Le Gallid herpesvirus 2 est un virus oncogène responsable des lymphomes T chez les poulets. L´infection par ce virus est divisée en une phase lytique dépendante de l´expression des gènes très précoces ICP4 et ICP27 et une phase latente, caractérisée par l´expression de l’ARN long non codant LAT. Nous avons montré que le gène LAT exprime de transcrits épissés alternativement, plaçant le cluster de microARN mdv1-miR-M8-M10 dans leur premier intron. Un microARN de ce cluster régule l’expression d’ICP4 et ICP27. L’étude du promoteur d’ICP27 a permis d’identifier plusieurs éléments de réponse (ER) importants, dont une boîte GC et des ER AP1 et CRE, et montré que le promoteur n’est pas transactivé par la protéine virale VP16. Nous avons identifié un transcrit épissé d’ICP27, piloté par le promoteur gK et encodant une isoforme tronquée d’ICP27. Les deux isoformes d’ICP27 colocalise avec les protéines SR du splicéosome dans le noyau, mais sont associées à des localisations différentes. / Gallid herpesvirus2 (GaHV-2) is an oncogenic herpesvirus responsible of T-cell lymphoma in chicken. GaHV-2 infections are divided into a lytic phase, depending on the expression of immediate earky genes like ICP4 and ICP27, and a latent phase characterized by the expression of the long non-coding RNA LAT. In this study, we have shown that the LAT is expressed as several highly spliced transcripts, all placing the microRNA clyster mdv1-miR-M8-M10 in their first intron. One of those microRNAs regulated the expression of ICP4 and ICP27. Studies on the ICP27 promoter allowed us to identify several important response elements (REs), including a GC box and AP1 and CRE REs, and to show that the viral protein VP16 does not transactivate the promoter. We identified a spliced transcript driven by the gK promoter that encodes a truncated ICP27 isoforms. Both isoforms of ICP27 are colocalized with spliceosomal SR proteins in the nucleus, but show a slightly different localization.

La spermatogenèse est un processus cyclique de différenciation aboutissant à la production de spermatozoïdes haploïdes, à partir de spermatogonies diploïdes. Ce processus est soumis à de nombreuses régulations, notamment au niveau post-transcriptionnel. Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codant de 20 à 25 nucléotides, impliqués dans le contrôle de multiples processus biologiques, telles que la prolifération, l’apoptose et la différenciation. Afin d’étudier si les miARN pouvaient jouer un rôle dans la spermatogenèse, nous avons dans un premier temps, caractérisé les miARN exprimés lors de ce processus. Ainsi, nous avons montré que miR-34c avait une expression préférentielle dans la lignée germinale. Par ailleurs, l’expression de miR-34c n’est pas contrôlée par P53 dans les cellules germinales au contraire des cellules somatiques. Nous avons ensuite constaté que la surexpression de miR-34c dans les cellules HeLa provoquait une réorientation du transcriptome de ces cellules vers un profil germinal, ainsi que l’apparition de certains gènes préférentiellement exprimés dans le testicule. Puis, nous avons identifié les cibles de miR-34c pertinentes dans la différenciation germinale. TGIF2 et NOTCH2 constituent des cibles directes de ce miARN, impliquées dans des voies de régulation de la spermatogenèse (respectivement la voie du TGFβ et la voie Notch). Ces résultats établissent une connexion inédite entre un miARN, miR-34c, et la spermatogenèse. De plus, des cellules Souches Embryonnaires déjà engagées vers la lignée germinale (cellules ES VASA+) voient leur phénotype accentué par la surexpression de miR-34c. / Spermatogenesis is a cyclic process in which diploid spermatogonia differentiate into haploid spermatozoa. This process is highly regulated, notably at the post-transcriptional level. MicroRNAs (miRNAs), single stranded non coding RNA molecules of about 20-25 nucleotides, are implicated in the regulation of many important biological pathways such as proliferation, apoptosis and differentiation. We wondered whether miRNAs could play a role during spermatogenesis. First, miRNA expression repertory was tested in germ cells and we present data showing that miR-34c was highly expressed only in these cells. Moreover, in male gonads, miR-34c expression is largely P53-independent, in contrast to somatic cells. The exploration of the expression profile of HeLa cells over-expressing miR-34c showed a shift towards testis lineage and the presence of preferentially expressed in testis genes. Furthermore, we identified miR-34c direct target genes (TGIF2 and NOTCH2) that are involved in germ lineage differentiation control (TGFβ and Notch pathway respectively). These results established a link between a miRNA miR-34c and spermatogenesis. Moreover, in ES cells over-expressing DDX4 gene (VASA-ES cells), already primed and engaged in the germ cell lineage, ectopic expression of miR-34c has a more drastic effect. We could detect an up-regulation of germ specific genes. These data suggest that miR-34c could play a role by enhancing the germinal phenotype of cells already committed in this lineage.