A linezolida é um antibiótico oxazolidinona efetivo contra bactérias patogênicas gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus resistente a glicopeptídeos (GISA) e enterococci resistente a vancomicina (VRE). As oxazolidinonas inibem a translação bacteriana na fase de iniciação da síntese de proteínas, enquanto que a síntese de RNA e DNA não são afetadas. Diversos métodos por cromatografia líquida de alta-eficiência (HPLC) têm sido relatados para a determinação da concentração de linezolida em plasma humano, soro e urina. Entretanto, um número pequeno de métodos estão disponíveis para a determinação de linezolida em formulações farmacêuticas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar métodos espectrofotométrico, de cromatografia líquida de ultraeficiência em fase reversa (RP-UPLC), doseamento microbiológico em placas e doseamento microbiológico rápido em microplacas com leitura cinética para a determinação de linezolida em soluções injetáveis e comprimidos. Adicionalmente, foram identificadas e quantificadas as principais fontes de incerteza relacionadas aos métodos. O desenvolvimento dos métodos utilizou uma abordagem racional, empregando-se planejamento de experimentos (análise fatorial e metodologia de superfície resposta) para otimização das condições analíticas. As fontes de incertezas foram identificadas empregando-se diagrama de Ishikawa e quantificadas conforme procedimento da Eurachem/Citac. Os métodos desenvolvidos apresentaram especificidade/seletividade, linearidade, precisão, exatidão e robustez adequadas, conforme os critérios estabelecidos pelo ICH e ANVISA. A análise estatística demonstrou equivalência entre os resultados providos por cada um dos métodos, sendo intercambiáveis entre si. Portanto, os métodos podem ser empregados no controle de qualidade de rotina na indústria farmacêutica. / Linezolid is an oxazolidinone antibiotic effective against gram-positive pathogenic bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus (GISA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). Oxazolidinones inhibit bacterial translation at the initiation phase of protein synthesis, while RNA and DNA synthesis are not affected. Several high performance liquid chromatographic (HPLC) methods have been reported to determine the concentration of linezolid in human plasma, serum and urine. However, a few number of methods are available to determine the concentration of linezolid in pharmaceutical dosage forms. The aim of the present work was to develop and validate a spectrophotometric method, a reverse-phase ultra-high performance liquid chromatographic method, microbiological assay and microbiological rapid assay in microplates using kinetic reading for the determination of linezolid in injections and tablets dosage forms. In addition, the most important sources of uncertainty were identified and quantified for each method. A rational approach was used in the development of these methods, using design of experiments (factorial design and response surface methodology) for optimization of analytical conditions. The sources of uncertainties were identified using Ishikawa diagram and quantified as described in Eurachem/Citac procedure. The developed methods were specific/selective, linear, precise, accurate and robust, as required by ICH and ANVISA guidelines. Statistical analysis showed equivalence among the results provided by each method, being interchangeable. Thus, the methods may be employed in routine quality control analysis by pharmaceutical industry.

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Luciana_Conceicao.pdf: 1166387 bytes, checksum: 74e97c6a817eb6fb90d26b94051d237d (MD5) Previous issue date: 2012-12-20 / The application of a material after periodontal surgery is recommended to reduce postoperative bleeding, to protect the wound area and to avoid the formation of excessive granulation tissue. The current trend is the development of new biomaterials eugenol-free for surgical application. The aim of this study was to develop and characterize a periodontal dressing based on photopolymerizable methacrylate monomers. For this purpose, a screening was made to determine the best formulation based on the ease of handling and the use of Exothane 8 , camphorquinone, silica and quartz particles. Three groups were tested: Gperio (Group of periodontal dressing Periobond®, Dentsply); Gbar (Group of periodontal dressing Barricaid®, Caulk), which served as the reference group and Gexp (Group of experimental material). The physical-mechanical performance of the experimental composite and the commercial references Periobond® and Barricaid® (control group) were tested using in vitro tests of tensile strength (n = 15) and sorption and solubility (n = 10). Cytotoxicity (MTT colorimetric assay) and genotoxicity by micronuclei (MN) tests were performed in a cell lineage of mouse fibroblasts 3T3/NIH, in triplicate, in order to characterize the biological response of these materials. Microbiological test assess the amount of viable bacteria of Enterococcus faecalis anaerobic and aerobic and total microorganisms. Data were subjected to statistical analysis based on the model of normal distribution and equal variance One-Way ANOVA, considering the value of P<0.05 as statistically significant. There were no