Esporos de Bacillus atrophaeus ATCC 9372 são utilizados como bioindicadores na avaliação da eficiência de processos de esterilização. Considerando o uso dos esporos de Bacillus, deve-se buscar alternativas para sua obtenção visando desenvolver um processo econômico e ambientalmente viável. A obtenção de biomassa de microalga seja para uso como suplemento alimentar ou obtenção de biodiesel se destaca pela elevada quantidade de água utilizada no processo. Após a retirada da biomassa, o meio residual, que é rico em matéria orgânica e nutrientes, poderia ser empregado como substrato para obtenção de outros micro-organismos e de subprodutos de interesse industrial. O objetivo deste trabalho é avaliar a utilização de meios residuais provenientes do cultivo de micro-organismos fotossintetizantes para produção de esporos de B. atrophaeus ATCC 9372. Alíquotas de 100 mL dos meios residuais f2 Guillard e Bold, foram autoclavados e avaliados in natura ou suplementados com glicose (2,5g/L), sulfato de amônio 2%, associados ou não e extrato de levedura (2,5g/L), ou adicionados ao meio após incubação de pré-inóculo por 2 e 4 horas. A suplementação com extrato de levedura e os cultivos com pré-inóculos proporcionaram população de 107 esporos/mL as quais apresentaram resistência térmica a 102 oC, expressos em termos de tempo de redução decimal de D =1,27 min em meio com extrato de levedura, D =1,42 min em meio preparado com inóculo de 4 horas, ambos em meio f2 e D = 1,25 min nas duas condições para meio Bold residual. Os resultados demonstraram a viabilidade do uso de meio residual como meio de crescimento e esporulação de Bacillus atrophaeus ATCC 9372, que pode ser reutilizado para obter produtos farmacêuticos e de interesse industrial. / Bacillus atrophaeus spores ATCC 9372 are commonly used as biological indicators in assessing the efficiency of sterilization processes. Considering the use of Bacillus spores, it is necessary to look for alternatives to obtain them, aiming at a viable economic process and environment. Obtaining microalgae biomass for use as a food supplement or obtaining biodiesel is notable for the high amount of water used in the process. After the biomass removal, the residual growth medium is rich in organic matter and nutrients that could be used as a substrate for the cultivation of other microorganisms, and to obtain by-products of industrial interest. The goal of this work is to evaluate the use of residues from the cultivation of photosynthetic microorganism for the production of spores of Bacillus atrophaeus ATCC 9372. Aliquots of 100 mL residual growth medium were autoclaved and evaluated in natura or supplemented with glucose (2.5g/L), ammonium sulphate 2%, associated or not to yeast extract (2.5g/L) or added to medium after pre-inoculum incubation for 2 and 4 hours. Yeast extract supplementation and cultures using pre-inoculum provided a population of 107 spores / mL which showed thermal resistance at 102 oC, expressed in terms of decimal reduction times of D = 1.27 min in medium with yeast extract, D = 1.42 min in medium prepared with 4 hour inoculum, both resistances related to f2 medium and D = 1.25 min in both conditions for residual Bold medium.The results demonstrated the feasibility of the use of residual medium growth way and sporulation of Bacillus atrophaeus, which can be reused to obtain pharmaceuticals and industrial interest.

Esporos de Bacillus atrophaeus ATCC 9372 são utilizados como bioindicadores na avaliação da eficiência de processos de esterilização. Considerando o uso dos esporos de Bacillus, deve-se buscar alternativas para sua obtenção visando desenvolver um processo econômico e ambientalmente viável. A obtenção de biomassa de microalga seja para uso como suplemento alimentar ou obtenção de biodiesel se destaca pela elevada quantidade de água utilizada no processo. Após a retirada da biomassa, o meio residual, que é rico em matéria orgânica e nutrientes, poderia ser empregado como substrato para obtenção de outros micro-organismos e de subprodutos de interesse industrial. O objetivo deste trabalho é avaliar a utilização de meios residuais provenientes do cultivo de micro-organismos fotossintetizantes para produção de esporos de B. atrophaeus ATCC 9372. Alíquotas de 100 mL dos meios residuais f2 Guillard e Bold, foram autoclavados e avaliados in natura ou suplementados com glicose (2,5g/L), sulfato de amônio 2%, associados ou não e extrato de levedura (2,5g/L), ou adicionados ao meio após incubação de pré-inóculo por 2 e 4 horas. A suplementação com extrato de levedura e os cultivos com pré-inóculos proporcionaram população de 107 esporos/mL as quais apresentaram resistência térmica a 102 oC, expressos em termos de tempo de redução decimal de D =1,27 min em meio com extrato de levedura, D =1,42 min em meio preparado com inóculo de 4 horas, ambos em meio f2 e D = 1,25 min nas duas condições para meio Bold residual. Os resultados demonstraram a viabilidade do uso de meio residual como meio de crescimento e esporulação de Bacillus atrophaeus ATCC 9372, que pode ser reutilizado para obter produtos farmacêuticos e de interesse industrial. / Bacillus atrophaeus spores ATCC 9372 are commonly used as biological indicators in assessing the efficiency of sterilization processes. Considering the use of Bacillus spores, it is necessary to look for alternatives to obtain them, aiming at a viable economic process and environment. Obtaining microalgae biomass for use as a food supplement or obtaining biodiesel is notable for the high amount of water used in the process. After the biomass removal, the residual growth medium is rich in organic matter and nutrients that could be used as a substrate for the cultivation of other microorganisms, and to obtain by-products of industrial interest. The goal of this work is to evaluate the use of residues from the cultivation of photosynthetic microorganism for the production of spores of Bacillus atrophaeus ATCC 9372. Aliquots of 100 mL residual growth medium were autoclaved and evaluated in natura or supplemented with glucose (2.5g/L), ammonium sulphate 2%, associated or not to yeast extract (2.5g/L) or added to medium after pre-inoculum incubation for 2 and 4 hours. Yeast extract supplementation and cultures using pre-inoculum provided a population of 107 spores / mL which showed thermal resistance at 102 oC, expressed in terms of decimal reduction times of D = 1.27 min in medium with yeast extract, D = 1.42 min in medium prepared with 4 hour inoculum, both resistances related to f2 medium and D = 1.25 min in both conditions for residual Bold medium.The results demonstrated the feasibility of the use of residual medium growth way and sporulation of Bacillus atrophaeus, which can be reused to obtain pharmaceuticals and industrial interest.