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants dont la principale fonction est de réprimer l’expression génique en s’hybridant par complémentarité de séquence à leurs cibles ARN. L’activité des miARN est également régulée par leurs cibles qui entrent en compétition pour leur liaison. Certains de ces ARN compétiteurs endogènes (ARNce) résistent à la répression induite par le miARN et vont alors les séquestrer. Ils sont appelés éponges à miARN. La dérégulation des réseaux d’ARNce et des éponges à miARN est impliquée dans des processus pathologiques tels que le cancer. Au cours de ma thèse, nous nous sommes intéressés à la séquestration des miARN dans le mélanome cutané. Le mélanome provient de la transformation maligne du mélanocyte, une cellule spécialisée dans la production de pigment. S’il n’est pas pris en charge à temps, des métastases apparaissent et se disséminent rapidement dans l’organisme (ganglions, foie, poumons, cerveau, etc.). Des solutions thérapeutiques existent mais une faible proportion de patients y répondent de manière efficace nécessitant de nouvelles stratégies de traitement. Nous avons mis en évidence que l’ARN messager (ARNm) de TYRP1, gène spécifiquement exprimé dans le mélanocyte et donc le mélanome, porte le rôle d’éponge à miARN dans le mélanome métastatique. Ce rôle est indépendant de la fonction protéique de TYRP1. Nous avons déterminé que l’ARNm de TYRP1 séquestre le suppresseur de tumeurs miR-16 via des sites de liaison (MRE-16) non-canoniques. Les MRE-16 non-canoniques permettent à l’ARNm de TYRP1 de ne pas être dégradé par le miR-16 et le rendent donc plus stable dans la cellule de mélanome. La majorité du pool de miR-16 est ainsi séquestrée et ne peut donc plus réprimer ses cibles intervenant dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale in vivo. Afin de remettre en activité le miR-16 au sein de la cellule de mélanome, nous avons utilisé la technologie du « target site blocker » (TSB), un oligonucléotide antisens modifié ayant une forte stabilité et affinité pour sa cible. Le TSB, spécifique du MRE-16 de l’ARNm de TYRP1, entre en compétition pour la liaison à l’ARNm de TYRP1 avec le miR-16 pour permettre sa libération et son action sur ses cibles effectrices. Nous avons montré in vitro et in vivo via un modèle murin de xénogreffe de tumeur dérivée de patient que la stratégie du TSB est efficace contre le mélanome métastatique. Ces travaux ont permis l’identification d’un nouveau mécanisme oncogénique basé sur la séquestration de miARN et proposent une nouvelle stratégie de thérapie ciblée contre le mélanome métastatique. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs. They fine tune gene-expression through specific complementary interaction with their RNA targets. The miRNA repressive function towards a given RNA is highly regulated and in part dependent on the abundance of its other targets competing for miRNA’s binding. Some of these competing endogenous RNAs (ceRNAs) can resist to miRNA-mediated RNA decay thereby sequestering miRNAs. They are named miRNA sponges. Deregulation of ceRNAs and miRNA sponges networks are implicated in many pathologic processes including cancer. My PhD work focused on miRNA sequestration in cutaneous melanoma. Melanomas arise from the malignant transformation of melanocytes; the skin-cell specialized in pigment production. Most melanoma undergoes metastatic evolution, with metastatic cells spreading rapidly in the entire organism (lymph node, liver, lungs, brain, etc.). Early and complete resection of primary in situ melanoma is thus determinant for patient outcome. Since 2010, potent therapeutic options have been developed. Unfortunately, patients ultimately develop resistance while some are non-responders. There is thus an urgent need to develop new therapeutic strategies to treat metastatic melanoma. We have identified that the Tyrosinase Related Protein 1 (TYRP1) mRNA function as a miRNA sponge. TYRP1 is specifically expressed in the melanocytic lineage. TYRP1 mRNA governs melanoma growth endorsing thereby a non-coding function. We demonstrated that TYRP1 mRNA sequesters the tumor suppressor miR-16 via non-canonical miRNA binding sites (MREs-16). Non-canonical miR-16 binding lacks mRNA decay function favoring TYRP1 mRNA stability and miRNA sequestration. Sequestered miR-16 can no more repress its canonical targets involved in cell proliferation and tumor growth. To reset miR-16’s activity and block melanoma growth, we used “Target Site Blocker” (TSB). TSBs are modified antisense oligonucleotides with enhanced stability and affinity to its target. We designed a TSB, named TSB-T3, overlapping specially TYRP1 non-canonical MRE-16. We first showed that TSB-T3 binds to TYRP1 mRNA and competes with miR-16. Freed miR-16 binds to its canonical targets inducing their decay. TSB-T3 blocks melanoma cell growth in vitro and in vivo, using patient-derived tumor xenograft. We thus showed for the first time that TSB’s strategy redirecting a tumor suppressor miRNA is a potent tool to monitor metastatic melanoma growth. Together my PhD work brings out a new oncogenic mechanism based on miRNA sequestration and proposes an original strategy of targeted therapy against metastatic melanoma.

