Cette thèse est consacrée à l’étude d’une technique innovante de lyse de microorganismes, fondée sur l’utilisation d’impulsions haute tension en milieu aqueux. Cette technique se distingue de l’électroporation qui exploite le champ électrique produit pour dégrader la membrane cellulaire ; dans notre étude les impulsions haute tension permettent la formation d’arcs électriques produisant de multiples phénomènes physico-chimiques qui peuvent entraîner la lyse des microorganismes.L’efficacité du procédé a été évalué sur les microorganismes suivants : des microalgues productrices d’huile (Nannochloropsis gaditana et Phaeodactylum tricornutum) et des bactéries couramment utilisées comme modèles de laboratoire (Escherishia coli et Bacillus subtilis). Dans ces travaux, nous avons montré que les ondes de pression produites sont principalement responsables de la lyse.En fin d’étude, des perspectives sont explorées en vue du développement de systèmes autonomes soit dans le cadre de la bioproduction, soit dans le cadre de l’analyse cellulaire. / This thesis focuses on the study of an innovative technology for microorganisms lysis, based on high voltage pulses generated in an aqueous medium. This technology is different from electroporation which operates thanks to the electric field for damaging cell membranes ; in our study high voltage pulses generate an electric arc leading to various physicochemical phenomena supposed to lyse microorganisms.The technology efficiency is evaluated with the following microorganims : some lipid producting microalgae (Nannochloropsis gaditana and Phaeodactylum tricornutum) and classical laboratory model bacteria (Escherishia coli and Bacillus subtilis). In this work, we found that generated shock waves are mainly responsible of the cells lysis.At the end, the development of self-functioning devices is investigated either for bioproduction or for cell analysis.

Les micro-organismes jouent un rôle crucial dans les processus écosystémiques. L'étude de la distribution spatio-temporelle des communautés microbiennes est donc nécessaire, particulièrement dans un contexte de changements globaux. Les micro-organismes étant très diversifiés et majoritairement non cultivables, l'étude de leur diversité et des facteurs responsables de l'assemblage des communautés nécessite des outils adaptés. Les écosystèmes alpins montrent de forts gradients mésotopographiques et de régimes d'enneigements. Ces gradients engendrent une hétérogénéité spatiale du couvert végétal et des processus écosystémiques à des échelles réduites. Les contrastes de l'étage alpin s'appliquent aussi dans le temps, ceux-ci étant soumis à des froids intenses en hiver. Ces écosystèmes sont donc un modèle de choix pour l'étude des patrons spatio-temporels de la microflore du sol. Ce travail s'est d'abord concentré sur l'optimisation d'une technique d'empreinte moléculaire, la CESSCP, mais aussi d'outils statistiques pour l'analyse de séquences d'ADN. Les communautés bactériennes, fongiques et crenarchaeotes du sol ont été suivies deux années, par CE-SSCP et clonage/séquençage, dans deux habitats contrastés par leurs régimes d'enneigements. Cette étude a ensuite été étendue à l'échelle du paysage, sous divers couverts végétaux. Ce travail montre que l'assemblage des communautés microbiennes alpines varie au cours des saisons et que l'hiver constituent un fort évènement sélectif. Cette étude montre également que les communautés microbiennes sont spatialement distribuées en fonction des régimes d'enneigements et de la végétation. Les facteurs directement responsables de tels patrons sont discutés.

La mise en œuvre des hautes pressions permet d'inactiver des micro-organismes contaminants (levures, bactéries, spores, virus...) au sein de divers milieux. Cette technologie a tout d'abord été utilisée puis développée à l'échelle industrielle pour décontaminer des produits alimentaires. Du fait de la faible énergie générée par les hautes pressions, seules les liaisons faibles et correspondant à une valeur de ?V négative sont altérées, ce qui, en outre, ouvrait la voie à de nombreuses applications biologiques. L'objectif de cette thèse était d'inactiver l'ensemble des micro-organismes pathogènes au sein d'un produit sanguin : le plasma. L'enjeu principal était d'une part de sauvegarder la fonctionnalité des principales protéines contenues dans le plasma (facteurs de coagulation notamment) et d'autre part d'inactiver les micro-organismes contaminants. Afin d'atteindre cet équilibre, plusieurs paramètres ont été utilisés : - la valeur de la pression (de 100 à 300 MPa), - la durée du traitement, - les températures négatives... Plusieurs résultats originaux seront présentés, notamment en ce qui concerne la différence de sensibilité aux hautes pressions des protéines d'une part et l'inactivation de micro-organismes d'autre part.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [130]-146. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