Diversos produtos tópicos são desenvolvidos a fim de se evitar os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV), dentre eles, os protetores solares constituídos por filtros físicos e/ou químicos. No entanto, os filtros químicos podem promover eventos adversos, razão pela qual a busca de ativos em fontes naturais tem-se mostrado de grande importância. A microalga Botryococcus braunii pode ser de potencial interesse em aplicações cosméticas, pois foi descrito que seu extrato aquoso apresentou redução da desidratação cutânea, induziu a produção do colágeno, bem como promoveu atividade antioxidante. Assim, o estudo visou analisar o auxilio da B. braunii na fotoproteção cutânea e na proteção da pele por meio da ação antioxidante in vitro. As formulações, constituídas de biomassa da microalga ou de seus extratos, acrescidas ou não de filtros, foram avaliadas quanto à: ação antioxidante, atividade fotoprotetora in vitro e fotoestabilidade. A B. braunii apresentou bom desempenho de crescimento, contendo lipídeos (25,65%) e proteínas (49,17%) em proporção semelhante à descrita na literatura. A presença de fenóis totais e a ação antioxidante foram analisadas nos extratos obtidos com clorofórmio, metanol e etanol 70%. O extrato obtido com etanol 70% foi o que apresentou maior concentração de fenóis totais (68,9 µg/mL de ácido cafeico), porém inferior ao relatado na literatura; e a ação antioxidante não foi considerada significativa ao se comparar com o padrão Trolox®. Nas formulações, os extratos foram considerados ineficientes para ação antioxidante. Quanto à atividade fotoprotetora in vitro e fotoestabilidade, a B. braunii não apresentou eficácia adequada, existindo, porém, a possibilidade de os extratos atuarem na região da luz visível e contribuírem contra os efeitos danosos provocados por esta radiação à pele. / Several topical products are developed in order to avoid the harmful effects of ultraviolet (UV) radiation, including sunscreens made by physical and/or chemical filters. However, chemical filters may promote adverse events, which is why the search for actives from natural sources has proven to be of great importance. The microalgae Botryococcus braunii may be of potential interest in cosmetic applications, because it has been reported that its aqueous extract showed a reduction in skin dehydration, induced collagen production and promoted antioxidant activity. Thus, the study aimed to analyze the contribution of B. braunii in skin photoprotection and skin protection through in vitro antioxidant action. The formulations, consisting of biomass from the microalgae or their extracts, supplemented or not by filters, were evaluated for: antioxidant activity, photoprotective activity in vitro and photostability. The B. braunii showed good growth performance, containing lipids (25.65%) and protein (49.17%) in similar proportion to the described by the literature. The presence of phenolic compounds and antioxidant activity were analyzed in extracts obtained with chloroform, methanol and 70% ethanol. The extract obtained with 70% ethanol showed the highest concentration of total phenolics (68.9 mg/mL caffeic acid), but lower than that reported in the literature; and the antioxidant action was not considered significant when compared to the Trolox® standard. In the formulations, the extracts were considered inefficient for antioxidant action. In relation to the in vitro photoprotection activity and photostability, B. braunii did not provide adequate efficacy, however, there is a possibility that the extracts have an ability to act in the visible light region and contribute to the protection from the harmful effects caused by that radiation to the skin.

