Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RenataKSE_DISSERT.pdf: 1992793 bytes, checksum: 77e111c6a7208973429d97e0cf1a51eb (MD5) Previous issue date: 2011-09-09 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Flowering is a fundamental process in the life cycle for plant. This process is marked by vegetative to reproductive apical meristem conversion, due to interactions between several factors, both internal and external to plant. Therefore, eight subtractive libraries were constructed using apical meristem induced or not induced for two contrasting species: Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and Solanum pimpinellifolium. Several cDNAs were identified and among these, were selected two cDNAs: one homologous cDNA to cyclophilin (LeCYP1) and the other to Auxin repressed protein (ARP). It has observed that LeCYP1 and ARP genes are important in the developmental process to plants. In silico analysis, were used several databases with the exclusion criterion E-value <1.0x10-15. As a result, conservation was observed for proteins analyzed by means of multiple alignments and the presence of functional domains. Then, overexpression cassettes were constructed for the ARP cDNA in sense and antisense orientations. For this step, it was used the CaMV35S promoter. The cDNA orientation (sense or antisense) in relation to the promoter was determined by restriction enzymes and sequencing. Then, this cassette was transferred to binary vector pZP211 and these cassettes were transferred into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) and MT-Rg1 plants were transformed. In addition, seedlings were subjected to hormone treatments using a synthetic auxin (&#61537;- naphthalene acetic acid) and cyclosporin A (cyclophilin inhibitor) treatments and it was found that the hormone treatment there were changes in development of lateral roots pattern, probably related to decreases in auxin signaling caused by reduction of LeCYP1 in MT-dgt plants while cyclosporin A treatments, there was a slight delay in flowering in cv. MT plants. Furthermore, assay with real-time PCR (RT-qPCR) were done for expression level analysis from LeCYP1 and ARP in order to functionally characterize these sequences in tomato plants. / A flora??o ? fundamental no ciclo de vida de uma planta. Este processo ? marcado pela convers?o do meristema apical vegetativo em reprodutivo, devido a intera??es entre diversos fatores, tanto internos quanto externos ? planta. Diante disso, foram constru?das oito bibliotecas subtrativa utilizando ?pices meristem?ticos induzidos e n?o induzidos para a flora??o de duas esp?cies de tomateiro: Solanum lycopersicum cv Micro-Tom e S. pimpinellifolium. In?meros cDNAs foram identificados e dentre estes, foram selecionados o cDNA hom?logo a ciclofilina (LeCYP1) e a Prote?na Reprimida por Auxina (ARP) para a caracteriza??o in silico e funcional em esp?cie de tomateiro. Tem sido observado em outros sistemas vegetais que os genes LeCYP1 e ARP s?o importantes no processo de desenvolvimento da planta. Na an?lise in silico, foram utilizados diversos bancos de dados, tendo como crit?rio de exclus?o o E-value <1.0x10-15. Uma conserva??o para as prote?nas analisadas foi observada por meio dos alinhamentos m?ltiplos e a presen?a de dom?nios funcionais. Em seguida, foram realizadas constru??es de cassetes de superexpress?o para o cDNA hom?logo ? ARP em orienta??o senso e antissenso. Para esta etapa, foi utilizado o promotor forte CaMV35S presente no vetor intermedi?rio pBC (Stratagene). A orienta??o do cDNA (senso ou antissenso) em rela??o ao promotor foi determinada por meio de enzimas de restri??o e sequenciamento dos potenciais clones. Em seguida, este cassete foi transferido para o vetor bin?rio pZP211 e os clones obtidos foram confirmados pelo padr?o de restri??o utilizando diferentes enzimas. Subsequentemente, estes cassetes foram transferidos para a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 e posteriormente transformado em plantas de S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) e MT-Rg1. Em adi??o, pl?ntulas foram submetidas a tratamentos hormonais utilizando uma auxina sint?tica (?cido &#61537;-naftaleno ac?tico) e com ciclosporina A (inibidor de ciclofilina) e foi constatado que no tratamento hormonal houve altera??es no padr?o de desenvolvimento das ra?zes laterais, provavelmente relacionada ao d?ficit na sinaliza??o da auxina ocasionada pela redu??o de LeCYP1 em plantas MT-dgt, enquanto que no tratamento com ciclosporina A, ocorreu um atraso no florescimento de plantas cv MT. Al?m disso, ensaios de PCR em tempo real (RT-qPCR) foram efetuados para an?lise de express?o dos cDNAs hom?logos a LeCYP1 e ARP de modo a caracterizarmos funcionalmente estas sequ?ncias em plantas de tomateiro.

