Cette thèse est consacrée à l’étude d’une technique innovante de lyse de microorganismes, fondée sur l’utilisation d’impulsions haute tension en milieu aqueux. Cette technique se distingue de l’électroporation qui exploite le champ électrique produit pour dégrader la membrane cellulaire ; dans notre étude les impulsions haute tension permettent la formation d’arcs électriques produisant de multiples phénomènes physico-chimiques qui peuvent entraîner la lyse des microorganismes.L’efficacité du procédé a été évalué sur les microorganismes suivants : des microalgues productrices d’huile (Nannochloropsis gaditana et Phaeodactylum tricornutum) et des bactéries couramment utilisées comme modèles de laboratoire (Escherishia coli et Bacillus subtilis). Dans ces travaux, nous avons montré que les ondes de pression produites sont principalement responsables de la lyse.En fin d’étude, des perspectives sont explorées en vue du développement de systèmes autonomes soit dans le cadre de la bioproduction, soit dans le cadre de l’analyse cellulaire. / This thesis focuses on the study of an innovative technology for microorganisms lysis, based on high voltage pulses generated in an aqueous medium. This technology is different from electroporation which operates thanks to the electric field for damaging cell membranes ; in our study high voltage pulses generate an electric arc leading to various physicochemical phenomena supposed to lyse microorganisms.The technology efficiency is evaluated with the following microorganims : some lipid producting microalgae (Nannochloropsis gaditana and Phaeodactylum tricornutum) and classical laboratory model bacteria (Escherishia coli and Bacillus subtilis). In this work, we found that generated shock waves are mainly responsible of the cells lysis.At the end, the development of self-functioning devices is investigated either for bioproduction or for cell analysis.

Les micro-organismes jouent un rôle crucial dans les processus écosystémiques. L'étude de la distribution spatio-temporelle des communautés microbiennes est donc nécessaire, particulièrement dans un contexte de changements globaux. Les micro-organismes étant très diversifiés et majoritairement non cultivables, l'étude de leur diversité et des facteurs responsables de l'assemblage des communautés nécessite des outils adaptés. Les écosystèmes alpins montrent de forts gradients mésotopographiques et de régimes d'enneigements. Ces gradients engendrent une hétérogénéité spatiale du couvert végétal et des processus écosystémiques à des échelles réduites. Les contrastes de l'étage alpin s'appliquent aussi dans le temps, ceux-ci étant soumis à des froids intenses en hiver. Ces écosystèmes sont donc un modèle de choix pour l'étude des patrons spatio-temporels de la microflore du sol. Ce travail s'est d'abord concentré sur l'optimisation d'une technique d'empreinte moléculaire, la CESSCP, mais aussi d'outils statistiques pour l'analyse de séquences d'ADN. Les communautés bactériennes, fongiques et crenarchaeotes du sol ont été suivies deux années, par CE-SSCP et clonage/séquençage, dans deux habitats contrastés par leurs régimes d'enneigements. Cette étude a ensuite été étendue à l'échelle du paysage, sous divers couverts végétaux. Ce travail montre que l'assemblage des communautés microbiennes alpines varie au cours des saisons et que l'hiver constituent un fort évènement sélectif. Cette étude montre également que les communautés microbiennes sont spatialement distribuées en fonction des régimes d'enneigements et de la végétation. Les facteurs directement responsables de tels patrons sont discutés.