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, les pathologies ostéo-articulaires comme l'arthrose ou la polyarthrite rhumatoïde, caractérisées par la dégradation du cartilage articulaire, deviennent de réels problèmes de santé publique. Les traitements actuels sont essentiellement symptomatiques et aboutissent en ultime recours à la pose de prothèses. En absence de réparation spontanée du tissu et de traitement efficace, des approches d'ingénierie tissulaire du cartilage sont envisagées. Les techniques actuelles reposent sur la transplantation de chondrocytes autologues mais dans la majorité des cas, cette approche n'apporte pas de résultats supérieurs aux techniques chirurgicales utilisées actuellement. Grâce à leurs propriétés de différenciation, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) représentent une nouvelle source de cellules ayant des potentiels thérapeutiques intéressants. Cependant, la complexité du processus de différenciation des CSMs vers des chondrocytes articulaires matures rend difficile l'obtention de cartilage fonctionnel après implantation. Il est donc important de mieux comprendre le processus de différenciation de ces cellules afin de mieux contrôler leur devenir in vivo. C'est pourquoi, le laboratoire s'intéresse au rôle des micro-ARNs (miARNs) dans la régulation du processus de différenciation des CSMs. L'objectif de mon projet de thèse a consisté à identifier des miARNs modulés dans la différenciation chondrocytaire des CSM humaines primaires et à étudier leur rôle et leur régulation au cours de la chondrogenèse. Nous avons identifié deux miARNs : miR-29a dont l'expression diminue progressivement au cours de la différenciation et miR-574-3p dont l'expression augmente rapidement puis est maintenue jusqu'à la fin de la différenciation. Ces deux miARNs sont régulés par le facteur de transcription SOX9 mais de manière opposée : SOX9 inhibe miR-29a et induit miR-574-3p. Nous montrons que SOX9 interagit avec YY1 pour réguler miR-29a mais pas miR-574-3p, ce qui pourrait expliquer les effets opposés de SOX9 sur l'expression des deux miARNs. Nous montrons également que ces miARNs sont des inhibiteurs de la différenciation chondrocytaire et avons identifié FOXO3A et RXRα comme cibles respectives de miR-29a et miR-574-3p. L'inhibition de FOXO3A ou RXRα avant l'induction de la différenciation, en utilisant des siARNs spécifiques ou en sur-exprimant les miARNs correspondants, bloque la différenciation des CSM. Ces résultats confirment sur des CSMs adultes, que ces protéines jouent un rôle important dans la chondrogenèse et que miR-29a et miR-574-3p participent aux processus de régulation de la différenciation chondrocytaire. En conclusion, nous avons identifié deux nouveaux miARNs contrôlés par SOX9 et régulant négativement la chondrogenèse grâce à la modulation de deux gènes cibles, dont l'expression est nécessaire avant d'induire la différenciation chondrocytaire. / Roles of miR-29a and miR-574-3p during the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. With the constant increase of the lifespan, osteoarticular pathologies such as osteoarthritis or rheumatoid arthritis, characterized by articular cartilage degradation, are important public health problems. In absence of spontaneous regeneration, cartilage engineering approaches are being considered. Current techniques rely on autologous chondrocyte transplantation but in the majority of cases, this approach gives similar results as current surgeries. Due to their capacity of differentiation toward chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) represent a new source of cells with therapeutic potential. However, production of a functional cartilage in vivo after implantation of expanded MSC is hampered by the difficulty to reproduce the complexity of the differentiation process to get mature chondrocytes from MSC. The objective of my Ph.D thesis aimed to identify micro-RNAs (miRNAs) modulated during chondrogenic differentiation of primary human MSCs and to study their role as well as their regulation in this process. We identified two miRNAs: miR-29a whose expression decreases progressively during the differentiation and miR-574-3p whose expression rapidly increases and stays constant until the end of the differentiation. Both miRNAs are regulated by the transcription factor Sox9 but in an opposite manner: Sox9 inhibits miR-29a and induces miR-574-3p. We show that YY1 directly interact with Sox9 to regulate miR-29a but not miR-574-3p; this interaction likely explaining the opposite effects of Sox9 on miR-29a and miR-574-3p expression. Moreover we showed that miR-29a and miR-574-3p are both inhibitors of chondrogenesis and we identified FOXO3A and RXRα as their respective targets. In conclusion, we identified two new miRNAs which are regulated by Sox9 and inhibitors of chondrogenesis. They act through the modulation of two target genes, whose role during chondrogenic differentiation of adult MSC was previously not characterized.

