Esta investigación tiene como objetivo diseñar la infraestructura y el sistema que permita monitorear el crecimiento de un microorganismo, relacionado a cultivos peruanos, en el espacio exterior en un picosatélite como carga útil, totalmente autónomo, para ser comparado con un experimento idéntico y simultáneo en Tierra. El experimento considera: asegurar que el inicio se dé cuando el satélite se encuentre en órbita, por lo tanto el microorganismo estará en estado de latencia hasta el momento que se envíe la señal de inicio; monitorear el crecimiento del microorganismo mediante la toma de fotografías y el sensado de las condiciones del ambiente como temperatura y humedad relativa. Todo esto debe ser controlado por un sistema integral y soportarse sobre los sub-sistemas de comunicación y energía del picosatélite. Esta investigación ha logrado identificar los componentes necesarios para llevar a cabo este experimento bajo las condiciones descritas, diseñando un sub-sistema para el control del inicio del experimento utilizando una microválvula, diseñando un subsistema que cuenta con una cámara fotográfica, iluminación artificial y un lente que asegurará la correcta visualización de manera uniforme y diseñando un sub-sistema de monitoreo de temperatura y humedad relativa. Todos estos sub-sistemas se controlan desde el microprocesador central del picosatélite. Se presenta como resultado de este diseño un prototipo de la infraestructura y sub-sistema de inicio, simulaciones de toma de fotografías y pruebas de utilización del sensor de temperatura y humedad relativa. Con esta investigación se obtiene un primer estudio y diseño para el desarrollo de esta carga útil, que posteriormente debe ser implementada y ensamblada junto con todos los componentes del picosatélite.

La proteína CarD es un regulador transcripcional de acción global en la bacteria Myxococcus xanthus, que se requiere para la actividad de varios factores σ-ECF (extracytoplasmatic function). CarD presenta una arquitectura de dominios única, con un dominio C-terminal de unión al DNA similar a las proteínas eucarióticas HMGA (high-mobility group A), y un dominio N-terminal, típicamente bacteriano, que define a la familia de proteínas PF02559. Dicha familia incluye el dominio de interacción con la polimerasa de RNA de los factores TRCF (que acoplan la reparación del DNA con la transcripción), y un grupo de proteínas ampliamente distribuidas y poco estudiadas, cuyo miembro en M. xanthus hemos denominado CdnL (CarD N-terminus Like), para distinguirlo de CarD, ya que ambas proteínas coexisten en esta bacteria. En este trabajo se ha determinado la estructura de CdnL, una proteina esencial para la viabilidad en M. xanthus, así como del dominio N-terminal de la proteína homóloga de Thermus thermophilus y se ha realizado un análisis mutacional exhaustivo para establecer la relación estructura-función. Los resultados indican que CdnL utiliza su dominio N-terminal, que adopta una estructura similar a los dominios Tudor, para interaccionar con la subunidad β de la polimerasa de RNA (βRNAP), y que la superficie de contacto CdnL-βRNAP está conservada en relación con otros miembros de la familia. Asimismo, se ha demostrado que la interacción CdnL-βRNAP es fundamental para la función de CdnL. El dominio C-terminal de CdnL, también necesario para su función, adopta una estructura compacta con cinco hélices α en disposición antiparalela, en la que destaca una superficie de residuos no polares y básicos expuestos al solvente. Varios de dichos residuos básicos juegan un papel clave, pendiente de determinar, en la función de CdnL. Además, CdnL, pero no los mutantes de pérdida de función in vivo, estabiliza in vitro la formación del complejo abierto formado por la RNAP unida al factor σ principal, σA, en un promotor de rRNA. Consistente con estos datos, CdnL se localiza in vivo en los promotores de rRNA. Que CdnL se requiera para la actividad del holoenzima RNAP-σA y CarD para la de factores σ-ECF en M. xanthus ilustra cómo dos miembros de una misma familia han evolucionado para actuar sobre promotores dependientes de distintos factores σ. Como la proteína CdnL de M. xanthus, su homólogo en Mycobacterium tuberculosis, pero no en Bacillus subtilis, es esencial para la viabilidad celular, interacciona con la βRNAP, y se requiere para la activación de la transcripción del rRNA. Para evaluar el grado de conservación evolutiva de la función de CdnL, en este trabajo se ha estudiado también la proteína homóloga (CcCdnL) de Caulobacter