são sintetizados e amplamente utilizados com finalidade terapêutica processos alérgicos, tratamento de doenças autoimunes, em transplantes no pré-operatório e/ou pós-operatório-, devido a sua eficiente ação como imunossupressores e anti-inflamatórios. Os dois primeiros capítulos deste trabalho exibem uma revisão da literatura com foco em considerações gerais sobre os glicocorticoides, metodologias empregadas na análise destes hormônios e fundamentos da eletroforese capilar. Na sequência, o quarto capitulo, mostra a otimização da separação de 17 glicocorticoides utilizando cromatografia eletrocinética micelar devido a alto grau hidrofóbico dos analitos. Para tal, a composição do eletrólito consistiu em 20mM de tetraborato de sódio (pH=9.3) e 30 mM de dodecil sulfato de sódio (como surfactante), e a interação soluto-micela e, portanto, retenção do soluto, foi manipulada com a adição (volume/volume) de solventes orgânicos na composição de até 20% acetonitrila (ACN), 20% etanol (EtOH) e 1% tetrahidrofurano (THF), a qual se baseia num modelo de desenho de misturas (totalizando dez diferentes eletrólitos), e através desta abordagem um ótimo de separação foi obtido (13,3% EtOH, 3,3% ACN e 0,17% THF). A melhor condição de separação foi testada qualitativamente numa amostra de urina de um voluntário que faz uso contínuo de prednisona como terapia corticoidal. As misturas de solventes estudadas neste trabalho afetam a solubilidade dos hormônios na fase aquosa e a estrutura micelar também sofre grande impacto,principalmente na camada de solvatação. O quarto capítulo busca racionalizar tais efeitos através da obtenção de descritores, e as informações contidas nos descritores hidrofóbicos e hidrofílicos são sempre relevantes e contribuem nas correlações encontradas. Obteve três grupos de comportamento distinto, onde a capacidade doadora e aceptora de prótons para a realização de ligações de hidrogênios foram as interações consideradas as mais relevantes para o comportamento observado da separação. E o capítulo final, apresenta possibilidades de aproveitamento no controle de qualidade na indústria farmacêutica, métodos baseados na injeção e tensão inversas foram propostos a fim de ganho de tempo de análise (máximo de 5 minutos), estes foram validados seguindo o protocolo preconizado pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) nos parâmetros: precisão, exatidão, seletividade, linearidade, limites de detecção e quantificação e robustez; e aplicados na quantificação de quatro (diferentes formulações comerciais contendo glicocorticoides (prednisona 20 mg, betametasona 4 mg, furoato de mometasona 200 mcg e dipropionato de beclometasona 200 mcg). / Studies involving glucocorticoids deserve to be highlighted because they are hormones responsible for the transfer of information and instructions to cells, thus regulating metabolism, development, growth, immune function and also assist in the control of both reproductive and tissue functions. These are also synthesized and widely used for therapeutic purposes - allergic processes, treatment of autoimmune diseases, in preoperative and/or postoperative transplants - due to their efficient action as immunosuppressants and anti-inflammatories. The first two chapters of this paper present a review of the literature focusing on general considerations about glucocorticoids, methodologies used in the analysis of these hormones and fundamentals of capillary electrophoresis. Subsequently, the fourth chapter shows the optimization of the separation of 17 glucocorticoids using micellar electrokinetic chromatography due to the high hydrophobic degree of the analytes. To this end, the electrolyte composition consisted of 20 mM sodium tetraborate (pH = 9.3) and 30 mM sodium dodecyl sulfate (as a surfactant), and the solute-micelle interaction and therefore solute retention was manipulated with organic solvent in the composition of up to 20% acetonitrile (ACN), 20% ethanol (EtOH) and 1% tetrahydrofuran (THF), which is based on a mixture design model (totaling ten different electrolytes), and through this approach an optimal separation was obtained (13.3% EtOH, 3.3% ACN and 0.17% THF). The best separation condition was qualitatively tested in a urine sample from a volunteer who makes continuous use of prednisone as corticosteroid therapy. The solvent mixtures studied in this work affect the solubility of the hormones in the aqueous phase and the micellar structure also has a great impact, especially on the solvation layer. The fourth chapter seeks to rationalize these effects by obtainingdescriptors, and the information contained in the hydrophobic and hydrophilic descriptors is always relevant and contributes to the correlations found. It obtained three groups of distinct behavior, where the donor and acceptor capacity of protons for the realization of hydrogen bonds were the interactions considered the most relevant for the observed behavior of the separation. And the final chapter presents possibilities of use in quality control in the pharmaceutical industry, methods based on injection and reverse voltage were proposed in order to gain analysis time (maximum of 5 minutes), these were validated following the protocol recommended by ANVISA (Brazilian National Agency of Sanitary Surveillance) in the parameters: precision, accuracy, selectivity, linearity, limits of detection and quantification and robustness; and applied in the quantification of four different commercial formulations containing glucocorticoids (prednisone 20 mg, betamethasone 4 mg, mometasone furoate 200 mcg and beclomethasone dipropionate 200 mcg).

