Les travaux présentés se sont intéressés à la régulation des forces produites par le cytosquelette d'actine. Le rôle primordial joué par le microenvironnement a été au centre de nos investigations. L'étude de ces phénomènes a nécessité le développement de techniques innovantes. La première permet le contrôle en temps réel de la forme de la cellule. Elle utilise un laser UV pulsé pour modifier le microenvironnement adhésif de la cellule et contrôler les zones disponibles pour son étalement. La seconde est une amélioration d'une technique existante au sein du laboratoire. Il s'agit de produire des îlots de protéines d'adhésions, de forme contrôlée, sur un substrat déformable d'acrylamide. Ces supports permettent le contrôle de la taille de la cellule et de son organisation interne. En outre, l'élasticité de l'acrylamide permet la mesure des forces générées par la cellule. La dernière technique a combiné le patterning sur acrylamide avec l'ablation laser. Les forces produites au sein d'une structure particulière du cytosquelette ont ainsi pu être estimées. Deux grands mécanismes de régulation des forces ont pu être mis en évidence. L'utilisation de techniques de spectrométrie de masse, de mesure de forces et de biologie moléculaire a permis de mettre en évidence la coopération entre les différents types d'intégrines au niveau de l'adhésion cellulaire. Cette coopération permet un couplage entre l'architecture du cytosquelette et la quantité de moteurs moléculaires mettant en tension ces structures. Ces mécanismes sont primordiaux pour l'adaptation de la cellule à la rigidité de son environnement. Ce sont les structures d'actine qui produisent les forces qui seront transmises au niveau des adhésions. La corrélation entre la taille de ces structures et les forces générées est encore mal caractérisée. La relation entre taille des fibres de stress et répartition des forces au sein de la cellule a pu être étudiée et suggère que la force produite par une fibre de stress augmente avec sa longueur. Une étude systématique de la contractilité des cellules, sur des patterns de différentes tailles, a permis de montrer la relation entre la taille des fibres de stress et la force générée. Une relation biphasique a ainsi été mise en évidence. Quand la taille de la cellule augmente, la force générée au sein des fibres de stress commence par augmenter avant de diminuer au delà d'une longueur critique. Cette longueur correspond également à la taille maximale observée sur des cellules libres de s'étaler sans contraintes. Les résultats obtenus suggèrent que cette chute de force est liée à une augmentation excessive du ratio myosine/actine qui ne permet plus une production de force efficace. Le mécanisme pourrait faire intervenir le désassemblage des structures d'actine par la myosine ou la quantité insuffisante d'actine pour permettre un travail efficace des moteurs moléculaires. La rencontre de ces deux mécanismes permet de définir le champ des possibles pour la cellule en terme de contractilité. Le mécanisme de chute de forces observé n'a pas pu être expliqué à ce jour mais nous travaillons activement pour qu'il le soit dans les mois à venir. Ce phénomène aura sans doute un grand rôle à jouer dans l'intégrité mécanique des tissus et les phénomènes de migration. La chute de force au delà de la longueur critique permet en effet de déstabiliser les adhésions et pourrait être à l'origine de la rétraction de la cellule dans la migration ou du détachement d'une cellule de ces voisines dans le cas d'un tissu sous forte contraintes. Ce détachement protégerait ainsi la cellule d'un déchirement sous l'effet de forces trop importantes. / Our work has been focused on the regulation of the forces generated by the actin cytoskeleton. We have more precisely studied the role of the cellular microenvironment in this process. It was necessary to overcome some technical challenges to study these mechanisms. We developed two new techniques. The first one allows for the dynamic control of cell shape. A pulsed UV laser is used to modify the adhesive microenvironment around the cell and to create new area available for cell spreading. The second technique is an improvement of an existing technique from the laboratory. It consists in producing ECM protein islands on a elastic acrylamide substrate. This substrate provides the control of cell shape and internal organization. Plus, the elasticity of the substrate is compatible with traction forces measurements. The last technique combines acrylamide