As mudanças climáticas associadas às atividades humana são devidas principalmente às emissões de CO2 na atmosfera provenientes da queima de combustíveis de origem fóssil. Desta forma, faz-se necessária a substituição dessas fontes fósseis de geração de energia, por fontes renováveis. Dentre as alternativas de fontes renováveis, podemos destacar os biocombustíveis produzidos a partir de microalgas, as quais apresentam composição rica em óleos e proteínas. Um dos grandes desafios encontrados na conversão de biomassa em biocombustíveis é a caracterização detalhada das microalgas. A identificação de espécies através da espectrometria de massas com Ionização/Dessorção à Laser Assistida por Matriz acoplada a analisador por tempo de vôo (MALDI-TOF-MS) utilizada na análise de perfil de proteínas de micro-organismos, e posterior rápida identificação por comparação com os padrões armazenados em bancos de dados (fingerprint) tem se sobressaído. Existem poucos trabalhos na literatura abordando a identificação de espécies de microalgas utilizando a técnica de MALDI-TOF-MS e nenhum trabalho abordando a análise a partir do uso de células de microalgas liofilizadas. Desta forma, nesse trabalho foi estudada a influência de diversos parâmetros tais como placa, modo de análise, valor de PIE, valor de IS2, matriz e solvente de matriz e amostra nos espectros de massas do tipo MALDI-TOF-MS para análise do perfil proteico de células liofilizadas das espécies de microalgas Chlorella vulgaris, Chlorella sp., Desmodesmus sp., Monoraphidium sp. e Oocystis sp. Primeiramente, os cultivos foram realizados em um sistema de agitador orbital otimizado de tal maneira que todas as posições apresentassem as mesmas condições. Após os cultivos, as células foram secas para posterior análise de espectrometria de massas. Para determinação da metodologia que fornecesse os melhores espectros de massas, foram avaliados, aleatoriamente, 3 parâmetros: número de íons (P1), relação sinal/ruído do pico base (P2) e intensidade do pico base (P3). Foi observado que para a maioria das amostras de microalgas, os parâmetros que mais influenciaram na obtenção de espectros de massas do tipo MALDI-TOF bem resolvidos foram a placa, o modo de análise, valor de PIE, valor de IS2 e a matriz. As variações obtidas nos espectros de massas, quando utilizados diferentes solventes tanto para a matriz quanto para a amostra, bem como a adição de isopropanol com o objetivo de melhorar a distribuição da matriz sDHB na placa de amostragem, não foram tão significativas como as observadas para os outros parâmetros avaliados nesse estudo. Como conclusão, o uso da matriz sDHB, solvente TA50 para amostra e matriz, análise na placa polished sob as condições de análise PIE 100ns, IS2 23kV mostraram-se muito mais efetivos para a análise de proteínas a partir de amostras de microalgas liofilizadas. A análise dos lipídios apresentou uma distribuição predominante dos ácidos graxos C16:0, C18:2 e C18:0 para os cultivos de 12 dias e C16:0, C18:2 e C22:6 para os cultivos de 8 dias. Entretanto, as proporções de C22:6 e C18:2 aumentaram para os cultivos de 8 dias. Dessa forma, as espécies de microalgas Chlorella vulgaris., Chlorella sp., Monoraphidium sp. e Oocystis sp. cultivadas por 8 dias podem ser convertidas em biocombustível por apresentarem ácidos graxos entre 14 e 18 carbonos e em sua composição. / Climate change associated to human activities are mainly due to CO&#8322 emissions from combustion of fossil fuels in the atmosphere. Thus, it is necessary to replace these fossil sources of energy generation for renewable sources. Among the alternative of renewable sources, biofuels derived from microalgae is am potential alternative, since microalgae present in their composition fatty acids and proteins. Characterization of microalgae is one of the challenges in the conversion of their biomass into biofuels. The microorganism species identification by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) thought the analysis of protein profile and subsequent fast identification by comparison with the standard protein profile (fingerprint) in the database has been outstanding. There are few studies in the literature about the identification of microalgae species using MALDI-TOF-MS technique and there is no one using cells of lyophilized microalgae. Thus, in this work was studied the influence of many parameters such as target, analysis mode, PIE, IS2 value, matrix, matrix solvent and sample solvent in the MALDI-TOF mass spectra for analysis of protein profile of lyophilized microalgae cells for the species Chlorella vulgaris cells, Chlorella sp., Desmodesmus sp., Monoraphidium sp. and Oocystis sp. Cultivations were carried out using an optimized shaker system, where all positions presented the same conditions. After the cultivation, the cells were dried for subsequent mass spectrometric analysis. To achieve the best mass spectra profile, 3 parameters were arbitrarily evaluated: number of ions (P1), base peak signal/noise ratio (P2) and base peak intensity (P3). It was observed for most microalgae samples, MALDI-TOF mass spectra profile were most influenced by target, analysis mode, PIE value, IS2 value and the matrix. Variations in the mass spectra obtained when different solvents were used (for matrix and sample) as well as the addition of isopropanol in order to improve the distribution of sDHB matrix on the spot, were not significant as that observed for the other parameters. In conclusion, the use of sDHB matrix, TA50 solvent for sample and matrix, analysis in polished target plate under the following analysis conditions: a PIE 100ns, a IS2 23kV, provided to be more effective for the analysis of protein from lyophilized microalgae cells. Lipid analysis of 12 days cultivated microalgae showed a predominant distribution of the C16:0, C18:2 and C18:0. The 8 days cultivation presented a distribution of C16:0, C18:2 and C22:6, but with C22:6 e C18:2 in a higher proportion. Since biofuel are produced by using the C14-C18 fatty acid contained in their composition, 8 days cultivation showed to be most effective for this purpose.