Les micro-ARNs (miRNAs) sont de petits ARNs (20-25 nt) qui ont un rôle important dans les mécanismes d'interférence ARN. Les miRNAs sont des inhibiteurs de l'expression génique qui interviennent au niveau post-traductionnel en s'hybridant à des sites spécifiques de leurs ARNm cibles. Ce mécanisme induit la dégradation de l'ARNm ou l'inhibition de sa traduction. Puisque l'hybridation partielle du miRNA est suffisante pour induire une inhibition, chaque miRNA peut avoir des centaines de cibles. Les miRNAs sont impliqués dans de nombreuses fonctions biologiques et en particulier dans processus neuronaux. Plus de la moitié des miRNAs connus sont exprimés dans le cerveau de mammifère avec une distribution spécifique du miRNA considéré. A l'échelle sub-cellulaire il y a également une distribution hétérogène des miRNAs. De plus, il a été montré récemment une implication des miRNAs dans la régulation de la traduction locale dans les neurones. En effet, des miRNAs et des protyeines impliquées dans la biogenèse et la fonction des miRNAs ont été retrouvés dans le soma, les dendrites et les axones. Il a été montré que la dérégulation des miRNAs été impliquée dans de nombreux mécanismes pathologiques. Cette thèse a pour objectif de révéler le rôle des miRNAs dans la plasticité synaptique. Nous avons étudié l'implication des miRNAs dans les mécanismes de la plasticité synaptique homéostatique et dans la plasticité dysfonctionnelle rencontrée en condition de douleur cancéreuse.Notre hypothèse était que la régulation de la traduction locale des récepteurs AMPA dans les dendrites en condition d'homéostasie synaptique implique les miRNAs. Par bio-informatique, qRT-PCR et test luciférase, nous avons identifié le miRNA miR-92a comme régulateur de la traduction de l'ARNm de GluA1. Des immunomarquages des récepteurs AMPA et des enregistrements des courants miniatures AMPA montrent que miR-92a régule spécifiquement l'incorporation synaptique de nouveau récepteurs AMPA contenant GluA1 en réponse à un blocage de l'activité synaptique. La douleur est un symptôme très fréquemment associé au cancer et constitue un challenge pour les médecins puisque aucun traitement spécifique et efficace n'existe. C'est sans doute le résultat d'un manque de connaissances des mécanismes moléculaires responsables de la douleur cancéreuse. En combinant les screening des miRNA et des ARNm, nous avons mis en évidence une voie de régulation impliquant miR-124, un miRNA enrichi dans le système nerveux. Ainsi, dans un modèle de douleur cancéreuse chez la souris, la diminution de miR-124 est associée à une augmentation de ces cibles : calpain 1, synaptopodine et tropomyosine 4. Toutes ces protéines ont précédemment été identifiées comme des molécules clef de la fonction et de la plasticité synaptique. Des experiences in vitro ont confirmé que miR-124 exercait une inhibition multiple de calpain 1, synaptopodine et tropomyosine 4. La pertinence clinique de cette découverte a été vérifiée par le screening du liquide cérébro-spinal de patients souffrant de douleur cancéreuse qui montre également une diminution de miR-124. Ce résultat suggère un fort potentiel thérapeutique du ciblage de miR-124 dans les douleurs cancéreuses. Enfin, l'injection intrathécale de miR-124 dans des souris cancéreuses a permis de normaliser l'expression de la synaptopodine et de stopper la douleur cancéreuse lors de la phase initiale de la maladie. / MicroRNAs (miRNAs) are a type of small RNA molecules (21-25nt), with a central role in RNA silencing and interference. MiRNAs function as negative regulators of gene expression at the post-transcriptional level, by binding to specific sites on their targeted mRNAs. A process results in mRNA degradation or repression of productive translation. Because partial binding to target mRNA is enough to induce silencing, each miRNA has up to hundreds of targets. miRNAs have been shown to be involved in most, if not all, fundamental biological processes. Some of the most interesting examples of miRNA activity regulation are coming from neurons. Almost 50% of all identified miRNAs are expressed in the mammalian brain. Furthermore, miRNAs appear to be differentially distributed in distinct brain regions and neuron types. Importantly, miRNAs are reported to be differentially distributed at the sub-cellular level. Recently, miRNAs have been suggested to be involved in the local translation of neuronal compartments. This has been derived from the observations reporting the presence of miRNAs and the protein complexes involved in miRNA biogenesis and function in neuronal soma, dendrites, and axons. Deregulation of miRNAs has been shown to be implicated in pathological conditions. The present thesis aimed at deciphering the role of miRNA regulation in neuronal plasticity. Here we investigated the involvement of miRNA in synaptic plasticity, specifically in homeostatic synaptic plasticity mode. In addition, we investigated the involvement of miRNAs in the maladaptive nervous system state, specifically, in bone cancer pain condition.We hypothesized that local regulation of AMPA receptor translation in dendrites upon homeostatic synaptic scaling may involve miRNAs. Using bioinformatics, qRT-PCR and luciferase reporter assays, we identified several brain-specific miRNAs including miR-92a, targeting the 3’UTR of GluA1 mRNA. Immunostaining of AMPA receptors and recordings of miniature AMPA currents in primary neurons showed that miR-92a selectively regulates the synaptic incorporation of new GluA1-containing AMPA receptors during activity blockade.Pain is a very common symptom associated with cancer and is still a challenge for clinicians due to the lack of specific and effective treatments. This reflects the crucial lack of knowledge regarding the molecular mechanisms responsible for cancer-related pain. Combining miRNA and mRNA screenings we were able to identify a regulatory pathway involving the nervous system-enriched miRNA, miR-124. Thus, miR-124 downregulation was associated with an upregulation of its predicted targets, Calpain 1, Synaptopodin and Tropomyosin 4 in a cancer-pain model in mice. All these targets have been previously identified as key proteins for the synapse function and plasticity. Clinical pertinence of this finding was assessed by the screening of cerebrospinal fluid from cancer patient suffering from pain who presented also a downregulation of miR-124, strongly suggesting miR-124 as a therapeutic target. In vitro experiments confirmed that miR-124 exerts a multi-target inhibition on Calpain 1, Synaptopodin and Tropomyosin 4. In addition, intrathecal injection of miR-124 was able to normalize the Synaptopodin expression and to alleviate the initial phase of cancer pain in mice.