micropatterning and laser ablation of intracellular actin structures. Thus, the forces produced by a particular intracellular structure can be estimated. Two keys mechanisms of force regulation were shown. The use of mass spectrometry, traction force microscopy and molecular biology made it possible to study the interaction between different integrins in the adhesion complex. Cooperation was shown. It allows for the coupling between the architecture of the cytoskeleton and the amount of molecular motors in action. This process is necessary for the adaptation of cell forces to substrate stiffness. Actin structures are the one responsible for force production. This force can then be transmitted to the environment through adhesions.. The link between the length of actin fibers and the force produced was more precisely studied. The results showed a correlation between stress fibers length and the force generated inside it. This was true only above a certain critical value. After that, the force was rather decreasing with increasing fiber length. This critical length corresponds to the maximal length of cell axis on infinite 2D substrate. Our main hypothesis is that a too high myosin/actin ratio will block the proper force production/transmission within the fiber. Disassembly of actin by myosin or limited pool of actin are the two explanations we are currently following. The combination of these two-regulation process put brakes on force production by the cell. Above a certain length, the force produced is decreasing. This decreases in turn the strength of the adhesions anchored to these fibers. This will destabilize the adhesions and causes cell retraction The interplay between the regulation by the adhesion and the production of forces within the fiber set some limits on the level of forces produced by the cell. These processes are likely to be modified in a pathological context and can lead to tumor formation. They also protect the cell from being destroyed by stretching. If the length/stretch is too high, the cell will decrease its forces and detach from neighboring cells. This provide a system protecting the cell from being destroyed by massive deformations within the body

Les microglies sont des cellules hématogène mais prennent place dans le système nerveux central (SNC) au cours du développement embryonnaire pour constituer la population résidente des cellules immunitaires. Elles sont les médiateurs crucials du bon développement et de l'entretien des réseaux de neurones dans le SNC. De nombreux aspects de la physiologie microgliale et les mécanismes qui sous-tendent leurs fonctions au cours du développement embryonnaire du cerveau sont encore largement méconnues. Cette thèse de doctorat porte sur la migration des cellules microgliales au cours du développement embryonnaire du cortex et elle débouche sur trois grandes conclusions. (1) Les cellules microgliales embryonnaires in situ sont très dynamiques et adaptent leur phénotype à leur environnement local. (2) La vitesse de migration des microglies ex vivo dépend des intégrines beta1 qui exercent des fonctions à la fois inhibitrices et promotrices sur la migration selon l'âge embryonnaire. (3) Les microglies jouent probablement un rôle dans l'étiologie des troubles du développement neurologique, mais il faudrait que les futures recherches se concentrent sur le dysfonctionnement des microglies plutôt que sur leur activation immunitaire classique. / Microglia are blood-borne cells but take up residence in the central nervous system (CNS) during embryonic development to constitute the resident pool of immune cells. They are crucial mediators of the healthy development and maintenance of neural networks in the CNS. Many aspects of the physiology of microglia and the mechanisms underpinning their tasks during embryonic brain development are still unresolved. This doctoral dissertation focuses on migration of microglial cells during embryonic cortical development. All together, this dissertation brings forwards three major conclusions. (1) In situ embryonic microglia are highly dynamic cells that adapt their phenotype to their local environment. (2) Microglial migration speed ex vivo is dependent on β1 integrins that exert both migration promoting and inhibiting functions which are age-specifically regulated. (3) Microglia likely play a role in the etiology of neurodevelopmental disorders, but further research should focus on microglia dysfunction rather than classical microglial immune activation.