This document presents a research work on the mathematical modeling of the fast pyrolysis process of microalgae biomass by means of the construction of a reaction mechanism based on Arrhenius kinetic parameters. The interest in microalgae biomass as a source of bio-fuels and chemical products has grown only very recently from the last decade of the XX century. Although several papers related to the thermal decomposition of microalgae were found in the literature, only a few works are related to specific microalgae species. In particular, the microalgae species having more experimental data found in the literature was the Chlorella Vulgaris. Therefore, this species was chosen in this research in order to develop a reaction mechanism. Mathematical models for pyrolysis of lignocellulosic or woody materials have been developed for almost sixty years. Therefore, a large quantity of experimental data such as from the TG, DTG, DSC thermal analysis has been accumulated. As a consequence, sophisticated and comprehensive reaction mechanisms of pyrolysis have been developed. On the other hand, although the interest in the pyrolysis process about microalgae has grown, only a few works have reported thermal decomposition data, kinetic constants, products composition or complete reaction mechanisms in order to predict the devolatilization. As a consequence, there is currently no reaction mechanism coupled to CFD-type models that simulate rapid pyrolysis or devolatilization in reactors. In this context, this research proposes the development of a new multi-stage global reaction mechanism for the Chlorella Vulgaris species, based on the fundamental analysis TG and DTG and supported by well developed concepts, methodologies and principles for lignocellulosic biomass thermal analysis. The results obtained in this research have evidenced that the reaction mechanism has a very good agreement compared to experimental data of TG and DTG, accurately predicting the complex devolatilization of Chlorella Vulgaris in several steps. Following the objectives of this research, in a second stage, the set of chemical kinetic parameters were adapted to be used in a hydrodynamic numerical simulation (CFD). The adapted reaction mechanism was applied to simulating the devolatilization process in conjunction with a tubular fluidized reactor obtained from the literature which was used in studying the fast pyrolysis process of the Chlorella Vulgaris. In order to numerically solve the hydrodynamics and the rate equations, the finite volume method was used considering two Eulerian phases and an axis-symmetric domain. In particular, the solid phase, composed by the Chlorella Vulgaris powder was considered as a dispersed granular phase describing its rheology by means of the kinetic theory of granular flows. ANSYS Fluent 19.0 software package was used in defining and constructing the mesh and solving the set of discretized conservation equations using a transient pressure-based solver. Simulation using the adapted reaction mechanism for a reactor temperature of 673 K was performed for four different grid refinements in order to determine the solution convergence. Simulation results showed that the reaction mechanism can predict well the kinetics of the biomass conversion at high heating rates. Furthermore, and as expected, the results also showed that the biomass conversion depends strongly on the local temperature that is related to the granular rheology and transport processes of mass, momentum, and energy that have a fundamental role to control and to limit the overall biomass conversion. / Este documento apresenta o desenvolvimento e o resultado da modelagem matemática do processo de pirólise rápida de biomassa microalgal através da construção de um mecanismo químico de reação com base nos parâmetros cinéticos de Arrhenius. O interesse na biomassa de microalgas como fonte de bio-combustíveis para produtos químicos têm crescido muito recentemente,desde a última década do século XX. Embora vários artigos relacionados à decomposição térmica tenham sido identificados na literatura, apenas alguns trabalhos estão relacionados a uma espécie específica de microalga. Em particular a microalga que possui a maior quantidade de dados experimentais encontrados na literatura é a Chlorella Vulgaris. Portanto, esta espécie foi escolhida nesta investigação para desenvolver o mecanismo de reação. Os modelos matemáticos da pirólise de materiais lignocelulósicos ou de madeira foram desenvolvidos no decorrer de sessenta anos. Assim, uma grande quantidade de dados experimentais das análises TG, DTG e DSC foram acumuladas. Como consequência, foram desenvolvidos sofisticados mecanismos de reação completos para pirólise. Embora o interesse no processo de pirólise de microalgas tenha crescido, apenas alguns trabalhos reportaram dados de decomposição térmica, constantes cinéticas, composição de produtos ou mecanismos de reação completos. Como consequência, não existe na literatura,até o momento,mecanismos de reação acoplados a modelos do tipo CFD que simulem pirólise rápida ou devolatilização em reatores. Neste contexto, esta pesquisa propõe o desenvolvimento de um novo mecanismo de reação global multi-etapa (multi-stage) para a espécie Chlorella Vulgaris, baseado nas análises fundamentais TG e DTG, método iso-conversional e apoiado em conceitos e princípios bem desenvolvidos para a análise térmica da biomassa lignocelulósica. Os resultados obtidos nesta investigação mostram grande concordância quando comparados com os dados experimentais de TG e DTG, prevendo com precisão a complexa desvolatilização em estágios da Chlorella Vulgaris. Seguindo os objetivos desta investigação, o conjunto de parâmetros cinéticos químicos obtidos foi adaptado, numa segunda etapa, para ser utilizado em uma simulação numérica hidrodinâmica (CFD). O mecanismo de reação adaptado foi aplicado para simular o processo de desvolatilização em conjunto com um reator tubular fluidizado obtido da literaturaque foi usado para estudar o processo de pirólise de Chlorella Vulgaris.Para resolver numericamente as equações hidrodinâmicas e a taxa de reação, foi utilizado o método dos volumes finitos considerando duas fases Eulerianas e um domínio de simetria axial.Em particular, a fase sólida composta de pó de Chlorella Vulgaris foi considerada como uma fase granular dispersa, descrevendo sua reologia por meio da teoria cinética do fluxo granular. O programa ANSYS Fluent 19.0 foi usado para definir e construir a malha e resolver o conjunto de equações de conservação discretizadas usando um solver baseado em pressão. Simulações utilizando o mecanismo de reação adaptado foram realizadas considerando uma temperatura do reator de 673 K e quatro diferentes refinamentos de malha com o objetivo de determinar a convergência da solução. Os resultados da simulação mostraram que o mecanismo de reação, cineticamente, pode prever bem a conversão de biomassa em altas taxas de aquecimento. Além disso, e como era esperado, os resultados também mostraram que a conversão da biomassa depende fortemente da temperatura local, que também está diretamente relacionada à reologia da fase granular e aos processos de transporte de massa, quantidade de movimento e energia, que têm uma papel fundamental para controlar e limitar o processo de conversão global.