O hábito de crescimento influencia o balanço entre o desenvolvimento vegetativo e o reprodutivo das plantas. Este, por sua vez, está diretamente vinculado a diversas variáveis de interesse agronômico, como produtividade e consumo de água. Em tomateiro, existem três hábitos de crescimento conhecidos: determinado, indeterminado e semi-determinado, sendo esse último na verdade determinado, porém com uma extensão do ciclo vegetativo. Cultivares de crescimento determinado são largamente utilizadas para produção de tomates destinados à indústria (molhos e ketchups), e as indeterminadas destinadas ao consumo in natura. Por outro lado, genótipos de crescimento semi-determinado, embora ainda sejam pouco explorados, apresentam-se como ótimas opções tanto para indústria quanto para o consumo in natura. Diante disto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a implicação do hábito de crescimento semi-determinado no desempenho produtivo e na eficiência no uso da água de plantas de tomateiro. Para tal, genótipos com diferentes hábitos de crescimento foram produzidos, por meio de introgressões de variações alélicas que afetam o hábito de crescimento das plantas, no background genético da cultivar miniatura de tomateiro Micro-Tom (MT). A caracterização desses genótipos demonstrou que os materiais de crescimento semideterminado apresentam um atraso no florescimento, emitindo em média uma folha a mais antes da formação da primeira inflorescência. Além disso, verificasse que essas plantas apresentam uma altura intermediária entre genótipos de crescimento determinado e indeterminado, aos 50 dias após a semeadura. Já para características agronômicas, constatou-se um aumento significativo na produtividade e no conteúdo de sólidos solúveis totais (brix) nos frutos dos genótipos de crescimento semi-determinado em comparação com o de crescimento determinado. Os dados sugerem que esse efeito seja resultante de um balanço mais equilibrado entre o desenvolvimento vegetativo e o reprodutivo, evidenciado pela ausência de diferença significativa na partição de massa seca oriunda do desenvolvimento vegetativo e do reprodutivo nesses genótipos, quando comparados aos genótipos de crescimento determinado e indeterminado. A eficiência no uso da água (EUA) foi avaliada tanto gravimetricamente (massa seca total produzida por quantidade de água transpirada), quanto através de discriminação isotópica. Os genótipos de crescimento semi-determinado apresentaram maior EUA do que os genótipos determinado e indeterminado aos 50 dias após a semeadura. Curiosamente, as plantas de crescimento semi-determinado mostraram-se mais resistentes, quando submetidas a um estresse de seca, que o genótipo de crescimento determinado utilizado como controle nas avaliações. Entretanto, são necessários estudos para elucidar o mecanismo envolvido nesta resistência. Em conclusão, os resultados aqui apresentados sugerem que os genótipos de crescimento semi-determinado atingiram o balanço ótimo entre desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, de forma a aumentar concomitantemente, produtividade, conteúdo de brix nos frutos, e eficiência no uso da água. / Growth habit influences the balance between vegetative and reproductive development of plants. This, in turn, is directly linked to several variables of agronomic interest, such as yield and water-use efficiency (WUE). In tomato, there are three growth habits: determinate, indeterminate and semi-determinate, the latter being actually determinate, but with an extension of the vegetative cycle. Cultivars of determinate growth are widely used for processing-tomato industry (sauces and ketchups), and indeterminate for in natura consumption (production to salads). On the other hand, semi-determinate growth genotypes, although are still poorly explored, they present an excellent option for both the industry and in natura consumption. Thus, the aim of the present study was to evaluate the implication of the semi-determinate growth habit in productive performance and in WUE of tomato plants. For this reason, genotypes with different growth habits were produced through introgression of allelic variations that affect the plants growth habit, in the genetic background of the tomato cultivar Micro-Tom (MT). The characterization of these genotypes showed that the semi-determinate growth materials exhibit a delay in flowering, producing on average one extra leaf before the first inflorescence formation. In addition, this architecture presents an intermediate height between determinate and indeterminate growth genotypes, 50 days after sowing. As for agronomic traits, we found a significant increase in yield and total soluble solids content (brix) in the fruits of semi-determinate growth genotypes compared with determinate growth. Our data suggest this effect is resulting from a more balanced vegetative and reproductive development, evidenced by the absence of significant difference on the dry matter partition derived from the vegetative and reproductive development in these genotypes, when compared to determinate and indeterminate growth genotypes. WUE was evaluated both gravimetrically (dry mass produced per amount of water transpired), and through isotopic discrimination. The semideterminate growth genotypes showed higher WUE than determinate and indeterminate genotypes at 50 days after sowing. Interestingly, the plants of semideterminate growth were more resistant than determinate growth genotype used as control, when exposed to drought stress. However, studies are needed to elucidate the mechanism involved in this resistance. In conclusion, the results presented here suggest that the genotypes of semi-determinate growth reached the optimal balance between vegetative and reproductive development, in order to increase concomitantly, productivity, brix content in the fruits, and WUE.