statistically significant differences between the median values of Gexp and Gbar, for ultimate tensile strength. Regarding the sorption there was statistical difference between Gperio and Gexp and between Gperio and Gbar (P=<0.001). There was no difference when comparing Gbar and Gexp. The solubility showed no statistical difference between groups. In general, the cytotoxic effects of the materials were time dependent according to eluate extraction periods (24h, 48h and 7 days). No statistical difference at 24h between Gexp and Gperio. At 72h, differences were observed between Gexp and Gperio (P<0.001) with Gexp showing the best results. Similar results were seen between Gbar and Gperio (P<0.001). At 7 days, statistical difference was observed between Gbar and Gperio (P<0.05). In genotoxicity test no difference was found among the groups. In microbiological assay no statistical difference was found for E. faecalis anaerobic, E. faecalis aerobic and for total microorganisms. We conclude that Gexp experienced similar behavior to the commercial samples and can be possibly used as a periodontal dressing; however, more studies are needed at pre-clinical and clinical levels / A aplicação de um material após a cirurgia periodontal é recomendada para reduzir o sangramento pós-operatório, proteger a área da ferida e evitar a formação excessiva de tecido de granulação. A tendência atual é o desenvolvimento de novos biomateriais para aplicação cirúrgica livres de eugenol. O objetivo do presente estudo foi desenvolver e caracterizar um material cirúrgico periodontal baseado em monômeros metacrilatos fotopolimerizável com formação de polímero de alta flexibilidade. Para isso, foi realizado um screening para se determinar a melhor fórmula baseada na facilidade de manuseio do material e considerando a utilização de Exothane 8 , canforoquinona, e partículas de sílica e quartzo. Três grupos foram testados; Gperio (Grupo cimento periodontal Periobond®, Dentsply); Gbar (Grupo cimento periodontal Barricaid®, Caulk, que serviu como grupo de referência comercial) e Gexp (Grupo do material experimental). Foi avaliado o desempenho físico-mecânico do compósito experimental e das referências comerciais: Periobond® e Barricaid® (grupos controle), através dos ensaios in vitro de resistência à tração (n=15) e sorção e solubilidade (n=10). Testes de citotoxidade (ensaio colorimétrico com MTT) e de genotoxicidade através do ensaio de micronúcleos (MN) em linhagem celular de fibroblastos de camundongo 3T3/NIH, foram realizados em triplicata, com o intuito de caracterizar a resposta biológica desses materiais. Teste microbiológico para avaliar a quantidade de bactérias viáveis de Enterococcus faecalis anaeróbicos, aeróbicos e micro-organismos totais. Os dados obtidos foram submetidos ao método estatístico baseado no modelo de distribuição normal e igualdade de variância (ANOVA 1 via), considerando-se o valor de P<0,05 como estatisticamente significante. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os valores medianos do Gexp e Gbar, em relação à resistência máxima a tração. Em relação à sorção houve diferença estatística entre Gperio e Gexp e entre Gperio e Gbar (P<0,001). Não houve diferença estatisticamente significante quando comparamos Gbar e Gexp. Em relação à solubilidade não houve diferença estatística entre os grupos. Em geral, os efeitos citotóxicos dos materiais foram dependentes do tempo de extração do eludato (24h, 48h e 7 dias). Foi encontrada diferença estatística no tempo de 24h entre Gexp e Gperio. No tempo de 72h houve diferença entre Gexp e Gperio (P<0,001), tendo o primeiro melhor comportamento, da mesma forma entre Gbar e Gperio (P<0,001). Em 7 dias, houve diferença estatística entre Gbar e Gperio, tendo resultado de P<0,05. No teste de genotoxicidade não foi encontrada diferença estatística entre os grupos. No ensaio microbiológico não foi encontrada diferença estatística para E. faecalis anaeróbicos, E. faecalis aeróbicos ou micro-organismos totais. Concluímos que Gexp teve comportamento semelhante aos controles podendo ser utilizado como material para recobrimento de feridas cirúrgicas periodontais, sendo necessários mais estudos de fase pré-clínica e clínica.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The single cell gel electrophoresis assay (comet assay) is a useful tool for monitoring individuals who may be at risk of DNA damage and the ensuing process of carcinogenesis or other disease states. Leukocytes in blood samples provide a means of obtaining cells for use in the comet assay. However instances may arise when samples must be stored for later analysis. The present study investigated the effects of storage conditions on DNA damage in the form of strand breaks and oxidized bases in rat and human leukocytes using the comet assay. Whole blood and buffy coat samples were stored at room temperature or 4ºC for 1, 2, 24, and 48 hours or cryopreserved at -80ºC for 1 day and 1, 2, 3, and 4 weeks. The results show that the time of storage is limited if the whole blood or buffy coat samples are stored at room temperature or 4ºC. However, if cryopreserved using glycerol or DMSO as the cryoprotectant, the samples may be stored for at least 4 weeks without DNA strand breaks or oxidative damage deviating significantly from the fresh samples.