crescentus, una alfaproteobacteria modelo de estudio para diversos procesos celulares. Los resultados obtenidos indican que CcCdnL es esencial, interacciona con la βRNAP, y se localiza en los promotores de rRNA activando su transcripción in vivo. Estos resultados sugieren que la función esencial de CdnL y su modo de acción, más allá de alguna posible excepción, están conservados en distintos grupos taxonómicos bacterianos. CcCdnL, cuya expresión es constitutiva, es sustrato de la proteasa ClpXP. Sin embargo, el aumento en los niveles intracelulares de CcCdnL por falta de la degradación mediada por ClpXP no provoca efectos adversos sobre el crecimiento. Una peculiaridad de las mutaciones de falta de función en CcCdnL, en relación con las mutaciones equivalentes en sus homólogos de M. xanthus y M. tuberculosis, es su criosensibilidad, que podría resultar de diferencias intrínsecas entre los distintos homólogos, o de diferencias en la estabilidad intrínseca de los complejos abiertos de transcripción formados por la distintas RNAP. / The CarD protein is a global transcriptional regulator in the bacterium Myxococcus xanthus that is required for the activity of various ECF (extracytoplasmatic function) σ factors. CarD has a unique domain architecture with a C-terminal DNA binding domain similar to eukaryotic HMGA (high- mobility group A) proteins and an N-terminal, typically bacterial, domain that defines the protein family PF02559. This family includes the RNA polymerase interaction domain of TRCF factors (that couple DNA repair with transcription) and a group of widely distributed but poorly studied proteins, whose member in M. xanthus we named CdnL (CarD N-terminus Like) to distinguish it from CarD, since both proteins co-exist in this bacterium. In this work, the structure of CdnL, a protein essential for M. xanthus viability, as well as that of the N-terminal domain of the homologous protein in Thermus thermophilus have been determined, and an extensive mutational analysis has been carried out to establish structure-function relationships. The results indicate that CdnL utilizes its N-terminal domain, which adopts a structure similar to Tudor domains, to interact with the β subunit of RNA polymerase (βRNAP), and that the CdnL-βRNAP contact surface is conserved relative to other members of this family. Furthermore, the CdnL-βRNAP interaction is shown to be critical for CdnL function. The CdnL C-terminal domain, also required for its function, adopts a compact structure composed of five antiparallel  helices, whose striking feature is the presence of a solvent-exposed nonpolar-basic patch. Several of these basic residues play a key role, which remains to be determined, in CdnL function. Moreover, CdnL, but not its loss-of-function mutants, stabilizes in vitro the formation of open complexes at rRNA promoters by RNAP holoenzyme containing σA, the principal σ factor in M. xanthus. Consistent with these data, CdnL localizes to rRNA promoters in vivo. That CdnL is required for activity of the RNAP-σA holoenzyme and CarD for that of ECF-σ factors in M. xanthus illustrates how two members of the same family have evolved to act on promoters dependent on distint σ factors. Like M. xanthus CdnL, its homologue in Mycobacterium tuberculosis, but not in Bacillus subtilis, is essential for cellular viability, interacts with βRNAP, and is required for the activation of rRNA transcription. To assess the degree of evolutionary conservation of CdnL function, we also studied the homologue (CcCdnL) in Caulobacter crescentus, a model alphaproteobacterium for the study of diverse cellular processes. The results show that CcCdnL is essential, interacts with βRNAP, and localizes to rRNA promoters activatng their transcription in vivo. These results suggest that the essential function of CdnL and its mode of action, other than some possible exception, is conserved across distinct taxonomical bacterial groups. CcCdnL, whose expression is constitutive, is a substrate of the ClpXP protease. Nevertheless, the increase in intracellular levels of CcCdnL due to the loss of its degradation by ClpXP does not provoke adverse effects on growth. An unusual feature of CcCdnL lack-of-function mutations, relative to equivalent mutations of its homologues in M. xanthus and M. tuberculosis, is their cold- sensitivity, which may stem from intrinsic differences among the distinct homologues, or from differences in the intrinsic stabilty of the open, transcripion complexes formed by distinct RNAP.