Le Lupus Erythémateux Systémique est une pathologie inflammatoire chronique. L’étiologie de cette maladie auto-immune est encore méconnue bien que certains facteurs génétiques et environnementaux aggravants aient été mis en évidence. Les traitements proposés aux patients ont pour but de réduire les symptômes et aucun remède curatif n’a encore été mis au point. Nous avons observé de forts taux de sCD95L dans le sérum de patients atteints de LES comparé à celui de sujets sains. Nos données indiquent que ce facteur soluble agit comme une cytokine pro-inflammatoire et promeut la transmigration des lymphocytes T CD4+ Th17 dans les organes, au détriment des lymphocytes T régulateurs (Treg). L’accumulation de ces cellules Th17 est responsable du maintien d’une réponse inflammatoire chronique chez les patients lupiques. Nous mettons en évidence qu’il existe une interaction directe entre le récepteur CD95 et la Phospholipase Cγ1, par l’identification du Calcium Inducing Domain impliqué dans ce recrutement. L’identification du couple CD95/CD95L comme acteur aggravant le LES et la mise en évidences des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents nous ont conduit à l’élaboration de stratégies thérapeutiques innovantes. En collaboration avec les chimistes et modélisateurs de notre Unité, nous avons généré une petite librairie d’inhibiteurs, composée de peptides et peptidomimétiques sélectifs. Parmi ces composés, le TAT-CID est une protéine piège comprenant la zone d’interaction de CD95 (domaine CID des aa 175 à 210) à la PLCγ1. L’injection de ce peptide dans un modèle de souris lupiques restaure la fonction biologique rénale de ces souris et diminue la production d’auto-anticorps (anti-DNA) et de complexes immuns, marqueurs biologiques associés à la progression de la pathologie. En parallèle, le criblage d’une librairie chimique commerciale constituée de médicaments approuvés par la FDA et l’EMA a permis d’identifier un inhibiteur efficace de notre interaction. In vivo, ce composé est capable de réduire drastiquement les signes cliniques de la pathologie lupique. Ces nouvelles données enrichissent notre compréhension du processus mis en place par le système CD95/CD95L dans l’aggravation du LES, et nous permettent de proposer des outils thérapeutiques interessants. Ces molécules pourraient représenter de nouvelles options thérapeutiques originales et attrayantes pour prévenir l’inflammation dans les pathologies inflammatoires chroniques. / Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory disease. The etiology of this autoimmune disease is still unknown although some aggravating genetic and environmental factors have been identified. The treatments used for patients are intended to reduce the symptoms and no curative one has been developed yet. We observed high levels of sCD95L in the serum of patients with SLE compared to healthy subjects. Our data indicate that this soluble factor acts as a pro-inflammatory cytokine and promotes the transmigration of CD4 + Th17 T lymphocytes to the detriment of regulatory T lymphocytes (Treg) in the enflammed organs of patients. The accumulation of these Th17 cells is responsible for maintaining a chronic inflammatory response in lupus patients. We show that there is a direct interaction between the CD95 receptor and the phospholipase Cγ1, by the identification of the Calcium Inducing Domain involved in this recruitment. The identification of the CD95/CD95L couple as an aggravating factor in SLE context and the underlying cellular and molecular mechanisms led us to the development of innovative therapeutic strategies. In collaboration with the chemists and modellers of our research Unit, we have generated a small library of inhibitors, composed of selective peptides and peptidomimetics. Among these compounds, TAT-CID is a decoy peptide comprising the interaction zone of CD95 (CID domain 175 to 210 aa) with PLCγ1. Repeated treatments of lupus-prone mice with this peptide restore the biological function of these mice and decrease the production of autoantibodies (anti-DNA) and immune complexes, biological markers associated with the progression of the pathology. In parallel, the screening of a commercial chemical library consisting of FDA and EMA-approved drugs allowed us to identify an effective inhibitor of our targeted interaction. In vivo, this compound is able to drastically reduce the clinical signs of lupus pathology. These new data enrich our understanding of the process implemented by the CD95/CD95L system in the aggravation of SLE, and allow us to propose interesting therapeutic tools. These molecules could represent novel and attractive therapeutic options for preventing inflammation in chronic inflammatory pathologies.