La mise en œuvre des hautes pressions permet d'inactiver des micro-organismes contaminants (levures, bactéries, spores, virus...) au sein de divers milieux. Cette technologie a tout d'abord été utilisée puis développée à l'échelle industrielle pour décontaminer des produits alimentaires. Du fait de la faible énergie générée par les hautes pressions, seules les liaisons faibles et correspondant à une valeur de ?V négative sont altérées, ce qui, en outre, ouvrait la voie à de nombreuses applications biologiques. L'objectif de cette thèse était d'inactiver l'ensemble des micro-organismes pathogènes au sein d'un produit sanguin : le plasma. L'enjeu principal était d'une part de sauvegarder la fonctionnalité des principales protéines contenues dans le plasma (facteurs de coagulation notamment) et d'autre part d'inactiver les micro-organismes contaminants. Afin d'atteindre cet équilibre, plusieurs paramètres ont été utilisés : - la valeur de la pression (de 100 à 300 MPa), - la durée du traitement, - les températures négatives... Plusieurs résultats originaux seront présentés, notamment en ce qui concerne la différence de sensibilité aux hautes pressions des protéines d'une part et l'inactivation de micro-organismes d'autre part.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [130]-146. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

La mise en œuvre des hautes pressions permet d'inactiver des micro-organismes contaminants (levures, bactéries, spores, virus…) au sein de divers milieux. Cette technologie a tout d'abord été utilisée puis développée à l'échelle industrielle pour décontaminer des produits alimentaires. Du fait de la faible énergie générée par les hautes pressions, seules les liaisons faibles et correspondant à une valeur de ?V négative sont altérées, ce qui, en outre, ouvrait la voie à de nombreuses applications biologiques. L'objectif de cette thèse était d'inactiver l'ensemble des micro-organismes pathogènes au sein d'un produit sanguin : le plasma. L’enjeu principal était d'une part de sauvegarder la fonctionnalité des principales protéines contenues dans le plasma (facteurs de coagulation notamment) et d'autre part d'inactiver les micro-organismes contaminants. Afin d’atteindre cet équilibre, plusieurs paramètres ont été utilisés : - la valeur de la pression (de 100 à 300 MPa), - la durée du traitement, - les températures négatives… Plusieurs résultats originaux seront présentés, notamment en ce qui concerne la différence de sensibilité aux hautes pressions des protéines d'une part et l'inactivation de micro-organismes d'autre part. / High hydrostatic pressure (HHP) has shown its capacity to inactivate contaminating micro-organisms (yeasts, bacteria, spores, viruses…) present in various media. This technology has been first used and developed to an industrial scale for the food industry. Because of the low energy raised using high pressure, only weak interactions characterized by a negative ?V will be altered. This statement opens the way to numerous applications in the biology field. The objective of this PhD work was to inactivate all the pathogens that may contaminate blood products, and blood plasma in particular. The main challenge was to inactivate the contaminating micro-organisms while maintaining the activity of the plasma proteins (such as blood coagulation factors). To achieve this balance, several parameters were used: - the pressure value (from 100 to 300 MPa), - the treatment duration, - negative temperatures… Some original results will be presented, concerning differences in the high pressure sensitivity of proteins and the inactivation of pathogens.

Le sol constitue le milieu naturel contenant la plus grande diversité de micro-organismes (typiquement 109 cellules de 104 espèces différentes par gramme de terre). Pourtant il n’est possible d’obtenir la croissance que d’une fraction en laboratoire (moins de 5 %). Réaliser des cultures de cette diversité, inaccessible pour le moment, aurait des applications considérables en agriculture (création d’engrais ou pesticide biologique et respectueux de l’environnement) et en pharmacologie (découverte d’antibiotiques ou anticancéreux). Ce travail de thèse est principalement axé sur l’étude de la croissance de micro-organismes difficiles à cultiver issus d’échantillons naturels tels que les sols. Des gouttes de tailles micrométriques, créées par microfluidique digitale, sont utilisés comme microréacteurs afin d’obtenir la croissance en laboratoire des espèces microbiennes encapsulées à l’intérieur. Une première étape consiste à obtenir une solution ne contenant que les microbes provenant de notre échantillon naturel de sol pour pouvoir réaliser l’encapsulation sans matières minérales et obtenir une diversité la plus proche possible de celle du sol. Une deuxième étape consiste à encapsuler les cellules contenues dans notre solution en faisant varier certaines conditions comme : la concentration initiale de microbes, le milieu de culture ou le temps d’incubation. Par l’observation des gouttes après croissance et séquençage des gènes ARNr 16S des cellules contenues à l’intérieur nous démontrons qu’il est possible d’obtenir la croissance de jusqu’à 40 % des espèces. Cette méthode microfluidique ouvre la voie du criblage à haut débit des interactions entre une espèce donnée (pathogène humain ou de plante, phage/virus) avec le microbiote qu’il est susceptible de contaminer (flore intestinal, sols, mers …) et ainsi déterminer quantitativement la réaction du milieu étudié, en plus de son utilisation pour la croissance d’espèces difficilement cultivables en laboratoire. / Soil is the