Este trabalho tem como objetivo a síntese e a determinação de propriedades micelares de líquidos iônicos tensoativos (LITs) catiônicos. Dentre as características importantes desses compostos destacamos: alta deslocalização da carga e caráter ácido no hidrogênio H2 do anel heterocíclico e a grande flexibilidade estrutural, estas são relevantes para as propriedades de soluções desses tensoativos, e, consequentemente, para suas aplicações. A influência da variação estrutural nas suas propriedades é importante para modular as propriedades micelares e, por consequência suas aplicações. A síntese de LITs foi realizada por aquecimento convencional e irradiação por micro-ondas, o último método foi o mais eficiente. Inicialmente, estudamos a influência do comprimento da cadeia carbônica (fator importante para a energia de formação de micelas), de cloretos de 1-alquil-3-metilimidazólio, tendo a cadeia n-alquílica 10 a 16 átomos de carbonos. Em seguida, comparamos as propriedades dos LITs acima mencionados com as de tensoativos convencionais, cloretos de 1-alquilpiridínio e cloretos 1-alcanoil-amidoetil benzildimetilamônio. Por fim, estudamos a influência do volume da cabeça-polar, utilizando cloretos de 1-alquil-3-hexadecilimidazólio, tendo a cadeia alquílica secundária 1 a 5 átomos de carbono. As propriedades micelares foram investigadas por tensão superficial, condutividade, calorimetria, espalhamento de luz e ressonância magnética nuclear. Os resultados mostraram que ligações de hidrogênio (devido ao H2 ácido do anel imidazólio) e as interações hidrofóbicas são relevantes para a formação de micelas e que o aumento do volume da cabeça-polar favorece a micelização e a formação de agregados pré-micelares / The objective of this work is the synthesis and determination of the micelar properties of cationic surface-active ionic liquids (SAILs). Among the important characteristics of these compounds are: high charge delocalization and acid character of hydrogen H2 of the heterocyclic ring and large structural flexibility, the latter is relevant to solution properties of these surfactants, hence to their applications. Synthesis of SAILs was carried out by conventional heating or by microwave irradiation, the later method was more efficient. Initially, we studied the influence of the chain length of the alkyl group (an important factor for the energy of micelle formation) of 1-alkyl-3-methylimidazolium chlorides, n-alkyl group having 10 to 16 carbon atoms. Then, we compared the properties of the above mentioned SAILs with conventional surfactants, 1-alkylpyridinium chlorides and 1-alkanoyl-amidoethyl benzyldimethylammonium chlorides. Finally, we studied the influence of the head-group volume, by studying 1-alkyl-3-hexadecylimidazolium chlorides, with secondary n-alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. The micelar properties were investigated by surface tension, conductivity, calorimetry, light scattering and nuclear magnetic resonance. Our results have shown that hydrogen bonding (due to the acidic H2 of the imidazolium ring) and hydrophobic interactions are relevant to micelle formation; increasing the head-group volume favors micellization and the formation of pre-micellar aggregates

A combinação entre o delapril (DEL), um inibidor da enzima conversora de angiotensina e o manidipino (MAN), um antagonista dos canais de cálcio, produz um efeito anti-hipertensivo sinérgico, podendo ser considerado um ótimo tratamento para pacientes com hipertensão essencial leve e moderada. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos cromatográfico e eletroforético para avaliação simultânea de DEL e MAN em produto farmacêutico. As análises por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) foram executadas utilizando coluna C8 (250 mm x 4,6 mm), mantida a 35 oC. A fase móvel foi constituída por acetonitrila e solução de trietilamina 0,3%, pH 3,0 (55:45; v/v), eluída na vazão de 1,2 mL/min com detecção a 220 nm. Paralelamente, desenvolveu-se método por eletroforese capilar, utilizando modo de separação por cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) e ácido salicílico como padrão interno. Foi utilizado capilar de sílica fundida (comprimento efetivo de 72 cm) mantido a 35 °C, com solução eletrolítica composta de tampão borato 50 mM e dodecil sulfato de sódio (SDS) 5 mM, pH 9,0. Voltagem de 25 kV foi aplicada e a injeção foi de 50 mbar durante 5 s, com detecção a 208 nm. A especificidade e a capacidade dos métodos serem indicativos de estabilidade foram demonstradas através de estudos de degradação forçada dos fármacos e pela não interferência dos excipientes nas análises. Além disso, o desenho experimental Plackett-Burman foi utilizado para a avaliação da robustez, observando-se resultados adequados para ambos métodos. Os procedimentos foram validados de acordo com guias aceitos internacionalmente, observando-se resultados em uma faixa aceitável. Os métodos propostos foram aplicados com sucesso na determinação quantitativa simultânea de DEL e MAN em