O emprego de novas tecnologias, como a transgenia, associadas ao melhoramento convencional de cana-de-açúcar apresenta grande potencial no combate a pragas e desenvolvimento de novas variedades. Entretanto, a falta de especificidade na expressão temporal e/ou local dos genes introduzidos tem se mostrado um fator limitante para o sucesso de produtos derivados da transgenia. Os promotores das metalotioneínas, por exemplo, podem representar uma alternativa ao uso de promotores constitutivos, particularmente, aqueles de metalotioneínas do tipo 1 (MT1) por apresentarem níveis elevados de expressão, em diferentes tecidos/órgãos e serem responsivos a estresses bióticos e abióticos. O uso de promotores sintéticos, contendo apenas elementos-cis, como GCG-like, W boxes e JERE, tem sido relevante por induzirem a expressão gênica local em resposta ao ataque de agentes bióticos. Este trabalho teve por objetivo a caracterização funcional de promotores de genes de metalotioneínas de cana-de-açúcar e o uso de elementos regulatórios sintéticos e, em paralelo, avaliou-se o uso de promotores sintéticos no controle da expressão gênica em cana-de-açúcar. Após as análises de expressão transiente, verificou-se que o promotor SoMT1b apresentou atividade GUS e GFP em epitélios de cebola e os promotores sintéticos, 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE e 4xW 4xS-box, e o promotor SoMT1b foram capazes de dirigir a expressão do gene repórter uidA (GUS) em calos embriogênicos de cana-de-açúcar. Em análise de expressão estável, o promotor SoMT1b foi capaz de dirigir a expressão do gene GUS para os frutos e sementes de tomate \'Micro-Tom\', mas não foi responsivo a estresse por herbivoria, cádmio e cobre. Também foi realizada a transformação de plantas de cana-de-açúcar, as quais ainda estão sendo analisadas. Os resultados obtidos demonstram a funcionalidade do promotor SoMT1b / New technologies, like genetic transformation, associated with conventional breeding of sugarcane have a large potential in developing new varieties tolerant to biotic and abiotic stress. However, the lack of specificity in the spatial and/or temporal expression of the introduced genes has been a limited factor for the success of products derived from transgeny. Metallothionein promoters, for instance, can represent an alternative to the use of constitutive promoters, particularly those from metallothionein type 1 (MT1) because they present high expression levels in different tissues / organs and are responsive to biotic and abiotic stress. Another alternative is the use of synthetic promoters which contain only cis elements, as GCG-like, W-box and JERE, which induces local gene expression in response to pathogen attack. In this work, we aimed to make the functional characterization of sugarcane metallothionein promoters and synthetic regulatory elements, in parallel, we evaluated the use of synthetic promoters in the control of gene expression in sugarcane. After transient expression analyzis, it was found that SoMT1b promoter was able to control the expression of the reporter genes to GUS and GFP in onion epithelium and GUS in sugarcane embryogenic calli. Additionally, synthetic promoters 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE and 4xW 4xS-box were able to direct the expression of the gene uidA (GUS) in embryogenic calli of sugarcane. In stable transformation analysis, SoMT1b promoter was capable of directing uidA expression in fruits and seeds of tomato cv. \'Micro-Tom\', but it was not responsive to herbivory, cadmium and copper stress. It was also carried out the transformation of sugarcane plants with the construction containing the SoMT1b promoter, but these are still being analyzed. The results demonstrate the functionality of the SoMT1b promoter in sugarcane and tomato

As espécies selvagens relacionadas ao tomateiro desenvolveram-se em uma ampla gama de latitudes que compreende o sul do Equador ao norte do Chile, ocupando diferentes habitats e constituindo uma fonte de diversidade genética natural. Essa diversidade tem sido utilizada no melhoramento de tomateiro, sobretudo para introgressão de genes de resistência a patógenos e mais recentemente de genes afetando a qualidade dos frutos. Embora a variação genética natural tenha a relevância de algo que foi selecionado na natureza e que pode ter implicações evolutivas, ela ainda é pouco explorada em estudos básicos. Para o uso intensivo desse recurso é necessário lançar mão de cruzamentos e retrocruzamentos em larga escala entre as espécies selvagens e o tomateiro cultivado (Solanum lycopersicum). Para tanto, dispomos de uma cultivar miniatura de tomateiro, a cv Micro-Tom (MT), a qual pode crescer nas mesmas condições requeridas para a planta modelo Arabidopsis thaliana. Com o uso da cv MT, podemos explorar de forma adequada a variação genética natural das espécies selvagens de tomateiro, sendo que a identificação de alterações fenotípicas é muito mais evidente quando podemos visualizar a planta como um todo. Dessa forma, vários alelos ainda não conhecidos foram resgatados dessas espécies, os quais levam a fenótipos distintos daqueles encontrados nos parentais, tais como frutos cor rosa-salmão vindo de S. neorickii, frutos de superfície opaca vindo de S. chmielewskii e frutos de coloração verde escuro vindo de S. galapagense. Esse modelo parece ser de especial importância para isolar genes de efeito maior. Assim, isolamos um locus vindo de S. pimpinellifolium que aumenta o número de flores por inflorescência da cv MT de 7 para 11. Sendo o tomateiro uma planta cultivada, os alelos oriundos das espécies selvagens, além de úteis para estudos genéticos e fisiológicos, podem ser aproveitados em programas de pré-melhoramento. / Tomato wild species evolved in a wide range of latitudes, from the south of Ecuador to the north of Chile, which comprise different habitats and are a source of natural genetic variation. This diversity is commonly used in tomato breeding, especially for the introgression of genes for resistance to pathogens and, recently, for fruit quality. Although natural genetic variation usually has an adaptive significance, which means that it may have evolutionary implications, it is still poorly explored in basic research. For the intensive utilization of this resource, it is necessary to perform large scale crosses and backcrosses between wild species and cultivated tomato. Aiming to this purpose, we used the miniature tomato cultivar, cv Micro-Tom (MT), which can growth in the same minimum requirements of the Arabidopsis thaliana model. Using MT one can adequately explore the natural genetic variation of wild species with less time and space requirements. In addiction, phenotypical alterations are more evident in MT, since one can easily visualize the whole plant. Thus, alleles hitherto unknown were isolated from tomato wild related species, leading to distinct phenotypes, such as pink-salmon fruits from S. neorickii, opaque fruit surface from S. chmielewskii and dark green fruits from S. galapagense. The MT model seems to be particularly adequate for the isolation of major genes and QTLs of great effects. Thereby, we had isolated a S. pimpinellifolium locus that increases the number of flowers per inflorescence, from 7 to 11, in MT. Being the tomato a cultivated plant, the alleles obtained in the wild species, besides to be useful for genetic and physiological studies, can be used in pre-breeding programs.