La mise en œuvre des hautes pressions permet d'inactiver des micro-organismes contaminants (levures, bactéries, spores, virus…) au sein de divers milieux. Cette technologie a tout d'abord été utilisée puis développée à l'échelle industrielle pour décontaminer des produits alimentaires. Du fait de la faible énergie générée par les hautes pressions, seules les liaisons faibles et correspondant à une valeur de ?V négative sont altérées, ce qui, en outre, ouvrait la voie à de nombreuses applications biologiques. L'objectif de cette thèse était d'inactiver l'ensemble des micro-organismes pathogènes au sein d'un produit sanguin : le plasma. L’enjeu principal était d'une part de sauvegarder la fonctionnalité des principales protéines contenues dans le plasma (facteurs de coagulation notamment) et d'autre part d'inactiver les micro-organismes contaminants. Afin d’atteindre cet équilibre, plusieurs paramètres ont été utilisés : - la valeur de la pression (de 100 à 300 MPa), - la durée du traitement, - les températures négatives… Plusieurs résultats originaux seront présentés, notamment en ce qui concerne la différence de sensibilité aux hautes pressions des protéines d'une part et l'inactivation de micro-organismes d'autre part. / High hydrostatic pressure (HHP) has shown its capacity to inactivate contaminating micro-organisms (yeasts, bacteria, spores, viruses…) present in various media. This technology has been first used and developed to an industrial scale for the food industry. Because of the low energy raised using high pressure, only weak interactions characterized by a negative ?V will be altered. This statement opens the way to numerous applications in the biology field. The objective of this PhD work was to inactivate all the pathogens that may contaminate blood products, and blood plasma in particular. The main challenge was to inactivate the contaminating micro-organisms while maintaining the activity of the plasma proteins (such as blood coagulation factors). To achieve this balance, several parameters were used: - the pressure value (from 100 to 300 MPa), - the treatment duration, - negative temperatures… Some original results will be presented, concerning differences in the high pressure sensitivity of proteins and the inactivation of pathogens.

Le sol constitue le milieu naturel contenant la plus grande diversité de micro-organismes (typiquement 109 cellules de 104 espèces différentes par gramme de terre). Pourtant il n’est possible d’obtenir la croissance que d’une fraction en laboratoire (moins de 5 %). Réaliser des cultures de cette diversité, inaccessible pour le moment, aurait des applications considérables en agriculture (création d’engrais ou pesticide biologique et respectueux de l’environnement) et en pharmacologie (découverte d’antibiotiques ou anticancéreux). Ce travail de thèse est principalement axé sur l’étude de la croissance de micro-organismes difficiles à cultiver issus d’échantillons naturels tels que les sols. Des gouttes de tailles micrométriques, créées par microfluidique digitale, sont utilisés comme microréacteurs afin d’obtenir la croissance en laboratoire des espèces microbiennes encapsulées à l’intérieur. Une première étape consiste à obtenir une solution ne contenant que les microbes provenant de notre échantillon naturel de sol pour pouvoir réaliser l’encapsulation sans matières minérales et obtenir une diversité la plus proche possible de celle du sol. Une deuxième étape consiste à encapsuler les cellules contenues dans notre solution en faisant varier certaines conditions comme : la concentration initiale de microbes, le milieu de culture ou le temps d’incubation. Par l’observation des gouttes après croissance et séquençage des gènes ARNr 16S des cellules contenues à l’intérieur nous démontrons qu’il est possible d’obtenir la croissance de jusqu’à 40 % des espèces. Cette méthode microfluidique ouvre la voie du criblage à haut débit des interactions entre une espèce donnée (pathogène humain ou de plante, phage/virus) avec le microbiote qu’il est susceptible de contaminer (flore intestinal, sols, mers …) et ainsi déterminer quantitativement la réaction du milieu étudié, en plus de son utilisation pour la croissance d’espèces difficilement cultivables en laboratoire. / Soil is the natural medium containing the highest microbial diversity (109 cells from 104 different species per gram of soil). Yet we still can’t grow in laboratory more than 5 % of them. Having access to this diversity will lead to crucial applications for farming (production of organic fertilizers or environmentally friendly pesticides) and to pharmacology (discovery of new antibiotics or new anticancer molecules). This work focuses on the study of growth of non culturable micro-organisms from natural samples, like soil. This method uses microfluidics droplets as microreactors to obtain the growth of microbial species encapsulated inside. The first step is to achieve a solution with nothing but the microbes from our natural sample (no minerals) for a successful encapsulation and obtain diversity as close to the one found in the soil. The second step is to encapsulate the cells from this solution with different set of condition like : initial concentration, growth media and incubation time. By coupling observation of the droplets after growth and the rRNA 16S sequencing of their content we demonstrate that it is possible to obtain the growth of up to 40 % of the species. This microfluidic method, besides its use in growing unculturable species in laboratory, opens the way towards high-throughput screening of interactions between a given species (human or plant pathogens, phage/virus) and the microbiota it is likely to contaminate (gut flora, soil, sea …) and obtain the quantitative determination the reaction of microbiota.