comprimidos, não havendo diferença significativa dos resultados (P>0,05), contribuindo, portanto, para aprimorar o controle da qualidade, assegurando a eficácia terapêutica. / The combination of delapril (DEL), an angiotensin converting enzyme inhibitor and manidipine (MAN), an antagonist of calcium channels, produces a synergic antihypertensive effect and may be regarded as an optimal antihypertensive drug treatment in mild to moderate essential hypertensive patients. The chromatographic and eletrophoretic methods for the simultaneous evaluation of DEL and MAN in pharmaceutical product were developed and validated in the present work. The reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was carried out on a C8 column (250 mm x 4.6 mm i.d., 5 μm), maintained at 35 ºC. The mobile-phase consisted of acetonitrile and a solution of triethylamine 0.3% pH 3.0 (55:45; v/v), running at a flow rate of 1.2 mL/min, with detection at 220 nm. The capillary electrophoresis method was developed using the micellar electrokinetic chromatography (MEKC) as the separation mode, and salicylic acid as internal standard. The analysis were performed on a fused-silica capillary (effective length of 72 cm) maintained at 35 °C, with 50 mM of borate buffer and 5 mM of sodium dodecyl sulfate (SDS) at pH 9.0 as background electrolyte. The separation was achieved at 25 kV applied voltage and the injection was performed at 50 mbar for 5 s, with detection at 208 nm. The specificity and stability-indicating capability of the methods were demonstrated through forced degradation studies, which also show that there is no interference of the excipients in the analysis. Moreover, the Plackett- Burman experimental design was used for robustness evaluation, giving acceptable results for both methods. The procedures were validated according to Internationals guidelines, giving results within the acceptable range. Therefore, the proposed methods were successfully applied for the simultaneous quantitative analysis of DEL and MAN in the tablet dosage form, showing non-significant difference (P>0.05), contributing to improve the quality control and to assure the therapeutic efficacy.

<p>Studies have been performed to evaluate the use of micellar electrokinetic chromatography (MEKC), one mode of capillary electrophoresis (CE), as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis. The potential for using chemometrics for the optimisation of MEKC methods has also been studied as well as the possibilities of coupling MEKC with mass spectrometry (MS). </p><p>Two methods were developed, one for the determination of ibuprofen and codeine and another for pilocarpine, together with their degradation products and impurities in both cases. MEKC was found to be the most suitable mode of CE for the methods. Both methods were optimised by means of experimental design. Valuable information was gathered and optimum conditions were defined which resulted in fast systems with baseline-separated peaks. The ibuprofen-codeine method was validated according to the recommended validation procedures of the International Conference of Harmonisation. The validation was performed on a commercially available tablet formulation to verify the suitability of the method, i.e. for quantification of the two main compounds and to determine the degradation products and impurities in area% of each main peak. The following parameters were determined: selectivity, linearity, accuracy, precision, detection limit, quantitation limit, robustness and range. The results confirm that the method is highly suitable for its intended purpose, i.e. as a routine method for assay and impurity determination. The MEKC method for ibuprofen-codeine was coupled to a mass spectrometer in order to evaluate the potential of partial filling (PF)-MEKC-MS for identification of impurities in pharmaceutical substances and products. The so-called partial-filling technique was used to prevent the non-volatile micelles from entering the MS and was shown to fulfil its purpose of providing detection limits of about 10 pg. </p><p>The study clearly shows that micellar electrokinetic chromatography is well-suited as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis. </p>

Studies have been performed to evaluate the use of micellar electrokinetic chromatography (MEKC), one mode of capillary electrophoresis (CE), as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis. The potential for using chemometrics for the optimisation of MEKC methods has also been studied as well as the possibilities of coupling MEKC with mass spectrometry (MS). Two methods were developed, one for the determination of ibuprofen and codeine and another for pilocarpine, together with their degradation products and impurities in both cases. MEKC was found to be the most suitable mode of CE for the methods. Both methods were optimised by means of experimental design. Valuable information was gathered and optimum conditions were defined which resulted in fast systems with baseline-separated