Micorrizas arbusculares (MAs) são simbioses mutualistas formadas entre fungos do solo e a maioria das plantas terrestres, principalmente angiospermas. Esta simbiose pode trazer uma série de benefícios para o hospedeiro vegetal, como uma maior absorção de fosfato, um aumento na tolerância ao estresse abiótico e biótico, e resistência a agentes patogênicos, resultando numa melhor adaptação ao meio. É possível que hormônios vegetais estejam envolvidos em eventos de sinalização entre fungos micorrízicos arbusculares e plantas hospedeiras, durante os processos de colonização das raízes e de desenvolvimento dos arbúsculos. Recentes estudos têm demonstrado que durante o estabelecimento da simbiose, ocorre uma reprogramação da expressão de um grande número de genes, e que essas alterações na expressão gênica podem estar associadas a alterações dos níveis de hormônios nas plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento de MAs em mutantes de tomateiro cv Micro-Tom (MT) insensível ao ácido jasmônico (jai1-1), superprodutor de etileno (epi) e duplo mutante epijai1 inoculados com Glomus clarum em condições de baixa concentração de fósforo no substrato, e a expressão de genes relacionadas à biossíntese do ácido jasmônico (AJ) (OPR3 e AOC) e do etileno (ET) (ACO4 e ACS2). O mutante jai1-1 não apresentou colonização intrarradicular e o acúmulo de transcritos tanto para a via de biossíntese do AJ como do ET foi relativamente menor do que o controle MT o que sugere a importância do AJ para o desenvolvimento da simbiose.O mutante epi e o duplo mutante apresentaram colonização intraradicular reduzida em relação ao controle MT. O acúmulo de transcritos dos genes da via do ET (ACO4 e ACS2) e do AJ (OPR3 e AOC) foi maior no mutante epi. A insensibilidade ao AJ presente no duplo mutante não impediu o acúmulo de transcritos para as vias de biossíntese do AJ e do ET, o que sugere uma relação sinérgica entre os hormônios vegetais no estabelecimento da simbiose. / Arbuscular mycorrhizal (AM) symbioses are formed between mutualistic soil fungi and most land plants, particularly angiosperms. This symbiosis can bring many benefits to the host plant, such as increased absorption of phosphate, an increase in tolerance to abiotic and biotic stress, and resistance to pathogens, resulting in better adaptation to the environment. Its possible that plant hormones are involved in signaling events between mycorrhizal fungi and host plants during the processes of colonization of roots and development of arbuscules. Recent studies have shown that during the establishment of symbiosis, there is a reprogramming of the expression of a large number of genes, and that these changes in gene expression may be associated with altered levels of hormones in plants. The aim of this study was to evaluate the development of MA in mutants of tomato cv Micro-Tom (MT) insensitive to jasmonic acid (jai1-1), ethylene overproducer (epi) and double mutant epijai1 inoculated with Glomus clarum under low phosphorus concentration in substrate, and the expression of genes related to biosynthesis of jasmonic acid (JA) (and OPR3 AOC) and ethylene (ET) (ACO4 and ACS2). Jai1-1 mutant showed no intraradical colonization and the accumulation of transcripts for both the biosynthesis of JA and ET was less than the control MT suggesting the importance of JA for the development of epi and double mutant symbiosis. The mutant epi and the double mutant showed reduced intraradical colonization when compared to the control MT. The transcript accumulation of the ET (ACO4 and ACS2) and JA (OPR3 and AOC) genes was higher in the mutant epi. The insensitivity to the JA in this double mutant did not prevent the accumulation of transcripts for the biosynthetic pathways of JA and ET, suggesting a synergistic relationship between plant hormones for the establishment of symbiosis.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito que a alteração na sensibilidade ou metabolismo hormonal em uma planta hospedeira poderia ter sobre o desenvolvimento de micorrizas arbusculares (MAs). Para tal, uma coleção de mutantes hormonais de tomateiro (Lycopersicon esculentum) introgredidos na cultivar miniatura Micro-Tom foi inoculada com o fungo Glomus clarum, em dos níveis de P no substrato. Foram realizados 3 experimentos, com os genótipos Never ripe (parcialmente insensível ao etileno), epinastic (superprodutor de etileno), bushy root (parcialmente insensível a citocinina), diageotropica (parcialmente insensível a auxina), procera (supersensível a giberelina) e notabilis (deficiente em ABA). Os parâmetros avaliados foram: porcentagem de colonização micorrízica, massa seca da parte aérea e massa seca da raiz em condições de P suficiente e insuficiente. Com os genótipos que apresentaram maiores alterações no desenvolvimento de MAs, Never ripe e epinastic , foram conduzidas análises morfológicas por meio de microscopia de luz, dosagem de P na parte aérea e estudos de expressão gênica através da técnica de PCR em tempo real (PCR Real-Time). Concluiu-se que, nas condições do presente trabalho, o grupo hormonal que mostrou a maior influencia sobre a formação de MAs foi o etileno, sendo que o seu efeito parece ser tanto estimulatório quanto inibitório. Contudo, os resultados de expressão