La vallée de Stuckberry a été touchée par une importante variabilité climatique au cours de l'Holocène et constitue actuellement un environnement en transition rapide en raison de la hausse des températures. Le retrait du glacier principal de la vallée a entraîné la formation de quatre lacs, où l'âge de chaque lac est proportionnel à la distance de l'océan Arctique. Les sédiments des lacs représentent un trésor d'informations sur les changements passés dans le bassin versant de la vallée de Stuckberry et fournissent une « mémoire à long terme » de la façon dont les lacs ont réagi à ces changements. L'objectif spécifique de l'étude est de caractériser les changements au fil du temps dans la structure des communautés microbiennes. Pour ce faire, l'ADN a été extrait à partir de couches de sédiments et la technologie de séquençage d'amplicons du gène de l'ARNr 16S a été utilisée pour la fraction bactérienne et archéenne et la technologie métagénomique shotgun a été utilisée dans quelques couches ciblées pour la fraction virale. Des analyses bio-informatiques et statistiques ont ensuite été effectuées pour réaliser l'affiliation taxonomique et les comparaisons de la diversité microbienne des couches des carottes de sédiments des lacs, l'hypothèse étant que la diversité microbienne varierait avec le temps et que cette dynamique reflèterait les changements environnementaux passés dans le bassin versant. Les résultats obtenus dans cette recherche nous permettent de conclure qu'il y a bien des changements au niveau des structures des communautés microbiennes au fil du temps qui semblent être influencées par les changements environnementaux subits par la vallée de Stuckberry et les variances entre les lacs semblent être dues à leur composition physico-chimique respective et à leur temps d'évolution différent. Ce travail contribue à de nouvelles connaissances sur les forces à l'origine des changements épisodiques et interannuels des communautés microbiennes. / Stuckberry Valley experienced significant climatic variability during the Holocene and is currently an environment in rapid transition due to rising temperatures. The retreat of the main glacier from the valley resulted in the formation of four lakes, where the age of each lake is proportional to its elevation above the Arctic Ocean. The sediments from these lakes represent a treasure trove of information about past changes in the Stuckberry Valley watershed and provide a "long-term memory" of how the lakes responded to these changes. The specific objective of the study is to characterize changes over time in the structure of microbial communities. To do this, DNA was extracted from discrete sediment layers followed by 16S rRNA gene amplicon sequencing for the bacterial and archaeal fractions and shotgun sequencing of a few targeted layers to characterize viruses. Bioinformatics and statistical analyses were then performed to determine taxonomic affiliations and to compare the microbial diversity of the sediment core layers of the four lakes, based on the hypothesis that the microbial diversity would vary over time and that this dynamic reflected past environmental changes in the watershed. Our results suggest that the structure of the microbial community over time was influenced by environmental changes in Stuckberry Valley, while the variation between lakes appears to result from their respective physico-chemical composition and their different ages. This work gives new insight into the forces behind episodic and interannual changes in microbial communities.

Les norovirus sont maintenant reconnus mondialement comme étant la cause majeure de maladies d'origine alimentaire. Deux causes majeures expliqueraient la recrudescence des cas d'empoisonnements alimentaires d'origine virale: leur très grande stabilité dans l'environnement facilitant ainsi leur transfert et leur résistance à la majorité des approches de lutte contre les microorganismes pathogènes tels que la désinfection chimique. L'objectif général de ce projet était d'étudier et de caractériser le phénomène d'attachement des norovirus humain et murin aux surfaces inertes en fonction des différents paramètres physico-chimiques (pH et humidité relative) et d'évaluer l'impact de ce phénomène sur la sensibilité des norovirus aux désinfectants chimiques domestiques. Les résultats obtenus ont démontré un meilleur attachement à pH acide ou neutre peu importe l'humidité relative. On a d'ailleurs observé un attachement moindre lorsque le norovirus murin était sous des conditions de pH 9 et de faible humidité relative comparativement au norovirus humain où aucune différence n'a été observée selon les différentes conditions. Pour les deux virus, un attachement maximal a été observé après un temps de contact de 10 minutes. L'évaluation de la sensibilité des norovirus aux différents désinfectants chimiques a montré une plus grande sensibilité aux composés chlorés avec une réduction virale supérieure à 3 log comparativement aux alcools ou aux ammoniums quaternaires qui n'ont permis qu'une faible réduction généralement inférieure à 1 log. On a également noté que le norovirus murin est généralement plus sensible que le norovirus humain.