Actualmente, existe un interés por la demanda de alimentos saludables que puedan tener un efecto beneficioso para la salud de los consumidores. La evidencia científica avala que el consumo de determinados compuestos presentes en los alimentos de forma natural, tiene una relación inversa con la disminución del riesgo de padecer enfermedades, como enfermedades cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades degenerativas. Entre estos componentes presentes en los alimentos de origen vegetal, los (poli)fenoles son considerados potentes antioxidantes con numerosos efectos beneficiosos. El grano de cacao y sus productos derivados, destacan por tener una alto contenido en (poli)fenoles. Sin embargo, numerosos trabajos científicos han demostrado que desde la recogida del grano hasta el producto final, se producen pérdidas de estos compuestos en todas las etapas del proceso. Por ello, es importante reducir las pérdidas de estos compuestos antioxidantes en el producto final. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido desarrollar y obtener un ingrediente natural de cacao con un alto contenido en (poli)fenoles y con una alta capacidad antioxidante, y que pueda ser apto como ingrediente para su aplicación en productos alimenticios. En las primeras etapas se realizó un estudio del grano de cacao para seleccionar la materia prima con un elevado contenido de (poli)fenoles. Asimismo, se evaluaron los efectos de diferentes procesos tecnológicos sobre los contenidos en (poli)fenoles totales y flavanoles, con la finalidad de introducir nuevas etapas en el procesado y conseguir un polvo de cacao desgrasado con un perfil fenólico mejorado. De este modo, se consiguió el desarrollo industrial de un ingrediente de cacao rico en (poli)fenoles totales y flavanoles que fue utilizado en la formulación de un chocolate negro. Los resultados obtenidos muestran que el proceso de fermentación y tostado del grano producen una disminución significativa del contenido de (poli)fenoles totales, observando el mayor contenido de estos compuestos en el “nib”. El genotipo de cacao, clon CCN51, producido en Ecuador, es el cacao con el contenido más alto de (poli)fenoles. La inactivación de la enzima polifenol oxidasa mediante un escaldado con agua a 95 ºC y 5 minutos, redujo las pérdidas de (-)-epicatequina, (+)-catequina y procianidina B2, así como el contenido de (poli)fenoles totales. Por ello, el empleo de “nib” de cacao procedente de semillas no fermentadas con la enzima polifenol oxidasa inactivada, es una buena alternativa como materia prima para obtener un ingrediente con un mayor contenido en flavanoles. El prototipo de cacao desgrasado por Soxhlet a partir de semillas con la enzima polifenol oxidasa inactivada, representó a un cacao no afectado por variables postcosecha. El prototipo óptimo fue escalado a nivel piloto mediante un desgrasado con CO2 supercrítico, resultando un cacao con un mayor contenido de (poli)fenoles totales y de flavanoles, así como una capacidad antioxidante superior respecto a los valores encontrados en un polvo de cacao convencional. La aplicación de un tratamiento térmico con calor húmedo a 121 ºC y 1 minuto, no afectó al contenido de (poli)fenoles, obteniendo un ingrediente de cacao con un elevado contenido de procianidinas. La formulación de un chocolate negro empleando un 15% de este ingrediente, ha dado lugar a un enriquecimiento notable de las fracciones de procianidinas oligoméricas y de (-)-epicatequina, (+)-catequina y los dímeros B1 y B2, cuando se compararon los valores con los de un chocolate negro no enriquecido. Aunque la actividad biológica de este ingrediente no ha sido objeto de este estudio, la caracterización del mismo, en cuanto a su perfil (poli)fenólico, abre nuevas líneas de investigación, dirigidas al estudio de la funcionalidad de dicho ingrediente evaluando tanto in vitro como in vivo sus efectos beneficiosos relacionados con los mecanismos de estrés oxidativo. / ABSTRACT Currently, there is an interest in the demand for healthy foods that can have a beneficial effect on the health of consumers. The scientific evidence supports that the intake of certain compounds present naturally in foods has an inverse relationship with reduced risk of some diseases, such as cardiovascular disease, cancer and other degenerative diseases. Among the components present in food of plant origin, (poly)phenols are considered powerful antioxidants with numerous beneficial effects. Cocoa beans and their derived products are characterized by having a high content of (poly)phenols. However, numerous scientific studies have shown that from the collection of the bean to the final product, part of these bioactive compounds are lost at the different processing stages. Therefore, it is important to reduce losses of these antioxidant compounds in the final product. The overall objective of this PhD thesis has been to develop and obtain a natural cocoa ingredient with a high content of (poly)phenols and with high antioxidant