La migration cellulaire possède deux volets antagonistes ; nécessaire à plusieurs processus physiologiques tels que la réponse immunitaire, elle peut également induire la mort d’un organisme en permettant les cellules cancéreuses d’envahir des organes sains. In vivo, la migration s’effectue dans des milieux complexes et confinés qui imposent une forte déformabilité aux cellules migratoires. Récemment, divers études ont montré que le noyau impose la limite de la déformabilité cellulaire lors de la migration en 3D (Wolf et al. JCB, 2013; Harada et al. JCB, 2013). Il a, en effet, été montré que la migration cellulaire peut être augmentée en diminuant la rigidité nucléaire (Wolf et al. JCB, 2013). Cependant, il existe une limite de rigidité nucléaire en dessous de laquelle la migration cellulaire peut être inhibée via l’inhibition de la survie cellulaire (Harada et al. JCB, 2013). Les cellules cancéreuses qui migrent à des vitesses relativement faibles (µm/heure) et ont des noyaux rigides surmontent la limite imposée par la déformation nucléaire en dégradant et élargissant le milieu extracellulaire. Les cellules immunitaires telles que les neutrophiles qui migrent rapidement (10 µm/mn) et ont des noyaux mous sont connus pour mourir aux sites d’infections. Les cellules dendritiques, de la famille des cellules immunitaires, ont une fonction de présentation d’antigènes qui requiert à la fois une grande capacité migratoire et de survie. Elles représentent donc un modèle cellulaire intéressant pour l’étude de la déformation nucléaire chez les cellules qui migrent rapidement et survivent longtemps. Durant mon doctorat, j’ai étudié le mécanisme grâce auquel les cellules dendritiques déforment leurs noyaux afin de migrer de manière efficace en milieux confinés tout en préservant un haut taux de survie. J’ai utilisé un système expérimental nouveau et original consistant en des microcannaux avec des constrictions (Heuzé et al. MMB, 2011). Ces canaux, combinés à des manipulations génétiques et de la video microscopie nous ont permis de montré que les cellules dendritiques possèdent un mécanisme spécifique, indépendant de celui utilisé pour leur migration, leur permettant de déformer leurs noyaux tout en migrant dans des milieux hautement confinés. Ce mécanisme est basé sur la génération d’un réseau d’actin, autour du noyau, nucléé par Arp2/3 et indépendant du moteur Myosin II. Ce réseau d’actine co-localise avec des sites de rupture de la Lamin A/C. De plus, réduire la quantité de Lamin A/C dans les cellules dendritiques inhibe la formation de ce réseau d’actin perinucléaire. Basés sur ces résultats, nous avons proposé un nouveau mécanisme de déformation du noyau lors de la migration en milieux confinés basé sur Arp2/3 qui, en nucléant un réseau d’actine autour du noyau permet de casser la lamin A/C diminuant ainsi la tension de surface nucléaire et permettant le passage noyau. / Cell migration has two opposite faces; necessary for many physiological processes such as immune response, it can also lead to the organism death by allowing metastatic cells to invade new organs. In vivo migration often occurs in complex 3D environments which impose high cellular deformability. Recently, cellular deformability during 3D migration has been shown to be limited by the nucleus (Wolf et al. JCB, 2013). For instance, cell migration can be increased by decreasing nuclear stiffness. However, below a given nuclear stiffness 3D cell migration can be reduced as a result of impaired cell survival (Harada et al. JCB, 2014). Cancer cells which display slow migration and have rather stiff nuclei have been shown to overcome the physical limits of 3D migration through adhesion combined to matrix degradation or high actomyosin contraction (Wolf et al. JCB, 2013). Immune cells such as neutrophils which are fast moving cells with soft nuclei have been reported to die at sites of infection. Interestingly, dendritic cells function as antigen presenting cells requires high migratory ability as well as high survival. They thus constitute an interesting model for studying nuclear deformation in fast moving and long lived cells. During my PhD, I studied the mechanism by which dendritic cells deform their nuclei to achieve proper migration in highly confining space while preserving a high survival rate. I used an original micro fabricated experimental set up (Heuzé et al. MMB, 2011) consisting of microchannels with constrictions to mimic cellular transmigration. Those channels combined with genetic manipulation