de genes de defesa não permitem explicar as diferenças observadas. / The aim of the present work was to study the effect that alterations in hormonal sensitivity and metabolism in a host plant could have in the development of arbuscular mycorrhizae (AM). In this regard, a series of hormone-related mutants introgressed in the tomato (Lycopersicon esculentum) cultivar Micro-Tom were inoculated with the fungus Glomus clarum, in two different levels of substrate P. Three experiments were performed, using the genotypes Never ripe (partially insensitive to ethylene), epinastic (ethylene overproducer), bushy root (partially insensitive to cytokinin), diageotropica (partially insensitive to auxin), procera (gibberellin hypersensitive) and notabilis (ABA-deficient). The following parameters were assessed: mycorrhizal colonization percentage, shoot and root dry mass, under conditions of either sufficient or insufficient P on the substrate. Further analyses, such as root morphology, P dosage and gene expression quantification (through Real-Time PCR), were performed on the genotypes which presented the most alterations in mycorrhizal development, namely Never ripe and epinastic. It was concluded that the hormone showing most influence on AM formation was ethylene. Its effect appears to be either stimulatory o inhibitory. In any case, defense gene expression alone could account for the observed differences.

Micorrizas arbusculares (MAs) são simbioses mutualistas formadas entre fungos do solo e a maioria das plantas terrestres, principalmente angiospermas. Esta simbiose pode trazer uma série de benefícios para o hospedeiro vegetal, como uma maior absorção de fosfato, um aumento na tolerância ao estresse abiótico e biótico, e resistência a agentes patogênicos, resultando numa melhor adaptação ao meio. É possível que hormônios vegetais estejam envolvidos em eventos de sinalização entre fungos micorrízicos arbusculares e plantas hospedeiras, durante os processos de colonização das raízes e de desenvolvimento dos arbúsculos. Recentes estudos têm demonstrado que durante o estabelecimento da simbiose, ocorre uma reprogramação da expressão de um grande número de genes, e que essas alterações na expressão gênica podem estar associadas a alterações dos níveis de hormônios nas plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento de MAs em mutantes de tomateiro cv Micro-Tom (MT) insensível ao ácido jasmônico (jai1-1), superprodutor de etileno (epi) e duplo mutante epijai1 inoculados com Glomus clarum em condições de baixa concentração de fósforo no substrato, e a expressão de genes relacionadas à biossíntese do ácido jasmônico (AJ) (OPR3 e AOC) e do etileno (ET) (ACO4 e ACS2). O mutante jai1-1 não apresentou colonização intrarradicular e o acúmulo de transcritos tanto para a via de biossíntese do AJ como do ET foi relativamente menor do que o controle MT o que sugere a importância do AJ para o desenvolvimento da simbiose.O mutante epi e o duplo mutante apresentaram colonização intraradicular reduzida em relação ao controle MT. O acúmulo de transcritos dos genes da via do ET (ACO4 e ACS2) e do AJ (OPR3 e AOC) foi maior no mutante epi. A insensibilidade ao AJ presente no duplo mutante não impediu o acúmulo de transcritos para as vias de biossíntese do AJ e do ET, o que sugere uma relação sinérgica entre os hormônios vegetais no estabelecimento da simbiose. / Arbuscular mycorrhizal (AM) symbioses are formed between mutualistic soil fungi and most land plants, particularly angiosperms. This symbiosis can bring many benefits to the host plant, such as increased absorption of phosphate, an increase in tolerance to abiotic and biotic stress, and resistance to pathogens, resulting in better adaptation to the environment. Its possible that plant hormones are involved in signaling events between mycorrhizal fungi and host plants during the processes of colonization of roots and development of arbuscules. Recent studies have shown that during the establishment of symbiosis, there is a reprogramming of the expression of a large number of genes, and that these changes in gene expression may be associated with altered levels of hormones in plants. The aim of this study was to evaluate the development of MA in mutants of tomato cv Micro-Tom (MT) insensitive to jasmonic acid (jai1-1), ethylene overproducer (epi) and double mutant epijai1 inoculated with Glomus clarum under low phosphorus concentration in substrate, and the expression of genes related to biosynthesis of jasmonic acid (JA) (and OPR3 AOC) and ethylene (ET) (ACO4 and ACS2). Jai1-1 mutant showed no intraradical colonization and the accumulation of transcripts for both the biosynthesis of JA and ET was less than the control MT suggesting the importance of JA for the development of epi and double mutant symbiosis. The mutant epi and the double mutant showed reduced intraradical colonization when compared to the control MT. The transcript accumulation of the ET (ACO4 and ACS2) and JA (OPR3 and AOC) genes was higher in the mutant epi. The insensitivity to the JA in this double mutant did not prevent the accumulation of transcripts for the biosynthetic pathways of JA and ET, suggesting a synergistic relationship between plant hormones for the establishment of symbiosis.