capacity, which may be also suitable as an ingredient for use in food products. In the first part of the thesis, a study of the cocoa bean was performed to select the raw material with a high content of (poly)phenols. Also, the effects of various processes on the contents of (poly)phenols and flavanols were evaluated, in order to introduce new steps in the processing for the production of a defatted cocoa powder with an improved phenolic profile. This way, the industrial development of a cocoa ingredient rich in (poly)phenols and flavanols was achieved, which was then used in the formulation of a dark chocolate. The results show that the fermentation and roasting of the bean produce a significant decrease in the total content of (poly)phenols, the highest content of these compounds being observed in the “nib”. The genotype CCN51 clone, produced in Ecuador, is the type of cocoa with the highest content of (poly)phenols. Inactivating the polyphenol oxidase by blanching with water at 95 °C and 5 minutes, reduced losses of (-)-epicatechin, (+)-catechin, and procyanidin B2, as well as the total content of (poly)phenols. Therefore, the use of cocoa “nib” from unfermented beans with the polyphenol oxidase inactivated seems to be a good alternative as a raw material to obtain a cocoa ingredient with an increased content of flavanols. The prototype of cocoa defatted by Soxhlet from beans with the polyphenol oxidase inactivated, represented a cocoa powder unaffected by postharvest variables. The optimum prototype was taken to pilot scale level by defatting with supercritical CO2, this resulting in a higher content of total (poly)phenols and flavanols, as well as an antioxidant capacity higher than that found in a conventional cocoa powder. The subsequent application of a heat treatment with moist heat at 121 °C during 1 minute did not affect the (poly)phenols content, obtaining a defatted cocoa ingredient with a high content of oligomeric procyanidins. Formulating a dark chocolate using 15% of this ingredient resulted in a significant enrichment of the fractions of oligomeric procyanidins, and of (-)-epicatechin, (+)-catechin and B1 and B2 dimers, when the values were compared with a not enriched dark chocolate Although the biological activity of this ingredient has not been the subject of this study, its characterization regarding its (poly)phenolic profile, open new research lines aimed at the study of the functionality of this ingredient, evaluating both in vitro and in vivo its beneficial effects related to oxidative stress mechanisms.

Los avances científicos en el campo de la nutrición y la salud de las últimas décadas, muestran que cada vez hay una mayor evidencia entre el consumo de polifenoles y sus efectos beneficiosos sobre la salud, justificando conocimientos ancestrales utilizados en la medicina tradicional, como es el caso del té verde con alto contenido en polifenoles siendo las catequinas el grupo principal. Los polifenoles, son reconocidos como antioxidantes dietéticos, y poseen efectos beneficiosos diversos como son las propiedades antiinflamatorias, anticancerígenas y neuroprotectoras, entre otras. Aunque los mecanismos de acción que desarrollan estos compuestos y sus metabolitos no se conocen en su totalidad, la regulación del estrés oxidativo es una de sus actividades biológicas que a su vez están relacionadas con varias enfermedades como el cáncer, diabetes, enfermedades degenerativas y envejecimiento. En la actualidad, el desarrollo de alimentos funcionales viene justificado por los notables cambios en nuestra sociedad y sobre todo por los hábitos alimentarios de la población en los países desarrollados, como por ejemplo, el aumento en la esperanza de vida de la población, los mayores niveles de estrés y la creciente preocupación por conservarnos saludables a lo largo de los años. En este contexto, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido diseñar, desarrollar y evaluar la eficacia de un producto rico en polifenoles que reduzca el daño oxidativo en individuos sanos. Para la consecución de este objetivo se llevaron a cabo cuatro estudios, agrupados en tres fases que resumimos a continuación. En la primera fase (diseño de producto), se planteó la necesidad de hacer un estudio (estudio 1) para conocer qué cantidad de catequinas tienen las infusiones de té verde comercializadas en España. A continuación se identificaron y seleccionaron extractos de té verde comerciales (estudio 2), para ser incorporados en el alimento funcional, en base al contenido en catequinas, cafeína y al impacto sensorial. En la siguiente fase se desarrolló el producto teniendo en cuenta los objetivos nutricionales que se perseguían (equivalencia de catequinas/EGCG, antocianidinas y quercetina de 2 tazas de té verde, una ración de frutas rojas y una manzana respectivamente) y los resultados obtenidos en los estudios anteriores. Seguidamente, se caracterizaron los compuestos bioactivos del producto desarrollado y se evaluó la estabilidad y aceptabilidad durante la vida comercial (estudio 3). En la tercera fase se realizó un ensayo clínico aleatorizado doble ciego con 40 sujetos sanos, durante el cual los participantes ingirieron una dosis diaria del producto rico en polifenoles o un placebo durante 10 semanas (estudio 4). En el estudio se evaluó la eficacia tanto a nivel sistémico, mediante la determinación de marcadores de estrés oxidativo (estudio 4.1), como a nivel cutáneo utilizando radiación UVB y determinado el efecto fotoprotector. Los resultados de dichos estudios revelaron que el producto desarrollado es seguro, reduciendo significativamente los niveles de F2-isoprostanos y MDA. Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas en LDL oxidada, proteína C reactiva y ratio GSSG/GSH. Asimismo, tras la exposición de radiación ultravioleta en piel, en el grupo que tomó el producto rico en polifenoles se observó un efecto fotoprotector, al mejorar la dosis mínima eritematosa. En los sujetos a los que se les hizo una biopsia cutánea para evaluar el daño producido a nivel celular no se encontraron resultados significativos para el daño al ADN (medido como dímeros de pirimidína) y para los parámetros de protección genómica (expresión de p53 y células apoptóticas). Sin embargo, se observó una posible tendencia inmunoprotectora mediante la preservación del número de células de Langerhans. El producto no tuvo efectos significativos sobre parámetros de calidad de la piel (hidratación, pérdida transepidérmica del agua y elasticidad). / SUMMARY Over the past decades, scientific advances in the field of nutrition and health have showed the increased evidence between the consumption of polyphenols and their beneficial effects on health, justifying ancestral knowledge used in traditional medicine, as is the case of green tea polyphenols, being the catechins the main group. Polyphenols are recognized as dietary antioxidants, and have several beneficial effects such as anti-inflammatory, anti-cancer and neuroprotective properties, among others. Although the mechanisms of actions of these compounds and their metabolites are not fully known, the regulation of oxidative stress is one of the biological activities related to several diseases such as cancer, diabetes, degenerative diseases and aging. Nowadays, the development of functional foods is justified by the significant changes in our society, namely, the increase in life expectancy, the higher social stress levels and the growing concern about keeping us healthy over the years, which have had dramatical consequences on individuals ‘eating habits in developed countries. In this context, the general objective of this thesis has been to design, develop and evaluate the efficacy of a product rich in polyphenols that reduces oxidative damage in healthy individuals. To achieve this goal, four empirical studies, grouped in three phases, were carried. In the first phase (product design), we did a study (Study 1) to assess the amount of catechins in green tea infusions sold in Spain. Then, we identified and selected commercial green tea extracts (Study 2) to be added in the functional food based on the catechin and caffeine content, as well as sensory impact in the final product. In the next phase, we developed the product taking into account the target nutritional objectives (equivalence of catechins and EGCG in 2 cups of green tea, quercetin content in an apple, and anthocyanins content of one serving of red berries), and the results obtained in prior research. Next, the bioactive compounds of the developed product were characterized, and stability and acceptability were evaluated during shelf life (Study 3). Finally, in the third phase, a randomized double-blind clinical trial with 40 healthy subjects was performed, in which the participants were allocated to consume a daily dose of the product rich in polyphenols or a placebo for 10 weeks (Study 4). We evaluated the efficacy in blood measuring biomarkers of oxidative stress, and in the skin by the exposure of UVB radiation and the measurement of photoprotection. The results of these studies showed that the product is safe and significantly reduced the levels of F2-isoprostane and MDA (markers of lipid peroxidation). On the other hand, no significant differences in plasma concentrations of oxidized LDL, CRP and GSSG / GSH ratio were found. Moreover, after the induction of oxidative stress by ultraviolet radiation in the treatment group, a photoprotective effect was observed by the increase of the minimum erythemal dose (MED). In the subjects where we took skin biopsies to assess the damage at cellular level, no significant differences were found for DNA damage (measured as pyrimidine dimers) and genomics protection parameters (p53 expression and number of sunburn cells). However, an immunoprotective trend was observed by preserving the number of Langerhans cells. The product did not show any significant improvements on skin quality parameters (hydration, transepidermal water loss and elasticity).