Le parasite Leishmania est l'agent étiologique des leishmanioses, maladies négligées qui affectent les régions les plus pauvres de la planète (Inde, Soudan, Iran, Bengladesh, Amérique du Sud) et figurent parmi les priorités de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Chaque année, 1.5 million à 2 millions d'individus sont infectés et on dénombre entre 80 000 etl50 000 décès par année. En l'absence de vaccin, le traitement des leishmanioses repose sur une chimiothérapie relativement limitée. Les traitements à base d'antimoine demeurent en première ligne de l'arsenal thérapeutique dans les pays endémiques. Près de 70 ans après le début de leur utilisation, leur mécanisme d'action reste mal connu. A ceci s'ajoute une toxicité élevée et une résistance qui prend des proportions endémiques dans certaines régions. Les traitements alternatifs, composés principalement de l'amphotéricine B, de la miltéfosine et de la paromomycine, sont soit extrêmement onéreux pour les régions les plus touchées ou encore sont associés à une toxicité élevée. Dans ce contexte, la nécessité d'approfondir les recherches sur ce parasite est évidente, dans l'objectif de mieux comprendre sa biologie et d'éventuellement définir des nouveaux moyens de lutte. Trois objectifs de recherche ont été définis au cours de mon doctorat et sont présentés dans cette thèse : les deux premiers objectifs concernaient les rôles éventuels de la ptéridine reductase PTR1 et des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs et dans la métacyclogénèse du parasite. Le métabolisme des ptérines est relativement peu connu et le rôle de ces composés reste mystérieux. La métacyclogénèse, processus par lequel le parasite acquiert sa forme infectieuse, est également peu comprise. Les ptérines réduites étant connues chez d'autres organismes pour leur propriété anti-oxydante et ayant été associées à la métacyclogénèse du parasite, nous avons souhaité mieux définir leur rôle dans ces deux aspects essentiels de la biologie du parasite. Le troisième objectif était également relié au stress oxydatif, s'intéressait aux mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania et à l'acquisition de la résistance à ces drogues. Effectivement, plusieurs drogues connues pour induire l'apoptose induisent un stress oxydatif. Nous avons émis l'hypothèse qu'un mécanisme commun de mort cellulaire pouvait être induit par ces 11 drogues et que l'existence d'un tel mécanisme pouvait favoriser l'acquisition de multi-résistances chez les mutants résistants. Une étude du rôle des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs a ainsi montré que ces composés pouvaient être ajoutés à la liste des antioxydants dont dispose le parasite. En effet, nous avons montré que les ptérines réduites contribuaient à la survie du Leishmania lorsque celui-ci est soumis à des stress de nature oxydatifs ou nitrosatifs, tant exogène que cellulaire, c'est-à-dire générés par un macrophage activé. Les ptérines contribuent donc également à l'infectivité du parasite. Nous avons ainsi pu proposer un nouveau rôle pour ces composés. Une étude protéomique de la métacyclogénèse d'une souche de Leishmania sauvage et d'une souche inactivé pour le gène codant la ptéridine reductase PTR1 a permis l'identification de plus de 200 protéines différentiellement exprimées. La mise en évidence de l'augmentation du nombre de protéines différentiellement exprimées suggère indirectement l'implication de PTR1 ou des ptérines réduites dans ce processus de differentiation essentiel à la biologie du parasite. Par ailleurs, la variation de l'expression des protéines associées à la mobilité, à la résistance au stress oxydatif ou encore aux mécanismes d'expressions géniques suggère un rôle important de ses voies dans la métacyclogénèse. Enfin, une étude du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania a mis en évidence un modèle dichotomique de la mort induite par ces drogues. En effet, l'antimoine, la miltéfosine et l'amphotéricine B induisent la mort cellulaire programmée par apoptose avec une accumulation d'oxydants alors que la paramomycine et le methotrexate (drogue modèle) induisent la mort différemment. L'existence de mécanismes d'action communs, et notamment l'induction d'un stress oxydant, a également pour conséquence de faciliter, chez les mutants résistants, l'acquisition de multi-résistances dès lors que la drogue pour laquelle ils sont sélectionnés induit le même type de mort. Ces résultats présentent des conséquences importantes relativement aux mécanismes d'acquisition de la résistance et au développement des thérapies mti-Leishmania.