A regeneração in vitro é bastante utilizada em processos biotecnológicos. No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos na aquisição de competência para formação de novos órgãos. Em tomateiro (S. lycopersicum), a alta capacidade de regeneração in vitro é atribuída ao alelo Rg1, vinda de Solanum peruvianum, e que está presente na cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). Os genes de nanismo da cv Micro-Tom (MT) foram passados para MsK, obtendo-se, após 8 gerações de autofecundação (F8), a cv Micro-MsK. No presente estudo, após 6 gerações de retrocruzamentos (BC6Fn), criou-se MT-Rg1, com Rg1 isogênico a MT. Testes de regeneração in vitro mostraram que a formação de gemas caulinares adventícias para MT-Rg1 e Micro-MsK são equivalentes, evidenciando que a alta capacidade de regeneração de Micro-MsK é basicamente devido ao Rg1. Plantas MTRg1 apresentam freqüente formação de 3 cotilédones, excesso de ramificações caulinares e senescência atrasada, características ausentes nos parentais. Esses efeitos pleiotrópicos de Rg1 coincidem com aqueles descritos para alterações no hormônio citocinina. Testes de sensibilidade à citocinina e de tempo de senescência realizados por nós, bem como dosagem desse hormônio feita por outras equipes, descartaram essa hipótese. Enxertias recíprocas evidenciaram que a promoção da ramificação caulinar por Rg1 não é um sinal translocável, mas parece ser uma característica intrínseca do tecido. Rg1 também promoveu uma maior formação de raízes adventícias em estacas ex vitro, sugerindo que ele afeta o processo de competência para formação de órgãos em geral, e não somente a indução específica de gemas caulinares. Duplos mutantes entre Rg1 e mutantes com alteração na sensibilidade/metabolismo hormonal (dgt, brt e pro), ausência de ramificações caulinares (ls) e senescência acelerada (l) foram obtidos e testados quanto ao padrão de ramificações e à capacidade de regeneração in vitro. Além desses parâmetros, a presença de Rg1 suprimiu o fenótipo de folhas pouco recortadas do mutante hipersensível a giberelina (pro) e recuperou o sistema radicular pouco desenvolvido do mutante com baixa sensibilidade à auxina (dgt). Rg1 também foi capaz de reverter a ausência de ramificações laterais de ls, sendo que a mutação Me, o qual representa uma superexpressão de um gene do tipo KNOX, não foi capaz. Esse resultado sugere que Rg1 não é um gene do tipo KNOX, embora esses genes sejam considerados os principais controladores da competência. Analisando diferentes tipos de explantes em experimentos independentes, contatou-se que, em geral, as mutações brt (baixa sensibilidade a citocinina), dgt e ls diminuíram a capacidade de regeneração de Rg1, enquanto l aumentou. Rg1 mostrou-se particularmente epistático à mutação pro, revertendo o fenótipo de baixa formação de gemas caulinares desse mutante. Surpreendentemente, Rg1 provou ser mais sensível à auxina em testes de alongamento de segmentos de hipocótilos, sendo capaz de reverter o fenótipo do mutante dgt nesse mesmo teste. Em conjunto, esses resultados confirmam o papel de Rg1 na fase de aquisição da competência e sugerem uma interação dos hormônios giberelina e auxina nesse processo. / The In vitro regeneration process is widely used in plant biotechnology. However, the mechanisms involved in the acquisition of competence for organ formation are hitherto unknown. In tomato (S. lycopersicum), the high capacity for in vitro regeneration is attributed to the Rg1 allele from S. peruvianum, which is present in the cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). The dwarfism genes of the cv Micro-Tom (MT) were transferred to MsK, and, after 8 generations of selfing (F8), the cv Micro-Msk was obtained. Here, after 6 generations of backcrosses (BC6Fn), we created the MT-Rg1, which has Rg1 isogenic to MT. Tests of in vitro regeneration showed that shoot formation in MT-Rg1 and Micro-MsK are equivalent, suggesting that the high capacity of regeneration of Micro-MsK is basically due to Rg1. Comparing MT-Rg1 with the control MT, we noticed a high frequency of 3 cotyledon formation, increased shoot branching and late senescence, which are absent in the parentals. These pleiotropic effects of Rg1 coincide with those described for plants with alterations in the hormone cytokinin. Tests of sensitivity for cytokinin and senescence behavior carried out by us, as well as dosage of that hormone made by other researches, discarded that hypothesis. Reciprocal grafting showed that the promotion of shoot branching by Rg1 is not a transmissible