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El siguiente estudio se realizó con el fin de comprobar la calidad microbiológica de los alimentos comerciales para perros expendidos a granel, y posteriormente contrastarla con la calidad microbiológica que presentan los mismos alimentos en envases sellados. Con este fin, se tomaron muestras de cinco marcas de alimentos extruídos para perros; una al estado sellado y otra al estado “a granel”. La toma de muestras se llevó a cabo en cinco comunas de Santiago (La Florida, Maipú, Estación Central, Recoleta y Renca), recolectándose en total cincuenta muestras. Para la toma de muestras y posterior análisis de la información obtenida, se utilizó el plan de muestreo y límites microbiológicos del Nuevo Reglamento de los Alimentos (Chile, 2006), adaptado por la Unidad de Higiene y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, para alimentos de caninos. Cada una de las muestras fue sometida a cinco análisis microbiológicos: recuento de aerobios mesófilos (RAM), Número Más Probable (NMP) de coliformes totales, detección de E.coli, detección de Salmonella sp. y recuento de mohos y levaduras. Del total de las muestras estudiadas, en ninguna se detectó la presencia de los patógenos Salmonella sp. y E.coli. En el análisis de coliformes totales, todas las marcas cumplen con los límites establecidos en el programa de muestreo, tanto en alimentos sellados como “a granel”. Todas las marcas en su modalidad de selladas se mantienen dentro de los márgenes fijados para RAM, y en el recuento de mohos y levaduras, tres marcas sobrepasaron el límite. En todas las muestras de alimentos “a granel” se superaron los límites máximos permitidos para RAM y recuento de mohos y levaduras. 2 Si se analiza según comunas, las que presentaron RAM mayores al límite aceptable fueron Estación Central, Recoleta y Renca. En el recuento de mohos y levaduras, Estación Central y Recoleta exhibieron valores mayores al límite aceptable. El RAM más bajo fue para La Florida, y en recuento de mohos y levaduras para Renca. El resto de los parámetros estudiados fueron iguales para todas las comunas. Tanto la marca, como el tipo de expendio del alimento generaron efectos significativos sobre el RAM, no así la comuna y la interacción marca-tipo expendio. De los resultados se concluye que los alimentos comerciales para perros expendidos “a granel”, no cumplen con los requisitos microbiológicos básicos, y por tanto, no son aptos para el consumo.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El uso de antimicrobianos en animales de producción trae consigo el riesgo de presencia de residuos que superen los límites máximos permitidos de estos medicamentos en alimentos de origen animal. Esto ha llevado a desarrollar programas de control para lo cual es necesario contar con métodos de detección de estas sustancias, entre los cuales están los métodos de “screening”. El objetivo del presente estudio fue validar la prueba de “screening” microbiológico “Fast Antimicrobial Screen Test” (“FAST”) para la detección de 16 antibióticos frecuentemente usados en la producción animal en Chile. Para esto, se siguieron las pautas recomendadas por la Unión Europea (U.E) publicadas en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas (2002). La implementación de la técnica, se basó en las recomendaciones del fabricante (Medtox®). En esta experiencia se determinó que la zona inhibitoria alrededor del sensidisco control N5 estuvo, en la mayoría de los casos, dentro de un rango de 25 a 30 mm, valor un poco más elevado que aquel descrito para la técnica (20 a 26 mm). Por otro lado, si bien en este estudio se observó que pueden obtenerse resultados tan pronto como a las seis horas de iniciada la incubación, para la validación del método la lectura de las placas se fijó a las 24 horas, tiempo al cual se visualizaron inequívocamente los halos de inhibición. La especificidad del método se determinó analizando los solventes y diluyentes utilizados en el estudio y tejido renal libre de antimicrobianos, observándose que ninguno de ellos produjo interferencia con los resultados. Para medir la capacidad de detección del método se fijó el límite de determinación para los 16 antibióticos como drogas puras con los siguientes resultados: amoxicilina (25 μg/kg o ppb), ampicilina (25 μg/kg), ceftiofur (3000 μg/kg), cloxacilina (25 μg/kg), enrofloxacino (100 μg/kg), eritromicina (100 μg/kg), estreptomicina (500 μg/kg), florfenicol (300 μg/kg), flumequina (1000 μg/kg), gentamicina (375 μg/kg), neomicina (2500 μg/kg), oxitetraciclina (300 μg/kg), penicilina (25 μg/kg) y tilosina 2 (200 μg/kg). Para ácido oxolínico y lincomicina no pudo ser determinado. Además, se obtuvo el límite de determinación para enrofloxacino y oxitetraciclina presentes en matrices renales de aves tratadas con dosis terapéuticas, obteniéndose valores de 1467 y 247μg/kg, respectivamente. El análisis de robustez indicó que el método no es lo suficientemente robusto frente a los 4 factores seleccionados, los cuales fueron operador, pH del medio, concentración de esporas y temperatura de incubación. En conclusión, a pesar de la baja robustez del método, éste resultó tener una especificidad y sensibilidad adecuadas siendo capaz de detectar, en conformidad a los niveles de exigencia, un amplio espectro de antimicrobianos como drogas puras. Sin embargo, si se desea emplear este método en Chile, es importante que se continúen los estudios basados en la matriz renal, para definir con mayor precisión la sensibilidad de la técnica.