peaks. The ibuprofen-codeine method was validated according to the recommended validation procedures of the International Conference of Harmonisation. The validation was performed on a commercially available tablet formulation to verify the suitability of the method, i.e. for quantification of the two main compounds and to determine the degradation products and impurities in area% of each main peak. The following parameters were determined: selectivity, linearity, accuracy, precision, detection limit, quantitation limit, robustness and range. The results confirm that the method is highly suitable for its intended purpose, i.e. as a routine method for assay and impurity determination. The MEKC method for ibuprofen-codeine was coupled to a mass spectrometer in order to evaluate the potential of partial filling (PF)-MEKC-MS for identification of impurities in pharmaceutical substances and products. The so-called partial-filling technique was used to prevent the non-volatile micelles from entering the MS and was shown to fulfil its purpose of providing detection limits of about 10 pg. The study clearly shows that micellar electrokinetic chromatography is well-suited as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis.

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O presente trabalho teve por objetivo a avaliação físico-química e biológica de uma fração de saponinas enriquecida, obtida a partir de frutos verdes de Ilex paraguariensis A. St. Hil (mate). A espécie apresenta grande importância econômica para vários países sul-americanos, dentre eles o Brasil. Os frutos verdes da espécie acumulam significativa quantidade de saponinas, entretanto, são considerados subproduto da indústria do beneficiamento das folhas de mate. O extrato liofilizado dos frutos (EX40) foi obtido por turboextração na proporção planta-solvente de 1:10 utilizando como solvente solução hidroalcoólica a 40%. Para análise do extrato bruto foi desenvolvido e validado um método analítico por CLAE-UV, que permitiu: 1) quantificar o marcador químico ilexosídeo II em EX40; 2) estimar o conteúdo em saponinas totais do extrato, tendo sido obtidos valores de 8,2 g% e 47,6 g% respectivamente. Uma fração enriquecida em saponinas, denominada MSF, foi obtida mediante fracionamento em fase sólida a partir de EX40, utilizando resina hidrofóbica poliaromática e gradiente metanol:água de polaridade decrescente. Os maiores teores de saponinas foram obtidos para as frações contendo 70 e 90 % de metanol. A reprodutibilidade do processo foi avaliada por CLAE-UV, considerando o desvio padrão relativo (DPR) entre a área dos dois picos majoritários de MSF produzidas em seis lotes distintos. Valores de DPR de 8,17% para o pico I (ilexosídeo II) e 5,96 % para o pico II (majoritário) foram obtidos. A toxicidade da fração foi avaliada pelo potencial hemolítico in vitro e citotoxicidade sobre cultura de células de mamífero (MDBK ATCC CCL-22). Para atividade hemolítica foi determinado um valor de IC50 de 0,2 g/L (0,22 mM, expresso em ilexosídeo II). O valor de IC50 para citotoxicidade foi 3,8 g/L (4,04 mM, expresso em ilexosídeo II), caracterizando um produto de baixa toxicidade. Dentre as várias atividades biológicas descritas para saponinas, selecionouse avaliar MSF quanto ao seu potencial como imunoadjuvante, assim como a atividade tricomonicida. Para o primeiro caso, MSF foi testada em uma vacina contendo herpesvírus bovino tipo 5 como antígeno viral, nas doses de 100 e 500 μg. Entretanto, o incremento no título de IgG totais, avaliado por ELISA, não foi significativo. A atividade tricomonicida foi comparada aos tensoativos polissorbato 80 e tiloxapol e a uma fração enriquecida em saponinas de Quillaja saponaria. Após 24 h de incubação foi observado para MSF um efeito dose-dependente, atingindo letalidade total dos trofozoítos na concentração de 0,6 g/L. Esse efeito foi superior ao observado para polissorbato 80 e tiloxapol e similar ao de quillaia. O tratamento com metronidazol, administrado tanto após tratamento prévio dos trofozoítos com MSF quanto em associação com essa fração, não revelou qualquer alteração significativa no efeito de ambos os produtos, o que sugere ausência de interação entre MSF e MTZ e a possível existência de mecanismos de ação distintos. A caracterização físico-química enfatizou o estudo do tamanho e forma das micelas, seu comportamento reológico e capacidade de solubilizar compostos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi determinada em 0,41 g/L utilizando um corante hidrofóbico como marcador. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e CRIO-MET revelou a presença simultânea de micelas alongadas, com tamanho superior a 500 nm, e micelas esféricas de tamanho menor. Para a fração de micelas esféricas, a análise por espalhamento de nêutrons a baixo ângulo permitiu estabelecer diâmetro de 17,9 Å, perfazendo 23,1 e 32,6 % das micelas observadas em soluções de MSF a 0,5 e 1,0 % m/v, respectivamente. O comportamento reológico de MSF nas concentrações de 0,25 a 4,0 %, determinado por reometria dinâmica com controle de deformação, foi do tipo viscoelástico para todas as concentrações. Esse fato corrobora a existência de agregados não-esféricos, filiformes, semelhantes a micelas tipo wormlike. A solubilização micelar de fármacos mediante MSF foi avaliada utilizando como substâncias-modelos os fármacos flurbiprofeno – FLB (ácido fraco) e carbamazepina - CBZ (base fraca), ambos pouco solúveis, e saponinas de quillaia como produto de comparação. Nas concentrações de 0,13 a 1,5 % as saponinas de quillaia foram mais eficientes frente ao flurbiprofeno, enquanto MSF foi capaz de aumentar significativamente a solubilidade da carbamazepina. O incremento na solubilização gerado por MSF foi de 0,0145 e 0,0129 g/L para CBZ e FLB, respectivamente. / The present work aimed the physicochemical and biological evaluation of a saponin enriched fraction from the green fruits of Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate), a species of great economical importance in several Southern American countries, including Brazil. Despite possessing high amounts of saponins, mate green fruits have no commercial use to date and are considered a waste product from the mate leaves processing companies. Mate fruits lyophilized extract (EX40) was produced using turbo-extraction having a 40:60 mixture of water and ethanol as solvent and a 1:10 drug/solvent proportion. An HPLC-UV method was developed and validated aiming at: I) Quantify the EX40 chemical marker, ilexoside II; II) Determine the EX40 total saponin content. The values obtained were of 8.20 wt% and 47.60 wt%, respectively. An enriched saponin fraction (MSF) was obtained from EX40 through a solid phase extraction process within a polyaromatic resin and a decreasing solvent polarity gradient of methanol and water. The higher recovery of mate saponins was achieved with the 70 and 90 % methanol-containing fractions. The process reproducibility was assessed by HPLC-UV through the analysis of the relative standard deviation (RSD) of the two major MSF saponins peak areas obtained in six different batches. RSD values of 8.17 % for peak I (ilexoside II) and 5.96 % for peak II (major peak) were obtained. The MSF toxicity was evaluated according to its haemolytical activity and in vitro cytotoxicity against a mammalian cell culture lineage (MDBK ATCC CCL-22). Values of IC50 of 0.2 g/L (0.22 mM expressed as ilexoside II) and 3.8 g/L (4.04 mM as Ilexoside II) were found for the haemolysis and cytotoxicity respectively. Therefore we could classify MSF as a low toxicity product. Among the several biological activities ascribed to saponins, this work focused on the investigation of MSF immune enhancer potential and its anti-trichomonads vaginalis activity. For the first evaluation, MSF wad added to a bovine herpesvirus 5 vaccine, at 100 and 500 μg doses. However total IGg titres determined by ELISA were not statistically significant. The antitrichomonads activity of MSF was compared a saponin enriched fraction from the species Quillaja saponaria (Quillaja) and to tyloxapol and polysorbate 80. After 24h of incubation MSF presented a dose-dependent activity with total trophozoites lethality at a concentration of 0.6 g/L. The activity was higher than the synthetic surfactants and similar to Quillaja. The treatment with metronidazole (MTZ), peformed in association and after exposing the trophozoites with MSF did not show any synergistic effect of MZT and MSF which suggest an absence of interaction between the compounds and also that they probably have distinct mechanisms of action. The physicochemical evaluation of MSF focused the determination of MSF micelles size and shape, their rheological behaviour and ability to increase the solubility of hydrophobic compounds. MSF critical micellar concentration was determined as 0.41 g/L using a hydrophobic dye as a probe. The transmission electron microscopy (TEM) and CRYO-TEM analysis revealed the occurrence of filiform micelles higher than 500 nm and smaller sizes spherical micelles simultaneously. The spherical micelles radius of 17.9 Å were determined using small angle neutron scattering.and they corresponded to 23.1 and 32.6 % of the total micelles in MSF solutions of 0.5 and 1.0 % w/v, respectively. The rheological behavior of MSF ranging in concentration from 0.25 to 4.0% was determined on a dynamic strain control rheometer and a viscoelastic behavior was observed for all concentrations. These findings corroborate the occurrence of nonspherical micelles very long in size (wormlike). MSF ability to improve the solubilisation of poor aqueous soluble drugs was assessed using carbamazepine (CBZ) and flurbiprofen (FLB) as a model of amphiphilic basic and acidic coumpounds. Saponin enriched fractions were evaluated in concentrations ranging from 0.13 to 1.5 %. Quillaja was more efficient toward the weak acid while MSF was able to increase significantly the CBZ solubility. The increase on CBZ and FLB solubility after MSF addition was of 0.0145 and 0.0129 g/L, respectively.