signal, but seems to be an inherent characteristic of the tissue. Rg1 also increases adventitious roots formation of ex vitro cuttings, suggesting that it affects the process of competence, which is common for shoots and roots, instead of the specific induction of shoots. Double mutants between Rg1 and mutants with alteration in the sensitivity/metabolism of plant hormones (dgt, brt and pro), as well as mutants with absence of shoot branching (ls) and accelerated senescence (l) were obtained and tested for the capacity of in vitro regeneration. The presence of Rg1 suppressed the phenotype of less dissected leaves of the mutant hypersensitive to gibberrellin (pro) and rescued the phenotype of poor developed root system of the mutant with low auxin sensitivity (dgt). Rg1 was also able to revert the absence of axillary shoot formation in ls, whereas the mutant Me, which represents an over expression of a KNOX gene was not. This result suggests that Rg1 is not a KNOX gene, although those genes are considered the main controllers of the competence. Analyzing different types of explants in independent experiments, it was verified that, in general, the mutations brt (low sensibility to cytokinin), dgt and ls decreased the regeneration capacity of Rg1, while l increased it. Rg1 was particularly epistatic to the pro mutation, reverting the phenotype of little shoot formation of that mutant. Surprisingly, Rg1 proved to be more sensitive to auxin in the hypocotyl segment elongation test, being able to revert the phenotype of the mutant dgt in the same test. Together, these results confirm the role of the Rg1 in the process of acquisition of the competence and suggest an interaction of the hormones gibberellin and auxin in this process.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito que a alteração na sensibilidade ou metabolismo hormonal em uma planta hospedeira poderia ter sobre o desenvolvimento de micorrizas arbusculares (MAs). Para tal, uma coleção de mutantes hormonais de tomateiro (Lycopersicon esculentum) introgredidos na cultivar miniatura Micro-Tom foi inoculada com o fungo Glomus clarum, em dos níveis de P no substrato. Foram realizados 3 experimentos, com os genótipos Never ripe (parcialmente insensível ao etileno), epinastic (superprodutor de etileno), bushy root (parcialmente insensível a citocinina), diageotropica (parcialmente insensível a auxina), procera (supersensível a giberelina) e notabilis (deficiente em ABA). Os parâmetros avaliados foram: porcentagem de colonização micorrízica, massa seca da parte aérea e massa seca da raiz em condições de P suficiente e insuficiente. Com os genótipos que apresentaram maiores alterações no desenvolvimento de MAs, Never ripe e epinastic , foram conduzidas análises morfológicas por meio de microscopia de luz, dosagem de P na parte aérea e estudos de expressão gênica através da técnica de PCR em tempo real (PCR Real-Time). Concluiu-se que, nas condições do presente trabalho, o grupo hormonal que mostrou a maior influencia sobre a formação de MAs foi o etileno, sendo que o seu efeito parece ser tanto estimulatório quanto inibitório. Contudo, os resultados de expressão de genes de defesa não permitem explicar as diferenças observadas. / The aim of the present work was to study the effect that alterations in hormonal sensitivity and metabolism in a host plant could have in the development of arbuscular mycorrhizae (AM). In this regard, a series of hormone-related mutants introgressed in the tomato (Lycopersicon esculentum) cultivar Micro-Tom were inoculated with the fungus Glomus clarum, in two different levels of substrate P. Three experiments were performed, using the genotypes Never ripe (partially insensitive to ethylene), epinastic (ethylene overproducer), bushy root (partially insensitive to cytokinin), diageotropica (partially insensitive to auxin), procera (gibberellin hypersensitive) and notabilis (ABA-deficient). The following parameters were assessed: mycorrhizal colonization percentage, shoot and root dry mass, under conditions of either sufficient or insufficient P on the substrate. Further analyses, such as root morphology, P dosage and gene expression quantification (through Real-Time PCR), were performed on the genotypes which presented the most alterations in mycorrhizal development, namely Never ripe and epinastic. It was concluded that the hormone showing most influence on AM formation was ethylene. Its effect appears to be either stimulatory o inhibitory. In any case, defense gene expression alone could account for the observed differences.