L'activation chronique du stress du réticulum endoplasmique (RE) est une caractéristique commune à de nombreux cancers. De façon générale, toutes perturbations susceptibles d'induire une altération de l'homéostasie protéique activent un stress du RE. Afin de s'adapter, les cellules mettent en place une réponse nommée UPR pour Unfolded Protein Response. Ce programme d'adaptation est relayé par trois protéines localisées dans la membrane du RE (i) la protéine IRE1 (Inositol Requiring Enzyme 1) (ii) le facteur de transcription ATF6 (Activating Transcription Factor 6) (iii) la protéine kinase PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase). Parmi ces protéines, IRE1 est la seule à être conservée au cours de l'évolution. Elle possède deux activités enzymatiques, sérine/thréonine kinase et endoribonucléase. Sa cible la plus connue est l'ARNm de XBP1 (X-box Binding Protein 1) qui subit un épissage non conventionnel cytoplasmique conduisant à un décalage de phase. Ainsi, l'ARNm est traduit en un facteur de transcription actif, XBP1s (s,spliced). Le rôle de l'UPR a été particulièrement étudié dans les cancers solides. En revanche, les connaissances actuelles sur le rôle précis du stress du RE en général, et de la voie IRE1/XBP1 en particulier dans hémopathies malignes sont extrêmement parcellaires. Une étude clinique démontre que l'expression de XBP1s est corrélée à un meilleur pronostic chez les patients atteints de leucémies aiguës myéloïdes (LAMs). Cependant aucune étude fonctionnelle ne permet actuellement d'expliquer cette corrélation. Afin d'appréhender le rôle de XBP1, nous avons donc mis en place un modèle d'expression inductible dans des cellules leucémiques. L'étude de ce modèle a permis de mettre en évidence une chimiosensibilité accrue à l'aracytine, la doxorubicine et l'étoposide dans les cellules exprimant XBP1s. Nous avons pu démontrer que l'activation spécifique de la voie XBP1 active une réponse apoptotique et inhibe la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe. De façon à caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents et de mettre en évidence de nouvelles cibles, nous avons réalisé une expérience d'immunoprécipitation de la chromatine suivi d'un séquençage. Nous avons pu ainsi identifier le long ARN non codant MIR22HG, précurseur du microARN 22 comme étant une cible directe de XBP1. De nombreuses cibles caractérisées de ce microARN se classent dans la catégorie des oncogènes. Parmi ces cibles la Sirtuine 1 est surexprimée chez les patients et jouerait un rôle pro-survie dans la réponse aux dommages à l'ADN intervenant ainsi dans la résistance au traitement. Ces résultats suggèrent que le microARN 22 pourrait être un marqueur prédictif de la réponse au traitement dans les LAMs. Dans un second temps, nous avons étudié la régulation de XBP1 par un oncogène majeur, FLT3-ITD (Fms-Like Tyrosine kinase-3 receptor - Internal Tandem Duplication) et mis en évidence un mécanisme de rétrocontrôle inattendu entre ces deux acteurs, suggérant ainsi que l'expression de XBP1 peut être dérégulée dans les LAM. Ainsi l'ensemble de nos résultats permet d'appréhender le rôle et la régulation de XBP1 dans leucémies aiguës myéloïdes et pourrait, à terme, permettre de développer de nouveaux biomarqueurs utiles dans la prise en charge des patients atteints de LAM. / Endoplasmic reticulum stress activation is a common feature of cancer cells. Generally, endoplasmic reticulum (ER) stress is triggered by any situation inducing an accumulation of misfolded proteins in the ER. To cope with these perturbations, cells set off a conserved and adaptive intracellular signaling known as UPR or Unfolded Protein Response. UPR involves the activation of three sensors which are transmembrane proteins of ER (i) IRE1 (Inositol Requiring Enzyme 1), (ii) ATF6 (Activation Transcription Factor 6) and (iii) PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase). IRE1 is the most conserved branch of the three pathways and signals through two catalytic domains: a kinase and an RNAse L like endoribonucleolytic domains. Its most described target is the mRNA of the transcription factor XBP1 (X-box Binding Protein). IRE1 participates to the non-conventional splicing of XBP1 mRNA (XBP1s,spliced) leading to a frameshift and the expression of a potent transcription activator. In solid tumors, the implication of ER stress has been well characterized; however, the current knowledge on the precise role of the UPR in hematological malignancies, notably in leukemia, is extremely poor. A clinical study conducted by Schardt et al. highlighted a correlation between XPB1s activation and a favorable prognosis in acute myeloid leukemia (AML). Firstly, in order to decipher on the role of XBP1, we set up a model enabling the inducible expression of XBP1s in leukemic cells. In this model, XBP1s expression potentiates the effect of chemotherapeutic treatments, aracytine, doxorubicin and etoposide. We also report that XBP1s expression induces apoptosis and inhibits tumor growth in xenograft model. In order to characterize molecular mechanism and new targets, we perform a chromatin immunoprecipitation followed by sequencing. We thus identify the long non-coding MIR22HG, precursor of the microRNA 22 as a direct XBP1 target gene. Many miR-22 targets are classified as oncogenes. Among these targets, Sirtuin 1 is overexpressed in AML patients and could act as a pro-survival factor upon DNA damages, causing drug resistance. These results suggest that miR-22 could be a potent chemotherapeutic response biomarker in AML patients. Secondly, we study XBP1 regulation by the major AML oncogene FLT3-ITD (Fms-Like Tyrosine kinase-3 receptor - Internal Tandem Duplication) and highlight an unexpected feedback mechanism suggesting that XBP1 expression could be deregulated in AML. Taken together these results enable a better understanding of the role and regulation of XBP1 in acute myeloid leukemia and could, in the longer term, enable the development of new useful biomarkers in the management of patients.