A combinação entre o delapril (DEL), um inibidor da enzima conversora de angiotensina e o manidipino (MAN), um antagonista dos canais de cálcio, produz um efeito anti-hipertensivo sinérgico, podendo ser considerado um ótimo tratamento para pacientes com hipertensão essencial leve e moderada. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos cromatográfico e eletroforético para avaliação simultânea de DEL e MAN em produto farmacêutico. As análises por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) foram executadas utilizando coluna C8 (250 mm x 4,6 mm), mantida a 35 oC. A fase móvel foi constituída por acetonitrila e solução de trietilamina 0,3%, pH 3,0 (55:45; v/v), eluída na vazão de 1,2 mL/min com detecção a 220 nm. Paralelamente, desenvolveu-se método por eletroforese capilar, utilizando modo de separação por cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) e ácido salicílico como padrão interno. Foi utilizado capilar de sílica fundida (comprimento efetivo de 72 cm) mantido a 35 °C, com solução eletrolítica composta de tampão borato 50 mM e dodecil sulfato de sódio (SDS) 5 mM, pH 9,0. Voltagem de 25 kV foi aplicada e a injeção foi de 50 mbar durante 5 s, com detecção a 208 nm. A especificidade e a capacidade dos métodos serem indicativos de estabilidade foram demonstradas através de estudos de degradação forçada dos fármacos e pela não interferência dos excipientes nas análises. Além disso, o desenho experimental Plackett-Burman foi utilizado para a avaliação da robustez, observando-se resultados adequados para ambos métodos. Os procedimentos foram validados de acordo com guias aceitos internacionalmente, observando-se resultados em uma faixa aceitável. Os métodos propostos foram aplicados com sucesso na determinação quantitativa simultânea de DEL e MAN em comprimidos, não havendo diferença significativa dos resultados (P>0,05), contribuindo, portanto, para aprimorar o controle da qualidade, assegurando a eficácia terapêutica. / The combination of delapril (DEL), an angiotensin converting enzyme inhibitor and manidipine (MAN), an antagonist of calcium channels, produces a synergic antihypertensive effect and may be regarded as an optimal antihypertensive drug treatment in mild to moderate essential hypertensive patients. The chromatographic and eletrophoretic methods for the simultaneous evaluation of DEL and MAN in pharmaceutical product were developed and validated in the present work. The reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was carried out on a C8 column (250 mm x 4.6 mm i.d., 5 μm), maintained at 35 ºC. The mobile-phase consisted of acetonitrile and a solution of triethylamine 0.3% pH 3.0 (55:45; v/v), running at a flow rate of 1.2 mL/min, with detection at 220 nm. The capillary electrophoresis method was developed using the micellar electrokinetic chromatography (MEKC) as the separation mode, and salicylic acid as internal standard. The analysis were performed on a fused-silica capillary (effective length of 72 cm) maintained at 35 °C, with 50 mM of borate buffer and 5 mM of sodium dodecyl sulfate (SDS) at pH 9.0 as background electrolyte. The separation was achieved at 25 kV applied voltage and the injection was performed at 50 mbar for 5 s, with detection at 208 nm. The specificity and stability-indicating capability of the methods were demonstrated through forced degradation studies, which also show that there is no interference of the excipients in the analysis. Moreover, the Plackett- Burman experimental design was used for robustness evaluation, giving acceptable results for both methods. The procedures were validated according to Internationals guidelines, giving results within the acceptable range. Therefore, the proposed methods were successfully applied for the simultaneous quantitative analysis of DEL and MAN in the tablet dosage form, showing non-significant difference (P>0.05), contributing to improve the quality control and to assure the therapeutic efficacy.