A regeneração in vitro é bastante utilizada em processos biotecnológicos. No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos na aquisição de competência para formação de novos órgãos. Em tomateiro (S. lycopersicum), a alta capacidade de regeneração in vitro é atribuída ao alelo Rg1, vinda de Solanum peruvianum, e que está presente na cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). Os genes de nanismo da cv Micro-Tom (MT) foram passados para MsK, obtendo-se, após 8 gerações de autofecundação (F8), a cv Micro-MsK. No presente estudo, após 6 gerações de retrocruzamentos (BC6Fn), criou-se MT-Rg1, com Rg1 isogênico a MT. Testes de regeneração in vitro mostraram que a formação de gemas caulinares adventícias para MT-Rg1 e Micro-MsK são equivalentes, evidenciando que a alta capacidade de regeneração de Micro-MsK é basicamente devido ao Rg1. Plantas MTRg1 apresentam freqüente formação de 3 cotilédones, excesso de ramificações caulinares e senescência atrasada, características ausentes nos parentais. Esses efeitos pleiotrópicos de Rg1 coincidem com aqueles descritos para alterações no hormônio citocinina. Testes de sensibilidade à citocinina e de tempo de senescência realizados por nós, bem como dosagem desse hormônio feita por outras equipes, descartaram essa hipótese. Enxertias recíprocas evidenciaram que a promoção da ramificação caulinar por Rg1 não é um sinal translocável, mas parece ser uma característica intrínseca do tecido. Rg1 também promoveu uma maior formação de raízes adventícias em estacas ex vitro, sugerindo que ele afeta o processo de competência para formação de órgãos em geral, e não somente a indução específica de gemas caulinares. Duplos mutantes entre Rg1 e mutantes com alteração na sensibilidade/metabolismo hormonal (dgt, brt e pro), ausência de ramificações caulinares (ls) e senescência acelerada (l) foram obtidos e testados quanto ao padrão de ramificações e à capacidade de regeneração in vitro. Além desses parâmetros, a presença de Rg1 suprimiu o fenótipo de folhas pouco recortadas do mutante hipersensível a giberelina (pro) e recuperou o sistema radicular pouco desenvolvido do mutante com baixa sensibilidade à auxina (dgt). Rg1 também foi capaz de reverter a ausência de ramificações laterais de ls, sendo que a mutação Me, o qual representa uma superexpressão de um gene do tipo KNOX, não foi capaz. Esse resultado sugere que Rg1 não é um gene do tipo KNOX, embora esses genes sejam considerados os principais controladores da competência. Analisando diferentes tipos de explantes em experimentos independentes, contatou-se que, em geral, as mutações brt (baixa sensibilidade a citocinina), dgt e ls diminuíram a capacidade de regeneração de Rg1, enquanto l aumentou. Rg1 mostrou-se particularmente epistático à mutação pro, revertendo o fenótipo de baixa formação de gemas caulinares desse mutante. Surpreendentemente, Rg1 provou ser mais sensível à auxina em testes de alongamento de segmentos de hipocótilos, sendo capaz de reverter o fenótipo do mutante dgt nesse mesmo teste. Em conjunto, esses resultados confirmam o papel de Rg1 na fase de aquisição da competência e sugerem uma interação dos hormônios giberelina e auxina nesse processo. / The In vitro regeneration process is widely used in plant biotechnology. However, the mechanisms involved in the acquisition of competence for organ formation are hitherto unknown. In tomato (S. lycopersicum), the high capacity for in vitro regeneration is attributed to the Rg1 allele from S. peruvianum, which is present in the cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). The dwarfism genes of the cv Micro-Tom (MT) were transferred to MsK, and, after 8 generations of selfing (F8), the cv Micro-Msk was obtained. Here, after 6 generations of backcrosses (BC6Fn), we created the MT-Rg1, which has Rg1 isogenic to MT. Tests of in vitro regeneration showed that shoot formation in MT-Rg1 and Micro-MsK are equivalent, suggesting that the high capacity of regeneration of Micro-MsK is basically due to Rg1. Comparing MT-Rg1 with the control MT, we noticed a high frequency of 3 cotyledon formation, increased shoot branching and late senescence, which are absent in the parentals. These pleiotropic effects of Rg1 coincide with those described for plants with alterations in the hormone cytokinin. Tests of sensitivity for cytokinin and senescence behavior carried out by us, as well as dosage of that hormone made by other researches, discarded that hypothesis. Reciprocal grafting showed that the promotion of shoot branching by Rg1 is not a transmissible signal, but seems to be an inherent characteristic of the tissue. Rg1 also increases adventitious roots formation of ex vitro cuttings, suggesting that it affects the process of competence, which is common for shoots and roots, instead of the specific induction of shoots. Double mutants between Rg1 and mutants with alteration in the sensitivity/metabolism of plant hormones (dgt, brt and pro), as well as mutants with absence of shoot branching (ls) and accelerated senescence (l) were obtained and tested for the capacity of in vitro regeneration. The presence of Rg1 suppressed the phenotype of less dissected leaves of the mutant hypersensitive to gibberrellin (pro) and rescued the phenotype of poor developed root system of the mutant with low auxin sensitivity (dgt). Rg1 was also able to revert the absence of axillary shoot formation in ls, whereas the mutant Me, which represents an over expression of a KNOX gene was not. This result suggests that Rg1 is not a KNOX gene, although those genes are considered the main controllers of the competence. Analyzing different types of explants in independent experiments, it was verified that, in general, the mutations brt (low sensibility to cytokinin), dgt and ls decreased the regeneration capacity of Rg1, while l increased it. Rg1 was particularly epistatic to the pro mutation, reverting the phenotype of little shoot formation of that mutant. Surprisingly, Rg1 proved to be more sensitive to auxin in the hypocotyl segment elongation test, being able to revert the phenotype of the mutant dgt in the same test. Together, these results confirm the role of the Rg1 in the process of acquisition of the competence and suggest an interaction of the hormones gibberellin and auxin in this process.