and live cell imaging followed by image processing were used to assess the mechanism dendritic cells use to deform their nucleus, which we found to be specific and not required for cell motility per se. I showed that dendritic cells overcome the physical limitation imposed by nuclear deformation through small gaps by nucleating an Arp2/3 based actin network around the nucleus. Surprisingly, the formation of this actin network is independent of myosin II based contraction. This actin accumulation around the nucleus co-localized with sites of nuclear Lamin A/C breakage. Moreover, Lamin A/C depletion in dendritic cells leads to the disappearance of this actin ring and the release of the need for Arp2/3 for nuclear deformation. We thus propose a new mechanism of nuclear squeezing through narrow gaps based on an Arp2/3 nucleated actin meshwork which, by transiently breaking the Lamin A/C network, releases the nuclear surface tension and allows nuclear thus cell passage through micrometric constrictions. Lamin A/C repolymerization around the nucleus at the exit of constrictions would then restore nuclear stiffness, allowing cell survival. Interestingly, this actin accumulation around the nucleus was also observed in vivo in migrating macrophages but not in HL-60 derived neutrophils. Taken together, our data suggest that the Arp2/3 based nuclear squeezing mechanism would be a general feature of highly migratory cells which need to survive long enough to accomplish their functions.

Les déplacements cellulaires, collectifs ou individuels, sont essentiels pour assurer des fonctions fondamentales de l'organisme (réponse immunitaire, morphogenèse), mais jouent également un rôle crucial dans le développement de certaines pathologies (invasion métastatique).Les processus cellulaires à l'origine du déplacement forment une activité complexe, auto-organisée et fortement multi-échelle en temps mais aussi en espace. Mettre en évidence des principes généraux de la migration est donc un enjeu majeur. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la construction de modèles de migration individuelle qui prennent en compte ce caractère multi-échelle de manière minimale.Dans une première partie, nous nous intéressons à des modèles particulaires. Nous décrivons des processus intracellulaires clés de la migration de manière discrète au moyen de processus de population. Puis, par une renormalisation en grand nombre d'individus, taille infinitésimale et dynamique accélérée, nous obtenons des équations de dynamique continue et stochastique, permettant de faire le lien entre la dynamique intracellulaire et le déplacement macroscopique.Nous nous confrontons d'abord à la situation d'un leucocyte se déplaçant dans une artère, et développant des liaisons de différentes natures avec les molécules de la paroi, jusqu'à éventuellement s'arrêter. La dynamique de formation de liaisons est décrite par un processus stochastique de type Naissance et Mort avec Immigration. Ces liaisons correspondent à des forces de résistance au mouvement. Nous obtenons explicitement le temps d'arrêt moyen de la cellule.Puis, nous nous intéressons à la reptation cellulaire, qui se produit grâce à la formation d'excroissances au bord de la cellule, appelées protrusions, qui avancent sur le substrat et exercent des forces de traction. Nous modélisons cette dynamique au moyen d'un processus de population structurée par l'orientation de la protrusion. Le modèle continu limite obtenu peut être étudié pour la migration 1D, et donne lieu à une équation de Fokker-Planck sur la distribution de probabilité de la population de protrusion. L'étude d'une configuration stationnaire permet de mettre en avant une dichotomie entre un état non motile et un état de déplacement directionnel.Dans une seconde partie, nous construisons un modèle déterministe minimal de migration dans un domaine discoïdal non déformable. Nous nous basons sur l'idée selon laquelle les structures responsables de la migration renforcent la polarisation de la cellule, ce qui favorise en retour un déplacement directionnel. Cette boucle positive passe par le transport d'un marqueur moléculaire dont la répartition inhomogène caractérise un état polarisé.Le modèle comporte un problème de convection-diffusion sur la concentration en marqueur, où le champs d'advection correspond à la vitesse d'un fluide de Darcy modélisant le cytosquelette. Son caractère actif est porté par des termes de bord, ce qui fait l'originalité du modèle.Du point de vue analytique, le