natural medium containing the highest microbial diversity (109 cells from 104 different species per gram of soil). Yet we still can’t grow in laboratory more than 5 % of them. Having access to this diversity will lead to crucial applications for farming (production of organic fertilizers or environmentally friendly pesticides) and to pharmacology (discovery of new antibiotics or new anticancer molecules). This work focuses on the study of growth of non culturable micro-organisms from natural samples, like soil. This method uses microfluidics droplets as microreactors to obtain the growth of microbial species encapsulated inside. The first step is to achieve a solution with nothing but the microbes from our natural sample (no minerals) for a successful encapsulation and obtain diversity as close to the one found in the soil. The second step is to encapsulate the cells from this solution with different set of condition like : initial concentration, growth media and incubation time. By coupling observation of the droplets after growth and the rRNA 16S sequencing of their content we demonstrate that it is possible to obtain the growth of up to 40 % of the species. This microfluidic method, besides its use in growing unculturable species in laboratory, opens the way towards high-throughput screening of interactions between a given species (human or plant pathogens, phage/virus) and the microbiota it is likely to contaminate (gut flora, soil, sea …) and obtain the quantitative determination the reaction of microbiota.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Pour le maintien d'une espèce, il est primordial que celle-ci soit capable, à partir des nutriments présents dans le milieu environnant, d'effecmer la biosynthèse du matériel ceUiilaire nécessaire à sa survie. Les micro-organismes par exemple, synthétisent les produits organiques dont ils ont besoin, en uulisant divers processus métaboliques afin de trouver des sources d'énergie alternatives. Cette diversité est observée chez les baaéries photosynthétiques, qui sont capables de convertir la lumière en énergie chimique, favorisant ainsi le processus de fixation de l'azote. Ce processus, qui pennet la biosynthèse de l'azote, est essentiel car l'azote diatomique limite encore la production agricole. C'est pourquoi il est important de trouver différentes méthodes permettant d'améliorer le processus de fixation de l'azote. Afin de perfectionner ce mécanisme biologique, il est nécessaire d'étudier au préalable les facteurs qui limitent et régulent l'activité de la nitrogénase (N2ase), qui est l'enzyme-clé du processus de fixation de l'azote. La N2ase est une métalloenzyme sensible à l'oxygène et constituée de deux composantes qui ont besoin de MgATP2 et nécessite un transporteur d'électrons à bas potentiel rédox. Le transport d'électrons vers la N2ase a été fermement établi chez Klebsiella pneumoniae et chez cette bactérie, le transporteur est une flavodoxine spécifique, NifF. Le mécanisme met en jeu la NifF et une pyruvate flavodoxine oxydoréductase (NifJ), qui résulte en une décarboxylation du pyruvate en CoA + COz (par NifJ) couplée à une réaction de reduction de la NifF. Cependant, ce transport d'électrons ne se résume pas seulement au système NifF/NifJ. En effet, ce système n'est pas utilisé chez tous les diazotrophes. Par exemple, chez Clostridium pasteurianum, le transport d'électrons implique une ferrédoxme. De plus, certains micro-organismes peuvent avoir plusieurs types de ferrédoxines ou des ferrédoxines et une flavodoxine ou encore plusieurs tonnes de flavodoxines. Un exemple est donné par Rhodobacter capsulatus qui possède de nombreux transporteurs d'électrons à bas potentiel rédox, mais dont seulement une de type ferrédoxine, est capable d'acheminer des électrons vers la N2ase in vivo. Le sujet de cette thèse de doctorat est l'identification d'une flavodoxine comme étant un nouveau transporteur d'électrons à bas potentiel rédox, in vivo pour la N2ase chez Rhadsbacter capsalatus. Une combinaison d'approches génétiques, biochimiques, physiologiques et d'études de cinétique de type « stopped-flow », a permis de caractériser ce transporteur. Les études biochimiques ont identifié celui-ci comme étant une flavodoxine (NifF) à longue chaîne hautement homologue à des flavodoxines nif-spécifiques. L'observation de la complémentation d'un mutant nifF de Klebsiella pneumoniae et l'obtention de la séquence nucléotidique de ce dernier ont mis en évidence la présence d'un promoteur de type spécifique. Les études sur la régulation transcriptionnelle de nifF ont confirmé son implication en tant que transporteur d'électrons dans le processus de fixation de l'azote. Par contre, il a été démontré que la transcription du gène de nifF chez Rhodobacter capsalatus est régulée à la fois par le taux intracellulaire d'azote ammoniacal et de fer, contrairement à la transcription de nifF chez Klebsiella pneumoniae. De plus, la ferrédoxine (Fdl) semble jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de nifF, mais le mécanisme d'action reste encore à déterminer. Enfin, les études de cinétiques de type « stopped-flow » permettent d'affirmer que NifF peut remplacer Fdl (le transporteur d'électrons pour la N2ase chez Rhodobacter capsalatus in vivo) comme transporteur d'électrons vers la N2ase. En effet, NifF présente non seulement une interaction spécifique avec la FeP, mais cette interaction est plus forte que celle entre FdJ et FeP. Donc, même si NifF est présente en quantité intracelullaire plus faible que Fdl, elle contribue de façon importante au taux de fixation de l'azote de par sa grande réactivité avec la FeP.