Minutocellus polymorphus é uma microalga marinha cosmopolita, encontrada em diversas áreas. É sensível a vários tipos de toxicantes e por isso foi escolhida para investigar a metabolização do fenol, assim como os efeitos de estresse oxidativo induzido por este poluente. Na exposição de M. polymorphus ao fenol foi observado um aumento na atividade da enzima superóxido dismutase (143,5±46,9 U mg-1 para o grupo tratado e 27,1±12,7 U mg-1 para o grupo controle) e na atividade de catalase (9,79 ± 1,32 µmol min-1 mg-1 no grupo fenol e 7,00 ± 1,03 µmol min-1 mg-1 no grupo controle). As enzimas ascorbato peroxidase, deidroascorbato redutase, glutationa redutase e glutationa peroxidase não foram afetadas pelo tratamento com fenol. Fenol foi ainda capaz de provocar uma depressão dos níveis de glutationa em M. polymorphus, o decréscimo da razão de GSH/GSSG foi de aproximadamente 80%. O fenol também provocou uma diminuição nos níveis de clorofila a, no entanto, não alterou outros pigmentos. Os níveis de malondialdéido, importante produto de lipoperoxidação, não foram alterados nas células expostas induzidos a este poluente orgânico. A remoção de fenol por M. polymorphus foi verificada no meio de cultura ao longo do tempo, houve um decréscimo na concentração de fenol de 250 µmol.L-1 depois de 6 dias de exposição. Em células previamente expostas ao poluente a remoção foi de 99% em 2 horas. As enzimas de biotransformação do fenol, fenol hidroxilase (PH) e catecol 2,3-dioxigenase (C2,3-D) também foram induzidas ao longo de 6 dias, no entanto, não foi detectada a atividade de catecol 1,2-dioxigenase (C1,2-D). Estes resultados sugerem que a biotransformação do fenol segue uma via de meta clivagem sendo formado o 2-hidroximucônico semialdéido pela ação de C2,3-D. A glutationa S-transferase (GST) teve um papel importante na detoxificação do fenol. Em M. polymorphus exposta a este poluente por 48 h foi observado um aumento da atividade de GST (7,4 ± 1,5 nmol min-1 mg-1 no grupo fenol e 14,6 ± 1,3 nmol min-1 mg-1 no grupo controle). Os resultados apresentados sugerem que a microalga M. polymorphus apresenta um potencial a biotransformação de fenol e pode ser considerada um importante bioindicador e SOD, catalase, GST e GSH importantes biomarcadores de poluição aquática / Minutocellus polymorphus is a cosmopolitan marine microalgae found in many areas. It is sensitive to several types of toxicants and therefore it was chosen to investigate the phenol biotransformation, as well as the oxidative stress induced by this pollutant. M. polymorphus exposed to phenol displays an increase in the enzymes superoxide dismutase (143.5±46.9 U mg-1 for the treated group and 27.1±12.7 U mg-1 for the control group) and catalase activities (9.79 ± 1.32 µmol min-1 mg-1 in the phenol group and 7.00 ± 1.03 µmol min-1 mg-1 in the control). The enzymes ascorbate peroxidase, dehydroascorbate reductase, gluthathione reductase and gluthathione peroxidase were not affected by the treatment with phenol. Phenol reduced the levels of gluthathione (GSH) in M. polymorphus, and therefore, the ratio GSH/GSSG is affected considerably. The intracellular levels of diadinoxanthin and chlorophyll-a were affected by the presence of phenol. The levels of malondialdehyde, important product of lipoperoxidation, were not altered in M. polymorphus when cells were exposed to this organic pollutant. The phenol uptake, by M. polymorphus, was followed and a decrease of 250 µmol. L-1 in the cell-free medium was estimated after six days of exposure. Cells previously exposed to the pollutant uptakes 99 % in 2 hours of incubation. The enzymes of phenol biotransformation, phenol hydroxylase (PH) and catechol 2,3-dioxygenase (C2,3-D) activities were induced after 6 days incubation. However, the activity of catechol 1,2-dioxygenase (C1,2-D) was not detected. These results suggest that the degradation of the phenol follows a meta clivagem being formed it 2-hydroxymuconic semialdehyde by the action of C2,3-D. The gluthathione S-transferase (GST) also displays an important role in the phenol detoxification. M. polymorphus exposed to the phenol for 48 hours had an increase of GST activity (7.4 ± 1.5 nmol min-1 mg-1 in the phenol group and 14.6 ± 1.3 nmol min-1 mg-1 in the control group). Our results suggest that the microalgae M. polymorphus is a potential to phenol biotransformation and it may be considered an important bioindicator and SOD, catalase, GST and GSH important biomarkers of aquatic pollution

O objetivo desta tese foi explorar o sistema de produção de proteínas heterólogas em microalga com ênfase em Chlamydomonas reinhardtii por meio de: (1) desenvolvimento de um fotobiorreator tubular fechado de escala laboratorial, utilizando técnicas de manufatura digital; (2) avaliação de 7 diferentes proteínas fluorescentes (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato e mCherry), como sistema reporter de secreção de proteínas em microalga; (3) avaliação do fotobiorreator desenvolvido utilizando cultivo de cepas recombinantes; (4) desenvolvimento de novos peptídeos sinais para secreção de proteínas em C. reinhardtii; (5) avaliação da produção de um biofármaco (hialuronidase) em microalgas, por meio da expressão de duas isoenzimas codificadas pelos genes HYA1 e SPAM1 em C. reinhardtii. O fotobiorreator tubular foi avaliado quanto a sua capacidade de resistir ao processo de esterilização por autoclavação e seu desempenho por meio do cultivo de cepa recombinante secretando mCherry. A fluorescência das proteínas fluorescentes foi medida por leitor de placas