modèle 1D présente une dichotomie face à une masse critique. Dans les cas sous-critique et critique, il est possible de montrer l'existence globale de solutions faibles, ainsi que la convergence à taux explicite vers l'unique état stationnaire correspondant à un état non polarisé. Au delà de la masse critique et pour des masses intermédiaires, nous mettons en évidence deux états stationnaires supplémentaires correspondant à des profils polarisés. De plus, pour des conditions initiales assez asymétrique, nous démontrons l'apparition d'un blow-up en temps fini.Du point de vue numérique, des tests numériques en 2D sont effectués en volumes finis (Matlab) et éléments finis (FreeFem++). Ils permettent de mettre en évidence à nouveau des états motiles et non motiles. L'effet de perturbations stochastiques est étudié, permettant d'aborder des cas de réponse à des signaux extérieurs chimique (chimiotactisme) ou mécanique (obstacle). / Collective or individual cell displacements are essential in fundamental physiological processes (immune response, embryogenesis) as well as in pathological developments (tumor metastasis). The intracellular processes responsible for cell motion have a complex self-organized activity spanning different time and space scales. Highlighting general principles of migration is therefore a challenging task.In a first part, we build stochastic particular models of migration. To do so, we describe key intracellular processes as discrete in space by using stochastic population models. Then, by a renormalization in large population, infinitesimal size and accelerated dynamics, we obtain continuous stochastic equations for the dynamics of interest, allowing a relation between the intracellular dynamics and the macroscopic displacement.First, we study the case of a leukocyte carried by the blood flow and developing adhesive bonds with the artery wall, until an eventual stop. The binding dynamics is described by a stochastic Birth and Death with Immigration process. These bonds correspond to resistive forces to the motion. We obtain explicitly the mean stopping time of the cell.Then, we study the case of cell crawling, that happens by the formation of protrusions on the cell edge, that grow on the substrate and exert traction forces. We describe this dynamics by a structured population process, where the structure comes from the protrusions' orientations. The limiting continuous model can be analytically studied in the 1D migration case, and gives rise to a Fokker-Planck equation on the probability distribution for the protrusion density. For a stationary profile, we can show the existence of a dichotomy between a non motile state and a directional displacement state.In a second part, we build a deterministic minimal migration model in a discoïdal cell domain. We base our work on the idea such that the structures responsible for migration also reinforce cell polarisation, which favors in return a directional displacement. This positive feedback loop involves the convection of a molecular marker, whose inhomogeneous spatial repartition is characteristic of a polarised state.The model writes as a convection-diffusion problem for the marker's concentration, where the advection field is the velocity field of the Darcy fluid that describes the cytoskeleton. Its active character is carried by boundary terms, which makes the originality of the model.From the analytical point of vue, the 1D model shows a dichotomy depending on a critical mass for the marker. In the subcritical and critical cases, it is possible to show global existence of weak solutions, as well as a rate-explicit convergence of the solution towards the unique stationary profile, corresponding to a non-motile state. Above the critical mass, for intermediate values, we show the existence of two additional stationary solutions corresponding to polarised motile profiles. Moreover, for asymmetric enough initial profiles, we show the finite time apparition of a blowup.Studying a more complex model involving activation of the marker at the cell membrane permits to get rid of this singularity.From the numerical point of vue, numerical experiments are led in 2D either in finite volumes (Matlab) or finite elements (FreeFem++) discretizations. They allow to show both motile and non motile profiles. The effect of stochastic fluctuations in time and space are studied, leading to numerical simulations of cases of responses to an external signal, either chemical (chemotaxis) or mechanical (obstacles).