La littérature indique que les miARN sont régulés à plusieurs niveaux de leur biogenèse et de leur activité. Cependant, il existe très peu d’information concernant la régulation de la stabilité des miARN. Le projet de thèse a consisté à étudier la dégradation spécifique d’un miRNA cellulaire (miR-27) induite par un transcrit viral (m169) au cours de l’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV). Ce miARN est déstabilisé par un mécanisme moléculaire appelé ‘target-RNA directed miRNA degradation’ (TDMD). En suivant deux grands axes de recherche j’ai entrepris : premièrement l’étude et la caractérisation des déterminants moléculaires et des facteurs cellulaires impliqués dans le mécanisme de TDMD ; puis dans un second temps, la mise en place d’une approche protéomique permettant l’identification des partenaires de la protéine AGO2 potentiellement impliqué dans le TDMD dans des cellules infectées ou non par le MCMV. / Several regulatory mechanisms have been uncovered at every level of the biogenesis and the activity of miRNAs. However, there is less information about the regulation of the stability of miRNAs. The PhD project entailed the study of a process, which specifically enables the degradation of a cellular miRNA (miR-27) induced by a viral transcript (m169) during an infection by the mouse cytomegalovirus (MCMV). This miRNA is destabilized by a process called ‘target-RNA directed miRNA degradation’ (TDMD). I first undertook the study and the characterization of the molecular determinants and the cellular factors implicated in TDMD. Moreover, I started to set up a protocol in order to identify AGO2 partners of viral or host origin during MCMV infection, which would potentially be implicated in TDMD.

Les laminopathies regroupent des pathologies liées aux lamines. La Progeria est due à une mutation du gène LMNA entrainant la synthèse d’une protéine anormale : la progérine. Elle s’accumule dans le noyau et entraîne des dommages cellulaires aboutissant à une sénescence prématurée, à l’origine d’un vieillissement prématuré et accéléré des patients dont le décès survient vers l’âge de 14 ans. Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non-codants régulant l’expression des gènes. Dans le projet principal de ma Thèse, nous avons identifié par un miRNome en RT-qPCR, 14 miRs différentiellement exprimés dans les fibroblastes HGPS. Certains d’entre eux appartenant à la région 14q32.2-14q32-3, sont surexprimés à cause de modifications chromatiniennes. Nous avons ensuite étudié l’impact de la surexpression des miR-376a-3p et miR-376b-3p sur la régulation de l’autophagie. L’inhibition de ces miRNAs entraine une augmentation du niveau d’autophagie, associée à une diminution de la progérine. Une 2ème étude miRNome réalisée en NGS, a permis d’identifier d’autres miRNAs potentiellement impliqués dans la Progeria. Dans un second projet, nous avons analysé l’expression des lamines de type A dans des cellules tumorales métastatiques issues d’épanchements pleuraux de patients atteints d’adénocarcinome bronchique. Nous avons démontré que la diminution d’expression de la lamine A chez un groupe de patient est corrélée à un mauvais pronostic. Cette diminution pourrait être due à miR-9 qui cible directement l’ARNm de la prélamine A. Ces travaux de Thèse illustrent le rôle fondamental des lamines et suggère une place importante des miRNAs dans la physiopathologie de ces 2 types de laminopathies / Laminopathies are diseases linked to lamins. Progeria (HGPS) is a genetic disease caused by a mutation in LMNA gene leading to an abnormal protein called progerin. It accumulates in nucleus and causes cell damages leading to a premature senescence. Patient die around 14 years old. miRNAs are small non coding RNA regulating gene expression. In my main project, I identified with a miRNome approach by RT-qPCR, 14 differentially expressed miRNAs in dermal HGPS fibroblasts. We demonstrated that the overexpression of the miRNAs that belong to the 14q32 region was caused by chromatin modulation. Next, we studied the role of miR-376-3p and miR-376b-3p on autophagy and demonstrated that the inhibition of their overexpression increases autophagy and decreases progerin. A second miRNome by NGS identified other miRNAs potentially linked to HGPS pathophysiology. In my second project, I studied lamins expression in metastatic cells from pleural effusion of lung adenocarcinoma patients. We showed that the decreased expression of lamin A in a group of patients was correlated with poor prognosis, which could be linked to miR-9 expression. This thesis illustrates the fundamental role of lamins and suggest the role of miRNAs in the pathophysiology of this to types of laminopathies.