de fluorescência e visualizada intracelularmente por microscopia confocal de fluorescência. A atividade de hialuronidase foi determinada através de um ensaio enzimático turbidimétrico. O desenvolvimento do fotobiorreator resultou em um sistema fechado resistente a autoclavação, com capacidade de cultivo de cepas recombinantes de C. reinhardtii. Esse fotobiorreator proporcionou uma produtividade máxima de 10 mg/L.d de mCherry da cepa recombinante em sistema fechado, com velocidade específica de crescimento máxima de 1,27 d-1 para a cepa recombinante testada. Todas as proteínas fluorescentes avaliadas apresentaram capacidade de secreção por C. reinhardtii, com diferentes níveis de interferências em sua medição, permitindo a escolha da mCherry como proteína reporter. Entre os peptídeos sinais avaliados (quatro descritos na literatura - BiP, ARS1, CAH1 e IBP1 - e seis preditos), o peptídeo predito \"SP5\" foi o que apresentou maior capacidade de secreção, determinado por níveis de fluorescência no sobrenadante. A avaliação dos peptídeos sinais constatou a necessidade de explorar o desenvolvimento de sistemas de expressão (e.g. vetores de expressão) aliados a análises computacionais, como o SignalP 4.0. Por último, os dados desse estudo mostram que C. reinhardtii transformadas com o vetor de expressão foi capaz de produzir as duas isoformas de hialuronidase em sua forma ativa, evidenciando a capacidade desse sistema para a produção de biofármacos. Portanto, nesta tese o sistema de expressão de proteínas heterólogas baseado em microalgas foi explorado, atingindo os objetivos propostos. O fotobiorreator desenvolvido tem a capacidade de esterilização em escala laboratorial (1) e em cultivo com cepa recombinante propiciou elevada produtividade (3). As proteínas vermelhas fluorescentes apresentaram-se como as proteínas com menores interferências para estudos de secreção em C. reinhardtii (2). Além disso, o peptídeo predito SP5 apresentou o melhor desempenho na secreção de proteínas (4) e o vetor de expressão empregado permitiu a identificação de cepas produtoras de biofármaco hialuronidase (5). Portanto, o sistema de produção de proteínas heterólogas por microalgas é um sistema promissor e poderá permitir, utilizando sistemas de secreção, obter proteínas de alto valor comercial a baixos custos, empregando a secreção e técnicas de cultivo como a fermentação extrativa. / In this thesis, the heterologous protein production in microalgae with emphasis on Chlamydomonas reinhardtii was explored through: (1) development of a laboratory scale closed tubular photobioreactor using digital manufacturing techniques; (2) evaluation of different fluorescent proteins (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato and mCherry) as a reporter system for protein secretion in microalgae (3) evaluation of photobioreactor developed using recombinant strains culture; (4) development of new signals peptides for protein secretion in C. reinhardtii (5) expression evaluation of a biopharmaceutical (Hyaluronidase) in microalgae, through the expression of two isoenzymes encoded by the HYA1 and SPAM1 genes in C. reinhardtii. The tubular photobioreactor was evaluated for its ability to resist sterilization process by autoclaving and its performance by culturing recombinant strain secreting mCherry. Fluorescence of fluorescent proteins was measured by fluorescence plate reader and observed intracellularly by confocal fluorescence microscopy. The hyaluronidase activity was determined by a turbidimetric enzymatic assay. The development of the photobioreactor resulted in a closed system resistant to autoclaving, capable of culturing recombinant strains of C. reinhardtii. This recombinant strain achieved a maximum productivity of 10 mg/L.day of mcherry in the closed system, with a maximum growth rate of 1.27 d-1 for the recombinant strain tested. All the fluorescent proteins evaluated had C. reinhardtii secretion capacity, with different interference levels in their measurement, allowing the selection of mCherry as a reporter protein. Among the evaluated peptides (four described in the literature - BiP, ARS1, CAH1 and IBP1 - and six predicted), the predicted peptide \"SP5\" was the one that presented greater capacity of secretion, determined by levels of fluorescence in the supernatant. The results of this study point out the need to explore the development of biological systems (i.e., expression vectors) allied to computational analysis. Finally, the data from this study showed that C. reinhardtii could produce the two isoforms of hyaluronidase in its active form, evidencing the capacity of this system to produce biopharmaceuticals. Therefore, in this thesis the heterologous protein expression system based on microalgae was explored, reaching the proposed objectives. The developed photobioreator has sterilization capabilityin laboratorial scale (1) and in culture with recombinant strain had high productivity (3). The red fluorescent proteins was found as the most suitable proteins for studies of secretion in C. reinhardtii with lower interference levels(2). In addition, the predicted SP5 peptide showed the best performance in protein secretion (4) and the expression vector employed allowed the identification of strains producing biopharmaceutical hyaluronidase (5). Therefore, the system of heterologous proteins production by microalgae is promising and will allow, using secretion systems, to obtain proteins of high commercial value at low costs, using secretion and cultivation techniques such as extractive fermentation.