Dans le cerveau en développement, les interneurones corticaux effectuent une longue migration avant de se positionner dans le cortex et s’intégrer dans les réseaux corticaux dont ils régulent l’activité. Différents facteurs chimiques ont été impliqués dans le guidage de ces cellules, mais l’influence des propriétés physiques de l’environnement dans lequel ils naviguent reste peu connue. Il a été montré que les indices topographiques peuvent guider le mouvement de nombreux types cellulaires, un processus appelé guidage par contact. Mes travaux de thèse ont ainsi cherché à tester et comprendre l’influence de la topographie de l’environnement sur la migration des interneurones corticaux. En utilisant un système expérimental de substrats microstructurés, nous avons mis en évidence pour la première fois l’existence du guidage par contact pour ces cellules. En testant deux types de micro-plots, nous avons établi qu’un changement de forme des structures influence de manière importante l’orientation, la morphologie, l’organisation du cytosquelette et le comportement dynamique des cellules. En particulier, les interneurones en migration entre des plots carrés adoptent majoritairement une morphologie allongée et peu branchée, associée à un mouvement lent et dirigé. A l’inverse, des cellules entre des plots ronds sont plus courtes et montrent un branchement important associé à un mouvement dynamique mais aléatoire. Plus généralement, nous montrons in vitro que la topographie génère des contraintes spatiales globales qui promeuvent la mise en place de différents états cellulaires morphologiques et dynamiques, soulignant ainsi la potentielle importance de ce type d’indices in vivo. / In the developing brain, cortical interneurons undergo a long distance migration to reach the cortex where they integrate into cortical networks and regulate their activity in the adult. Different chemical factors have been involved in the guidance of these cells, but the influence of the physical parameters of the environment in which they navigate remains unclear. It has been shown that topographical cues are able to influence and guide the migration of several cell types, a process called contact guidance. This work therefore aimed at testing and understanding the influence of the topography of the environment in the migration of cortical interneurons. By using an experimental system of microstructured substrates, we demonstrated for the first time the existence of contact guidance for these cells. By testing two types of micron-sized pillars, we showed that a change in the shape of the structures could greatly impact cell orientation, morphology, cytoskeleton organization and dynamic behavior. In particular, most interneurons migrating in between square pillars adopt an elongated, unbranched morphology associated with a slow and directed movement, whereas the majority of cells among round pillars exhibit a short and branched morphology associated with a dynamic but wandering movement. Overall, we show that micron-sized topography provides global spatial constraints promoting the establishment of different morphological and migratory states in vitro, highlighting the potential importance of these types of cues in vivo.

La polarisation des cellules est essentielle à la division cellulaire asymétrique, la migration cellulaire, la fonction neuronale et le développement embryonnaire. Elle peut se faire par le mécanisme de localisation des ARNm dans des compartiments cellulaires spécifiques. Bien que le mécanisme de localisation des ARNm soit assez bien défini dans tous les types cellulaires, son implication dans le développement du cancer n'a pas été caractérisée. Une étude de séquençage direct de l'ARN, réalisée sur des cellules métastatiques (HCCLM3) du carcinome hépatocellulaire (CHC) a déterminé qu'au niveau de leurs protrusions, certains ARNm y sont enrichis, alors qu'aux protrusions des cellules CHC non-métastatiques SMMC7721, ces ARNm n’y sont pas enrichis. L'ARNm qui encode pour le facteur de transcription STAT3 figure parmi ceux identifiés comme étant enrichis. La technique du smiFISH a été utilisée pour valider l'enrichissement de l'ARNm STAT3 au niveau des protrusions des cellules CHC associées à un phénotype métastatique. Les résultats obtenus démontrent que l'essai de déplétion de sérum permet d'induire la migration des cellules