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la plus fréquente des leucémies qui touchent le monde occidental. Cette pathologie est toujours incurable et se caractérise par une hétérogénéité d’évolution clinique marquée par une survie globale oscillant de quelques mois à des dizaines d’années. Il est donc primordial de savoir à quel type d’évolution le patient sera confronté afin d’adapter au mieux le suivi de la maladie et la précocité ou non du traitement. Au cours de ce travail, nous avons comparé les facteurs pronostiques les plus courants (stade de Binet, statut mutationnel des IgVHs, expression de ZAP70, du CD38 et de la LPL) afin d’évaluer leur association avec la survie sans traitement (treatment-free survival ou TFS) et la survie globale (overall survival ou OS) tout en mettant au point une technique de mesure de ZAP70 par PCR quantitative en temps réel (qPCR). Cette étude a conclu que ZAP70 mesuré par qPCR est un puissant facteur pronostique et le meilleur facteur de substitution du statut mutationnel parmi l’ensemble des marqueurs testés. Nous avons également mis en évidence que le temps de doublement du CD23 soluble (TDCD23s), un nouveau facteur pronostique associé à la dynamique de la maladie, pouvait prédire le TFS, l’OS mais également affiner le pronostic des patients. Finalement, nous avons démontré que la diminution de deux microARNs, miR-29c et miR-223, était fortement corrélée à une LLC agressive, une masse tumorale élevée et à d’autres facteurs de mauvais pronostic. De plus, l’association du pouvoir pronostique de ces deux microARNs avec celui de ZAP70 et de la LPL a permis de générer un score qPCR (de 0 à 4 facteurs de mauvais pronostic) permettant littéralement de stratifier le risque de besoin de traitement et la survie des patients LLC. Dans le but de comprendre les différences géniques entre les patients de bon et de mauvais pronostic, nous avons comparé le transcriptome de patients différant fortement pour l’expression de ZAP70. 27 gènes ont ainsi été mis en évidence comme différentiellement exprimés avec un FDR<10%, 135 avec une P<0.001 et 932 sondes avec P<0.05. Parmi ces gènes, nombreux sont capables de prédire le TFS et l’OS. Une analyse bioinformatique de type « gene set enrichment » a révélé la sur-représentation de gènes impliqués dans l’adhésion et la migration. Nous avons donc évalué la capacité d’adhésion et de migration de cellules de LLC issues de patient à pronostic différent au sein d’un microenvironnement stromal et en réponse à du milieu conditionné par les cellules stromales. De cette manière, avons démontré les meilleures capacités d’adhésion, de migration et de réponse aux stimuli du microenvironnement des cellules ZAP70+. Ces observations nous ont amenés à conclure que la classification d’un patient en bon ou mauvais pronostic selon de nombreux marqueurs n’est qu’un reflet de la capacité des cellules leucémiques à interagir avec leur microenvironnement et que la faculté des cellules ZAP70+ à adhérer/migrer dans leur microenvironnement explique leur meilleure survie et donc l’agressivité de la maladie. Le troisième volet de cette thèse s’est intéressé à une nouvelle stratégie thérapeutique pour la LLC : nous avons observé, in vitro, que l’acide valproïque (VPA) induisait l’apoptose des cellules de LLC en ciblant de nombreux gènes anti- et pro-apoptotiques. De plus, nos expériences ont démontré que le VPA pouvait inhiber la prolifération des cellules leucémiques en perturbant l’expression des gènes du cycle cellulaire. Finalement, l’association du VPA à différentes drogues chimiothérapiques augmente la chimiosensibilité des cellules de LLC. L’ensemble de ces résultats supporte fortement l’utilisation du VPA dans le traitement de la LLC, en particulier en combinaison avec d’autres agents antileucémiques.

THÈME DE RECHERCHE : Le phénotype callipyge est une hypertrophie musculaire généralisée post-natale décrite chez le mouton (introduit dans le Chapitre 1). Son mode de transmission non mendélien, qualifié de surdominance polaire, est unique : seuls les hétérozygotes ayant reçu la mutation callipyge (CLPG) de leur père expriment le phénotype. La mutation CLPG, localisée dans un domaine soumis à l'empreinte parentale, est une mutation ponctuelle (SNP) détruisant un élément qui contrôle, en cis, le taux dexpression musculaire des gènes voisins. L'hypertrophie musculaire, sans doute causée par l'expression ectopique de la protéine DLK1 chez les animaux +mat/Cpat, n'est pas observée chez les animaux Cmat/Cpat dont l'allèle maternel apparaît trans-inactiver la traduction du messager DLK1. Cette thèse a pour objectif d'approfondir notre compréhension de la surdominance polaire, aussi bien au travers de l'étude des mécanismes impliqués dans l'effet de contrôle à longue distance en cis de la mutation que de la caractérisation des inhibitions en trans induites par les transcrits maternels sur les messagers paternels. RÉSULTATS : L'étude de l'effet en cis (Chapitre 2) a démontré que la mutation CLPG se différenciait de l'allèle sauvage par au moins trois marques épigénétiques distinctes : (i) l'hypométhylation de l'ADN à proximité du SNPCLPG, (ii) la création d'un site d'hypersensibilité à la DNase, et (iii) l'activation de la transcription bidirectionnelle de la région autour de la mutation. En démontrant que la mutation inactivait bel et bien un élément de contrôle à longue distance, ces données nous ont permis d'élaborer un modèle plus précis de la surdominance polaire. L'étude de la trans-inhibition des transcrits protéiques à expression paternelle par les transcrits non codants maternels (Chapitres 3 et 4) se fondait sur l'hypothèse d'une implication des nombreux microARNs (miRNAs) du domaine DLK1-GTL2. Nous avons ainsi pu montrer que les cinq miRNAs abrités par anti-PEG11 étaient capables, par leur parfaite complémentarité de séquence, de cliver le messager PEG11 (Chapitre 3). Bien que le rôle de la protéine PEG11 dans le phénotype callipyge soit inconnu, cette étude a néanmoins démontré l'existence d'une trans-inhibition entre les deux allèles du locus, tout en identifiant le premier cas de dégradation miRNA/cible