La biomasse des microalgues tropicales a des vertus naturelles qui peuvent être utilisées dans une large gamme de bioproduits. Leur valorisation peut permettre une production durable et commercialement viable. En effet, les microalgues tropicales représentent une grande biodiversité et bénéficient de conditions environnementales favorables à une production à grande échelle. Dans ce contexte, cette thèse vise à étudier de nouvelles souches tropicales afin de connaître leur potentiel de valorisation dans le domaine des biotechnologies, et plus particulièrement sur trois aspects : énergie, nutraceutique et antifouling. Ce dernier domaine a été étudié dans le cadre du projet ANR-CD2I « BIOPAINTROP » dont l’objectif est la lutte écoresponsable contre le biofouling. Ces travaux s’orientent vers des applications biotechnologiques, mais aussi vers le développement des nouvelles méthodes de caractérisation de l’activité antifouling. Sur les 50 souches étudiées, certaines ont montré la production de métabolites d'intérêt tels que le glycosylglycerol, des lipides de qualité pour la nutraceutique et la production de biodiesel. La souche Amphidinium sp. (P-43) a conduit à un extrait méthanolique possédant une activité biologique significative. Son efficacité dans la lutte contre le biofilm a été démontrée. De plus, l'étude d'écotoxicologie réalisée laisse présager d'un faible impact environnemental. / Biomass of tropical microalgae have natural virtues that can be used in a wide range of bioproducts. Their valuation can enable sustainable and commercially viable production. Indeed, tropical microalgae represent a large biodiversity and benefit from favourable environmental conditions for large scale production. In this context, this thesis aims to explore new tropical strains to determine their potential development in the field of biotechnology, particularly in three areas: energy, nutraceutical and antifouling. This field is studied in the project ANR-CD2I "BIOPAINTROP" whose objective is the eco-responsible fight against biofouling. These works target biotechnological applications, but also development of new methods to characterize antifouling activity.Of the 50 strains studied, some have shown interest in the production of metabolites such as glycosyl glycerol, quality nutraceutical and lipids for biodiesel production. The Amphidinium sp. (P-43) stain led to a methanol extract having biological activity of interest. Its efficiency against biofilm was demonstrated. Moreover, the ecotoxicology study has suggested a low environmental impact.

As embalagens têm grande importância na indústria de alimentos, pois tem como função principal proteger os alimentos contra contaminações externas. Porém, grande parte das embalagens tradicionais são produzidas a partir de fontes não renováveis e não biodegradáveis, causando sérios problemas ambientais. Por isso, os filmes e coberturas biodegradáveis vêm despertando atenção e interesse dos pesquisadores e indústrias. Neste trabalho, verificou-se a capacidade de desenvolver filmes biodegradáveis com propriedades antioxidantes, utilizando amido de mandioca, como matriz polimérica, e a adição de diferentes concentrações de biomassa seca e extrato de biomassa das microalgas Heterochlorella luteoviridis e Dunaliella tertiolecta. Os filmes foram caracterizados quanto a suas propriedades físico-químicas, mecânicas, de barreira, óticas e antioxidantes. Dentre os filmes desenvolvidos, o que apresentou melhores características foi selecionado para a aplicação em embalagem de salmão e avaliação da proteção contra a oxidação. Em geral, a aplicação da biomassa das microalgas ocasionou um aumento na solubilidade, biodegradabilidade e opacidade dos filmes. Já os filmes com aplicação de extrato obtiveram os menores valores para esses parâmetros A biomassa provocou aumento na elongação na ruptura e redução na resistência a tração e módulo de Young dos filmes; a adição de extrato resultou em características mecânicas inversas a dos filmes adicionados de biomassa. Todos os filmes com a adição das microalgas obtiveram resultados positivos na atividade antioxidante avaliada pelo índice de peróxidos. O filme contendo 2,0 % de extrato de H. luteoviridis foi o que apresentou a menor permeabilidade ao vapor de água e boas características mecânicas. Portanto, foi escolhido para aplicação em salmão. Na análise de TBARS, a oxidação lipídica foi retardada, porém ocasionou a diminuição da umidade do peixe. Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que a aplicação de biomassa de microalga H. luteoviridis e D. tertiolecta resultam em filmes biodegradáveis, com elevada atividade antioxidante, porém, com alta solubilidade, o que dificulta a aplicação em alimentos úmidos. Os filmes contendo extrato das microalgas possuem aptidão para serem aplicados em alimentos com maior teor de água. / Packaging has great importance in food industry, mainly protecting food against external contamination. However, most of the traditional packaging are produced from non-renewable and non-biodegradable sources, causing serious environmental problems. Therefore, biodegradable films and coatings have been attracting attention and interest from researchers and industries. This work studied the development of biodegradable films with antioxidant