O presente trabalho teve por objetivo a avaliação físico-química e biológica de uma fração de saponinas enriquecida, obtida a partir de frutos verdes de Ilex paraguariensis A. St. Hil (mate). A espécie apresenta grande importância econômica para vários países sul-americanos, dentre eles o Brasil. Os frutos verdes da espécie acumulam significativa quantidade de saponinas, entretanto, são considerados subproduto da indústria do beneficiamento das folhas de mate. O extrato liofilizado dos frutos (EX40) foi obtido por turboextração na proporção planta-solvente de 1:10 utilizando como solvente solução hidroalcoólica a 40%. Para análise do extrato bruto foi desenvolvido e validado um método analítico por CLAE-UV, que permitiu: 1) quantificar o marcador químico ilexosídeo II em EX40; 2) estimar o conteúdo em saponinas totais do extrato, tendo sido obtidos valores de 8,2 g% e 47,6 g% respectivamente. Uma fração enriquecida em saponinas, denominada MSF, foi obtida mediante fracionamento em fase sólida a partir de EX40, utilizando resina hidrofóbica poliaromática e gradiente metanol:água de polaridade decrescente. Os maiores teores de saponinas foram obtidos para as frações contendo 70 e 90 % de metanol. A reprodutibilidade do processo foi avaliada por CLAE-UV, considerando o desvio padrão relativo (DPR) entre a área dos dois picos majoritários de MSF produzidas em seis lotes distintos. Valores de DPR de 8,17% para o pico I (ilexosídeo II) e 5,96 % para o pico II (majoritário) foram obtidos. A toxicidade da fração foi avaliada pelo potencial hemolítico in vitro e citotoxicidade sobre cultura de células de mamífero (MDBK ATCC CCL-22). Para atividade hemolítica foi determinado um valor de IC50 de 0,2 g/L (0,22 mM, expresso em ilexosídeo II). O valor de IC50 para citotoxicidade foi 3,8 g/L (4,04 mM, expresso em ilexosídeo II), caracterizando um produto de baixa toxicidade. Dentre as várias atividades biológicas descritas para saponinas, selecionouse avaliar MSF quanto ao seu potencial como imunoadjuvante, assim como a atividade tricomonicida. Para o primeiro caso, MSF foi testada em uma vacina contendo herpesvírus bovino tipo 5 como antígeno viral, nas doses de 100 e 500 μg. Entretanto, o incremento no título de IgG totais, avaliado por ELISA, não foi significativo. A atividade tricomonicida foi comparada aos tensoativos polissorbato 80 e tiloxapol e a uma fração enriquecida em saponinas de Quillaja saponaria. Após 24 h de incubação foi observado para MSF um efeito dose-dependente, atingindo letalidade total dos trofozoítos na concentração de 0,6 g/L. Esse efeito foi superior ao observado para polissorbato 80 e tiloxapol e similar ao de quillaia. O tratamento com metronidazol, administrado tanto após tratamento prévio dos trofozoítos com MSF quanto em associação com essa fração, não revelou qualquer alteração significativa no efeito de ambos os produtos, o que sugere ausência de interação entre MSF e MTZ e a possível existência de mecanismos de ação distintos. A caracterização físico-química enfatizou o estudo do tamanho e forma das micelas, seu comportamento reológico e capacidade de solubilizar compostos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi determinada em 0,41 g/L utilizando um corante hidrofóbico como marcador. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e CRIO-MET revelou a presença simultânea de micelas alongadas, com tamanho superior a 500 nm, e micelas esféricas de tamanho menor. Para a fração de micelas esféricas, a análise por espalhamento de nêutrons a baixo ângulo permitiu estabelecer diâmetro de 17,9 Å, perfazendo 23,1 e 32,6 % das micelas observadas em soluções de MSF a 0,5 e 1,0 % m/v, respectivamente. O comportamento reológico de MSF nas concentrações de 0,25 a 4,0 %, determinado por reometria dinâmica com controle de deformação, foi do tipo viscoelástico para todas as concentrações. Esse fato corrobora a existência de agregados não-esféricos, filiformes, semelhantes a micelas tipo wormlike. A solubilização micelar de fármacos mediante MSF foi avaliada utilizando como substâncias-modelos os fármacos flurbiprofeno – FLB (ácido fraco) e carbamazepina - CBZ (base fraca), ambos pouco solúveis, e saponinas de quillaia como produto de comparação. Nas concentrações de 0,13 a 1,5 % as saponinas de quillaia foram mais eficientes frente ao flurbiprofeno, enquanto MSF foi capaz de aumentar significativamente a