impliquant des gènes soumis à l'empreinte chez les mammifères. L'étude de la trans-inhibition appliquée au messager DLK1 (Chapitre 4) a quant à elle nécessité la génération par séquençage haut débit d'un catalogue exhaustif des miRNAs du muscle squelettique ovin. Ce travail nous a permis de démontrer que les miRNAs du domaine DLK1-GTL2 étaient bien exprimés maternellement et eux aussi soumis à l'effet en cis de la mutation. Si aucun miRNA capable d'inhiber le messager DLK1 n'a été identifié sans ambiguïté, nos analyses d'affinité ont toutefois révélé un effet significatif de miR-376c sur sa 3'UTR, ainsi que de l'ensemble des miRNAs du locus DLK1-GTL2 sur sa région codante. Notons que nous avons également considéré comme potentiels candidats à la trans-inhibition les snoRNAs du locus, de même que les miRNAs du locus soumis à l'édition ARN. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES : À l'issue de cette thèse, nous avons donc contribué à la compréhension du phénomène de surdominance polaire au locus DLK1-GTL2 du mouton callipyge. Si de nombreuses questions restent en suspend, elles devraient néanmoins trouver réponse grâce aux nouveaux outils d'analyse en cours de développement. Ainsi, deux lignées de souris transgéniques développées dans notre laboratoire, respectivement porteuses de la mutation CLPG ou surexprimant PEG11 dans le muscle, éclaireront les mécanismes moléculaires de l'effet en cis de la mutation ainsi que le rôle de PEG11 dans l'établissement du phénotype callipyge. Par ailleurs, pour confirmer in vivo l'effet inhibiteur sur DLK1 des miRNAs identifiés dans notre étude, les progrès apportés par le séquençage haut débit (notamment le HITS-CLIP) et la transfection en modèle cellulaire se révéleront sans doute d'une grande aide. / RESEARCH OVERVIEW: The callipyge phenotype is a generalized muscular hypertrophy described in sheep (see Chapter 1). It features a non-mendelian mode of inheritance termed polar overdominance: only heterozygous animals having inherited the mutation from their father display the phenotype. The callipyge mutation (CLPG), which falls in an imprinted domain, is a single-nucleotide polymorphism (SNP) that disrupts a putative long-range control element affecting, in cis, the expression level of neighboring imprinted genes in skeletal muscle. The callipyge phenotype is thought to be caused by ectopic expression of DLK1 protein in +mat/Cpat animals. In contrast, Cmat/Cpat animals exhibit a wild-type phenotype that is certainly due to a trans-inhibition from the maternal allele on DLK1 translation. The objective of our thesis was to improve our knowledge of polar overdominance, both by studying mechanisms of long-range cis regulation and by characterizing the trans effect of maternal noncoding transcripts on the paternally-expressed messenger RNAs. RESULTS: Our study of the cis effect (Chapter 2) showed that the CLPG mutation differs from the wild-type allele by at least three distinct epigenetic marks: (i) DNA hypomethylation in the vicinity of the SNPCLPG, (ii) creation of a DNase-hypersensitive site, and (iii) activation of a bidirectional transcription start site centered on the mutation. Altogether, our data provided strong evidence for the SNPCLPG inactivating a long-range control element and allowed us to refine our model of polar overdominance. Our working hypothesis for the trans-inhibition of paternally-expressed genes by maternal noncoding transcripts (Chapters 3 and 4) involved microRNAs (miRNAs) from the DLK1-GTL2 domain. In this respect, we showed that five miRNAs from anti-PEG11 were able to cleave PEG11 transcript, owing to perfect sequence complementarity (Chapter 3). This study was the first demonstration of miRNA-mediated RNAi involving imprinted genes in mammals. Furthermore, it allowed us to confirm the existence of a trans-inhibition between both alleles in the domain, albeit the role of PEG11 protein in the callipyge phenotype is still unknown. To study the trans-inhibition of DLK1 messenger (Chapter 4), we used high-throughput sequencing to build an exhaustive catalogue of skeletal muscle-specific miRNAs in sheep. Our analyses showed that miRNAs from the DLK1-GTL2 domain are maternally expressed and affected by the cis effect of the CLPG mutation. Even if we could not find miRNAs unambiguously able to repress DLK1 transcript, affinity analyses revealed a significant effect on its 3' UTR for miR-376c, as well as on its coding region for all miRNAs considered as team. Of note, we also investigated snoRNAs and miRNAs subjected to RNA editing in the DLK1-GTL2 locus. CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES: During the course of this research, we contributed to improve the understanding of polar overdominance in the sheep DLK1-GTL2 locus. Although many questions remain, most will eventually be answered thanks to upcoming analysis tools. Hence, our lab has already generated two transgenic mouse lines, either carrying the CLPG mutation or over-expressing PEG11 in skeletal muscle. These mice should respectively shed light on the molecular mechanisms underlying the cis effect of the CLPG mutation and on the role of PEG11 in the callipyge phenotype. Finally, to confirm inhibiting effects of miRNAs identified in our study, technological improvements granted by high-throughput sequencing (such as HITS-CLIP) and miRNAs transfection in cell model systems will both prove to be very useful.