Doctor en Ciencias con mención en Microbiología

El ofidismo como problemática de salud en el Perú, requiere ser atendido con estudios dirigidos a optimizar la acción de los antivenenos producidos comercialmente y además, desarrollar nuevas tecnologías destinadas a este propósito. En este aspecto, la producción de inmunoglobulina Y específica (IgY) de origen aviar es una alternativa frente a los antivenenos equinos, y es el tema en la presente investigación. Se inmunizaron gallinas ponedoras de la raza Light Brown Leghorn con 500 µg del veneno de Bothrops atrox, emulsificado con adyuvante de Freund, siguiendo la aparición de anticuerpos en suero con la técnica de inmuno difusión doble. Los anticuerpos aviares fueron aislados de la yema de huevos que contenían los niveles más altos de IgY específica, determinados previamente por la técnica de ELISA, utilizando precipitación negativa con ácido caprílico y un paso adicional de precipitación positiva con sulfato de amonio. La masa de anticuerpos recuperados fue de 8,5 ± 1,35 mg/mL de yema habiéndose determinado en 8,3% la cantidad de IgY específica mediante cromatografía de afinidad en una columna de Sepharosa 4B-veneno. El antiveneno aviar tuvo una DE50 de 575 µL de antiveneno/mg de veneno y una potencia de 1,74 mg de veneno/mL de antiveneno aviar. Asimismo, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de Bothrops brazili comparte más epítopes comunes con el veneno de Bothrops atrox ya que se obtuvo un valor de 46% de reactividad cruzada en tanto que los venenos de Bothrops pictus y Bothrops barnetti tuvieron valores de 41% y 37% respectivamente; se encontró además que los venenos de Crotalus durissus (12%) y Lachesis muta (19%) tuvieron una baja reactividad cruzada con el veneno en estudio. / Ofidism as a health problem in Perú requires to be attended either optimizing commercial antivenom potency and developing news technologist on this. Production of specific avian immunoglobulin Y is an alternative in relationship IgG horse antibodies, which is the main point of this research. Laying Light Brow Leghorn chickens were immunizated with 500 µg of Bothrops atrox snake venom emulsificated with Complete Freund’s adjuvant, and the IgY antibodies production was evaluated with the double immunodiffusion method. The avian antibodies were isolated from egg yolk which contained high level of specific IgY, calculated by ELISA method. Using caprylic acid negative precipitation and ammonium sulfate positive precipitation, mass antibodies recovery was 8,5 ± 1,35 mg/ml of yolk and after step on sepharosa 4B-venom affinity chromatographic, specific IgY recovery was 8,3% . The avian antivenom had a ED50: 575 µL antivenom/mg of venom and potency was 1,74 mg of venom/ml of avian antivenom. In addition, the crossing reactivity assays showed that Bothrops brazili venom share more common epitope with Bothrops atrox venom with a value of 46% of crossing reactivity whilest the Bothrops pictus and Bothrops barnetti venoms had values of 41% and 37% respectly; in contrast the venoms of Crotalus durissus (12%) and Lachesis muta (19%) had low crossing reactivity with Bothrops atrox venom.