solubilidade da carbamazepina. O incremento na solubilização gerado por MSF foi de 0,0145 e 0,0129 g/L para CBZ e FLB, respectivamente. / The present work aimed the physicochemical and biological evaluation of a saponin enriched fraction from the green fruits of Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate), a species of great economical importance in several Southern American countries, including Brazil. Despite possessing high amounts of saponins, mate green fruits have no commercial use to date and are considered a waste product from the mate leaves processing companies. Mate fruits lyophilized extract (EX40) was produced using turbo-extraction having a 40:60 mixture of water and ethanol as solvent and a 1:10 drug/solvent proportion. An HPLC-UV method was developed and validated aiming at: I) Quantify the EX40 chemical marker, ilexoside II; II) Determine the EX40 total saponin content. The values obtained were of 8.20 wt% and 47.60 wt%, respectively. An enriched saponin fraction (MSF) was obtained from EX40 through a solid phase extraction process within a polyaromatic resin and a decreasing solvent polarity gradient of methanol and water. The higher recovery of mate saponins was achieved with the 70 and 90 % methanol-containing fractions. The process reproducibility was assessed by HPLC-UV through the analysis of the relative standard deviation (RSD) of the two major MSF saponins peak areas obtained in six different batches. RSD values of 8.17 % for peak I (ilexoside II) and 5.96 % for peak II (major peak) were obtained. The MSF toxicity was evaluated according to its haemolytical activity and in vitro cytotoxicity against a mammalian cell culture lineage (MDBK ATCC CCL-22). Values of IC50 of 0.2 g/L (0.22 mM expressed as ilexoside II) and 3.8 g/L (4.04 mM as Ilexoside II) were found for the haemolysis and cytotoxicity respectively. Therefore we could classify MSF as a low toxicity product. Among the several biological activities ascribed to saponins, this work focused on the investigation of MSF immune enhancer potential and its anti-trichomonads vaginalis activity. For the first evaluation, MSF wad added to a bovine herpesvirus 5 vaccine, at 100 and 500 μg doses. However total IGg titres determined by ELISA were not statistically significant. The antitrichomonads activity of MSF was compared a saponin enriched fraction from the species Quillaja saponaria (Quillaja) and to tyloxapol and polysorbate 80. After 24h of incubation MSF presented a dose-dependent activity with total trophozoites lethality at a concentration of 0.6 g/L. The activity was higher than the synthetic surfactants and similar to Quillaja. The treatment with metronidazole (MTZ), peformed in association and after exposing the trophozoites with MSF did not show any synergistic effect of MZT and MSF which suggest an absence of interaction between the compounds and also that they probably have distinct mechanisms of action. The physicochemical evaluation of MSF focused the determination of MSF micelles size and shape, their rheological behaviour and ability to increase the solubility of hydrophobic compounds. MSF critical micellar concentration was determined as 0.41 g/L using a hydrophobic dye as a probe. The transmission electron microscopy (TEM) and CRYO-TEM analysis revealed the occurrence of filiform micelles higher than 500 nm and smaller sizes spherical micelles simultaneously. The spherical micelles radius of 17.9 Å were determined using small angle neutron scattering.and they corresponded to 23.1 and 32.6 % of the total micelles in MSF solutions of 0.5 and 1.0 % w/v, respectively. The rheological behavior of MSF ranging in concentration from 0.25 to 4.0% was determined on a dynamic strain control rheometer and a viscoelastic behavior was observed for all concentrations. These findings corroborate the occurrence of nonspherical micelles very long in size (wormlike). MSF ability to improve the solubilisation of poor aqueous soluble drugs was assessed using carbamazepine (CBZ) and flurbiprofen (FLB) as a model of amphiphilic basic and acidic coumpounds. Saponin enriched fractions were evaluated in concentrations ranging from 0.13 to 1.5 %. Quillaja was more efficient toward the weak acid while MSF was able to increase significantly the CBZ solubility. The increase on CBZ and FLB solubility after MSF addition was of 0.0145 and 0.0129 g/L, respectively.