properties, using cassava starch as polymer matrix, and the addition of different concentrations of dry biomass and biomass extract of the microalgae Heterochlorella luteoviridis and Dunaliella tertiolecta. The films were characterized for their physicochemical, mechanical, barrier, optical and antioxidant properties. The film that presented the best characteristics was selected for application in salmon packaging aiming protection against lipid oxidation. In general, the addition of microalgae biomass caused an increase in the solubility, biodegradability and opacity of the films. The films with microalgae extract showed the lowest values of these parameters The addition of microalgae biomass caused an increase on elongation and rupture and a reduction on the tensile strength and Young's modulus of the films. However, the addition of microalgae extract caused an inverse effect on the mechanical characteristics of the films. All films with microalgae biomass or extract showed higher antioxidant activity evaluated by peroxide index. The film containing 2.0 % extract of H. luteoviridis was the one that presented a lowest permeability to water vapor and good mechanical characteristics. Therefore, it was chosen for application in salmon. In the analysis of TBARS, the lipid oxidation was delayed, but caused the decrease of the moisture of the fish. The results showed that the application of H. luteoviridis and D. tertiolecta microalgae biomass results in biodegradable films, with high antioxidant activity, as high solubility, which makes it difficult to apply nor moist foods. The films containing microalgae extracts suitable for use in foods with higher water content.

Biotechnology of microalgae is a fast-growing field and several species have become targets for transgenic manipulation. Microalgae provide low-cost and scalable production platforms for manufacturing recombinant proteins and other high value products. However, the exploitation of microalgae as expression systems is restricted by the low yield of recombinant proteins and the limited availability of tools for the genetic manipulation of commercially important species. This thesis explores transgene instability and gene autoregulation as causes for low recombinant protein accumulation in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii and describes the isolation of a mutant phytoene desaturase (PDS) gene which confers resistance to the herbicide norflurazon for future use as a selection marker for the marine microalga Dunaliella tertiolecta. Recombination between short dispersed DNA repeats (SDR) found in the chloroplast genome of C. reinhardtii was identified as a cause of transgene instability. The genes coding for β-glucuronidase (GUS) and peridinin-chlorophyll binding protein (PCP) were inserted in the chloroplast genome next to the atpB 3' UTR by homologous recombination. Recombination of a 30bp SDR located within the 3' UTR of atpB was identified as the cause of transgene excision in the transplastomic lines. Such transgene instability was tackled by replacing the 3' UTR of atpB with the rbcL 3' UTR from D. tertiolecta. Using this 3'UTR sequence from a different species produced a photosynthetic strain and prevented excision of the transgene by SDR recombination in all transfomants. Very low levels of recombinant GUS and PCP accumulated in chloroplast transformants when using the psbD 5' regulatory region to drive their expression. To address low levels of accumulation caused by regulatory pathways that inhibit transgene expression, I have engineered the chloroplast genome of a non-photosynthetic atpB mutant of C. reinhardtii by replacing the endogenous psbD promoter and 5'UTR with the promoter and 5'UTR of psbA. The engineered strain was subsequently transformed with the wildtype atpB and two different reporter genes driven by the psbD regulatory regions: gusA and kat, which code for GUS and the fluorescent protein Katushka respectively. Analysis of the transformants showed that accumulation of recombinant proteins in our engineered strain was 10 to 20 fold higher than in the nonengineered cells. Most of the selectable markers used in plants and algae are inefficient in Dunaliella, which is naturally resistant to many of the antibiotics used for the selection of transformants. Norflurazon inhibits PDS, an essential enzyme for carotenoid biosynthesis. Using forward genetics I have isolated, sequenced and characterised mutant PDS alleles conferring norflurazon resistance in D. tertiolecta. Independent mutations in pds, leading to substitutions R265C, S472L, S472F and L502F, all result in high resistance to norflurazon but differ in sensitivity to other bleaching herbicides. By mapping the four amino acid substitutions on 3D models of D. tertiolecta PDS I determined that R265C, S472L, S472F and L502F, cluster together in proximity to a Rossman-like domain and to aminoacids F128 and V469, previously reported to confer norflurazon resistance. This suggests that the mode of action of norflurazon is by competition with flavin adenine dinucleotide (FAD) for its binding site. A unique aspect of the R265C substitution is its negative cross-resistance to diflufenican and beflutamid which could be advantageous for its use as a positive/negative selection marker for transformation.