Les intégrons sont des éléments génétiques capables d'intégrer et de disséminer, par un mécanisme de recombinaison spécifique de site, des gènes de résistance aux antibiotiques trouvés sous la forme de cassettes. Ils contiennent un gène qui code pour une intégrase (intl) qui effectue la recombinaison en agissant sur deux sites cibles : le site attl en cis avec le gène d'intégrase et le site palindromique attC d'une cassette. Les intégrases d'intégrons sont donc directement impliquées dans l'accumulation et la formation de nouvelles combinaisons de cassettes de résistance dans la région variable des intégrons plasmidiques et il est donc important de mieux comprendre leur fonctionnement. Les travaux présentés à l'intérieur de cette thèse visent l'étude des interactions entre les intégrases d'intégrons et leurs sites d'attachement. Le premier objectif est de vérifier si la substitution de certains résidus peut permettre de modifier la capacité d'une intégrase d'intégron à exciser différentes cassettes. Pour ce faire, nous avons étudié l'intégrase chromosomique, SamlntLA, trouvée chez Shewanella amazonensis SB2BT afin de déterminer si cette enzyme est capable d'exciser différentes cassettes, de comparer son activité avec celles des intégrases SonIntIA et IntI2*179E et finalement de comparer les propriétés de l'enzyme sauvage avec celles de quelques enzymes mutantes. Nous avons donc testé la capacité de ces trois intégrases sauvages et de quelques mutantes à exciser plusieurs cassettes contenant différents sites attC. Les résultats démontrent que l'intégrase SamlntLA est beaucoup moins active que les intégrases SonIntIA et IntI2*179E pour effectuer l'excision des cassettes. Ils démontrent aussi que les substitutions V206R, V206K et V206H permettent d'augmenter l'efficacité de SamlntLA à exciser certaines cassettes mais que l'activité de ces intégrases mutantes est inférieure à celle montrée par les intégrases SonIntIA et IntI2*179E. Le deuxième objectif est d'analyser l'influence de l'identité des bases protubérantes et de l'espacement qui les sépare sur l'excision des cassettes par les intégrases d'intégrons. Nous avons ainsi effectué la mutagenèse du site attCdfrAi en amont de la cassette sat2 pour obtenir des variantes de séquences et d'espacement entre les bases protubérantes afin de déterminer comment ces modifications influencent la capacité des intégrases Intll, IntI2*179E, IntI3 et SonIntIA à exciser les cassettes. Nous avons ainsi démontré que l'intégrase Intll est plus efficace pour exciser les cassettes contenant des sites attC caractérisés par des bases protubérantes T et G séparées par 6 nucleotides tandis que l'intégrase IntI3 excise les cassettes contenant un nombre limité de sites attC. Nous avons aussi démontré que les intégrases IntI2*179E et SonIntIA tolèrent les changements de bases protubérantes et qu'elles excisent une plus grande variété de cassettes que les intégrases Intll et IntI3.

Les norovirus sont les principaux agents responsables des gastroentérites aiguës d'origine virale à travers le monde, pouvant être transmis par des aliments contaminées. La quantité de particules virales retrouvée dans les aliments dépasse rarement la dose minimale infectieuse. Une étape de concentration s'avère nécessaire pour la détection de ces virus dans les aliments. L'objectif de ce projet était de développer et de valider une méthode de concentration immuno-magnétique combinée à l'amplification en temps réel pour une détection spécifique et sensible des norovirus. Une séquence peptidique caractéristique de la capside virale a été sélectionnée pour la production d'anti-norovirus spécifiques du génogroupe II. Les anticorps couplés à des billes magnétiques ont été utilisés pour concentrer les norovirus à partir d'aliments artificiellement contaminés. Les norovirus capturés ont été lysés et l'ARN viral libéré a été détecté par RT-PCR en temps réel. Les norovirus ont été détectés à une concentration de 20 unités RT-PCR.