Itraconazole is a triazole antifungical agent with a broad spectrum of activity belonging to the class of azole, indicated in the treatment of different types of mycotic infections systemic and local. Its mechanism of action is based on the ability to inhibition of synthesis of ergosterol which is a component of vital importance to the cell membrane of the fungi. This drug has only official methodology for raw material, described in British and European Pharmacopeia. In this paper, following the main guidelines for validation, were developed and validated quantitative analytical methods that can be applied both for the raw materials as the finished product containing itraconazole capsules through a high performance liquid chromatography (HPLC) with detection in the ultraviolet (254 nm, C8 reversed-phase column, mobile phase acetonitrile : water (65:35), the temperature of 25 °C) and microbiological assay by agar diffusion, with planning 3x3, employing Candida Albicans ATCC 10231 as microorganism testing in the culture medium antibiotic N° 19 in the region of the ultraviolet spectrophotometry (256 nm, with final solutions in 0.1 mol l-1 hydrochloric acid). All methods showed appropriate linearity, precision, accuracy, robustness and specificity. / O itraconazol é um antifúngico triazólico de amplo espectro de ação pertencente à classe dos azóis, indicado no tratamento de diferentes tipos de infecções micóticas sistêmicas e superficiais. Seu mecanismo de ação baseia-se na capacidade de inibição da síntese do ergosterol que é um componente de vital importância para a membrana das células dos fungos. Este fármaco possui metodologia descrita, somente, para matéria-prima, que se encontram oficializadas nas Farmacopéias Britânica e Européia. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados, em conformidade com guias nacionais e internacionais, métodos analíticos quantitativos que podem ser empregados tanto para matéria-prima quanto para forma farmacêutica de cápsulas contendo itraconazol. Utilizaram-se as metodologias: cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) com detecção na região do ultravioleta (UV) em 254 nm, coluna de fase reversa C8, fase móvel acetonitrila : água (65:35), na temperatura de 25 °C; Ensaio microbiológico por difusão em ágar com planejamento 3x3, empregando Cândida Albicans ATCC 10231 como microrganismo teste em meio de cultura antibiótico n°19 e Espectrofotometria na região do ultravioleta, no comprimento de onda de 256 nm , com soluções finais em ácido clorídrico 0,1 mol.l-1 . Todos os métodos apresentaram linearidade, precisão, exatidão, robustez e especificidade adequados.

All viruses encode for at least one viral interferon (IFN) antagonist, which is used to subvert the cellular IFN response, a powerful antiviral innate immune response. Numerous in vitro and in vivo studies have demonstrated that IFN antagonism is crucial for virus survival, suggesting that viral IFN antagonists could represent promising therapeutic targets. This study focuses on Respiratory Syncytial Virus (RSV), an important human pathogen for which there is no vaccine or virus-specific antiviral drug. RSV encodes two IFN antagonists NS1 and NS2, which play a critical role in RSV replication and pathogenicity. We developed a high-throughput screening (HTS) assay to target NS2 via our A549.pr(ISRE)GFP-RSV/NS2 cell-line, which contains a GFP gene under the control of an IFN-stimulated response element (ISRE) to monitor IFN- signalling pathway. NS2 inhibits the IFN-signalling pathway and hence GFP expression in the A549.pr(ISRE)GFP-RSV/NS2 cell-line by mediating STAT2 degradation. Using a HTS approach, we screened 16,000 compounds to identify small molecules that inhibit NS2 function and therefore relinquish the NS2 imposed block to IFN-signalling, leading to restoration of GFP expression. A total of twenty-eight hits were identified; elimination of false positives left eight hits, four of which (AV-14, -16, -18, -19) are the most promising. These four hit compounds have EC₅₀ values in the single μM range and three of them (AV-14, -16, -18) represent a chemically related series with an indole structure. We demonstrated that the hit compounds specifically inhibit the STAT2 degradation function of NS2, not the function of NS1 or unrelated viral IFN antagonists. At the current time, compounds do not restrict RSV replication in vitro, hence hit optimization is required to improve their potency. Nonetheless, these compounds could be used as chemical tools to determine the unknown mechanism by which NS2 mediates STAT2 degradation and tackle fundamental questions about RSV biology.