Un índice de genes de camote Ipomoea batatas (L.) Lam. ha sido establecido basado en el pirosecuenciamiento. Dos colecciones normalizadas de cDNA de tallos y hojas de camote cultivar Tanzania que habían sido expuestos a sequía, dieron 524,209 reads. Después del establecimiento de los parámetros óptimos de ensamblaje, estos reads fueron ensamblados junto con 22,094 EST disponibles públicamente en el GenBank, dando como resultado del ensamblaje 31,685 contigs y 34,733 singletons. Las comparaciones usando Blastx en la base de datos del UniRef100 permitió la anotación de 23,957 contigs y 15,342 singletons, resultando en 24,657 genes únicos. Además, 27,119 secuencias no tienen ninguna coincidencia con las secuencias proteicas del Uniref100. La anotación de 24,763 secuencias incluye la atribución de GO terms. Adicionalmente, se han encontrado 293 genes involucrados en la respuesta a estrés hídrico. Basado en este índice de genes, se ha identificado 195 marcadores microsatélites que fueron amplificados exitosamente y evaluados en un grupo de seis hexaploides de Ipomoea batatas y dos diploides de Ipomoea trífida. Palabras claves: anotación de genes, ensamblaje de transcriptoma, Ipomoea batatas, Ipomoea trífida, marcadores microsatélites, pirosecuenciamiento 454, recursos genéticos. / --- A sweetpotato Ipomoea batatas (L.) Lam. gene index was established based on pyrosequencing. Two normalized cDNA collections from stems and leaves were produced from drought stressed sweetpotato cultivar Tanzania and yielded 524,209 pyrosequencing reads. After establishment of the optimal assembly parameters, these reads were assembled together with 22,094 publically available expressed sequence tags into 31,685 sets of overlapping DNA segments and 34,733 unassembled sequences. Blastx comparisons with the UniRef100 database allowed annotation of 23,957 contigs and 15,342 singletons resulting in 24,657 putatively unique genes. Further 27,119 sequences had no match to protein sequences of UniRef100 database. Annotation of 24,763 sequences included the attribution of gene ontology terms to as many sequences as possible. In adition it was found 293 genes involved in water response. Based on this gene index, we have identified 195 gene-based microsatellite markers that could be successfully amplified and scored in a test panel of six hexaploid I. batatas and 2 diploid I. trifida genotypes. Key words: Ipomoea batatas, Ipomoea trífida, gene annotation, genetic resources, microsatellite markers, 454 pyrosequencing, transcriptome assembly.

Se evaluó la resistencia bacteriana para diversos antibióticos desde el año 1996 hasta el 2007 empleando los antibiogramas para infecciones del tracto urinario (ITU) del Servicio Académico Asistencial de Análisis Clínicos (SAAAC). Para ello se escogieron los tres gérmenes mas prevalentes; Escherichia coli, Enterobacter aerógenes y Hafnia alvei (ex Enterobacter hafniae), se seleccionaron aquellos antibióticos que tuvieron vigencia durante el periodo de estudio. Se agrupó de manera bianual haciendo un total de seis periodos. El estudio mostró que el germen con mayor prevalencia fue Escherichia coli; que fue sensible a Ceftriaxona, Amikacina, Nitrofurantoína y presentó alta resistencia a Acido nalidíxico, Norfloxacino, Amoxicilina, Sulfametoxazol/trimetoprim y Acido Pipemídico. En cuanto a las otras dos especies bacterianas se registró sensibilidad frente a Ceftriaxona y Amikacina y resistencia frente a Amoxicilina, Sulfametoxazol/Trimetoprim, Ácido nalidíxico, y Ácido pipemídico. Asimismo, los antibióticos que han tenido mayor efectividad y que estadísticamente se proyecta su vigencia en los próximos dos años son Ceftriaxona, Amikacina y Nitrofurantoína, mientras que la Amoxicilina, Sulfametoxazol/trimetoprim, Acido Pipemídico y Ácido nalidíxico son los antibióticos que no alcanzaron la efectividad mínima que les permita seguir siendo empleados en la terapia empírica de las ITUs adquiridas a nivel de la comunidad. / We have evaluated the bacterial resistance to several antibiotics from 1996 to 2007 using the antibiogramas of urinary tract infections (UTI) from the Academic Asistance Service of Clinical Analysis (SAAAC). The analysis has choosen the three most prevalent bacterium; Escherichia coli, Enterobacter aerogenes and Hafnia alvei (ex Enterobacter hafniae) while we have selectioned those antibiotics that had remained force during the period of study and it was clustered in six periods. The Study has showed the most prevalent germ was Escherichia coli that has presented sensitivity to cetriaxone , amikacin and nitrofurantoin besides has showed high resistance to nalidixic acid , norfloxacin, amoxicillin, sulfamethoxazole /trimethoprim and pipemidic acid. The another two bacterial species were sensitivity to ceftriaxon and amikacin while were resistance to amoxicillin, sulfamethoxazole /trimethoprim, acid nadilixic and acid pipemidic. Therefore it was concluded that ceftriaxon , amikacin and nitrofurantoin are antibiotics that have been most effective during the study period and statistically it projected its effect in the next two years .Moreover the amoxicillin , sulfamethoxazole / trimethoprim , nadilixic acid and pipemidic acid are antibiotics that no longer reaches the minimum efficiency that allow them to remain employed in the empirical therapy of UTIs acquired at the community level.