SMMC7721, HCCLM3 et MHCC97H, qui forment des protrusions de type lamellipode. En parallèle, l'expression de l'α-actinine-GFP a permis de visualiser les régions protrusives et de les délimiter. Les expériences de smiFISH et les mesures d'expression relative par RT-qPCR ont révélé que les cellules métastatiques HCCLM3 et MHCC97H expriment peu d'ARNm STAT3, comparativement aux cellules non-métastatiques SMMC7721. De plus, les quantifications absolues de l'enrichissement démontrent que dans toutes les lignées CHC, les molécules d'ARNm STAT3 uniques localisent majoritairement au niveau des corps cellulaires, et très peu dans les protrusions. Le ratio du nombre de molécules d'ARNm STAT3 uniques localisées dans les protrusions sur le nombre de molécules uniques localisées dans les corps cellulaires est nettement plus petit pour les cellules HCCLM3 et MHCC97H que pour les cellules SMMC7721. La densité de l'ARNm STAT3 / unité de surface dans les protrusions des cellules HCCLM3 et MHCC97H est inférieure à celle des cellules SMMC7721. Ensemble, ces résultats confirment qu'il n'y a pas d'enrichissement de l'ARNm STAT3 aux protrusions des cellules CHC associées à un phénotype métastatique. / Subcellular mRNA localization regulates cell polarization. Asymmetric distribution of transcripts is important in cell division, cell migration, neuronal function and embryonic development. In all cell types, the mechanisms of mRNA localization are well defined, but their involvement in cancer development is still unknown. A recent study has identified protrusion-localized STAT3 mRNA in metastatic hepatocarcinoma cells (HCCLM3). In comparison, the STAT3 mRNA was not found to be enriched in the non-metastatic cells (SMMC7721) protrusions. The enrichment of the STAT3 mRNA at the protrusions of HCC cells associated with a metastatic phenotype was studied by smiFISH. Our results showed that the serum starvation assay induced lamellipodia-based migration in SMMC7721, HCCLM3 and MHCC97H cells. Also, expression of GFP-α-actinin allowed to mark the protrusive regions of migrating HCC cells. The smiFISH results and RT-qPCR quantification revealed that the metastatic cells (HCCLM3 and MHCC97H) express lower levels of STAT3 mRNA compared to the non-metastatic cells (SMMC7721). Absolute quantification of localization and enrichment revealed that STAT3 mRNA mainly localizes in the cell bodies of all HCC cell lines. The ratio of the number of single molecules of STAT3 mRNA localized in the protrusions on the number of single molecules localized in the cell bodies is smaller for the metastatic cells than the non-metastatic cells. In the metastatic cells protrusions, the density of STAT3 mRNA / unit of surface was found the be lower than the non-metastatic cells. Altogether, these results confirm that there is no enrichment of STAT3 mRNA at the protrusions of metastatic HCC cells.

Le mélanome uvéal (MU) est une tumeur maligne intraoculaire rare qui touche environ 500 français par an. Malgré un traitement efficace de la tumeur primaire, la moitié des patients développent des métastases principalement hépatiques dans les années qui suivent le diagnostic. En dépit des nombreux efforts réalisés, les thérapies systémiques adjuvantes restent peu efficaces sur le MU métastatique. L’identification de gènes pronostiques et/ou causals du développement métastatique pourrait ainsi permettre des avancées considérables dans la compréhension de cette pathologie et le développement de nouvelles thérapies. Notre laboratoire a identifié la surexpression du gène codant la protéine tyrosine phosphatase PRL-3/PTP4A3 comme hautement prédictive du risque métastatique et du devenir des patients atteints de MU. Sa surexpression est également décrite dans de nombreux autres types de cancers humains métastatiques. La surexpression de PRL-3 dans des cellules de MU augmente significativement la migration cellulaire in vitro et l’invasion in vivo de manière dépendant de son activité catalytique, ce qui suggère un rôle direct de PRL-3 dans le processus métastatique du MU. De plus, nous avons montré qu’empêcher l’ancrage membranaire de PRL-3 en utilisant un inhibiteur de farnésylation (FTI-277) abolit la migration induite par PRL-3 dans les cellules de MU, ce qui révèle l’importance de son ancrage membranaire pour la migration cellulaire. Le but de ma thèse a été d’identifier et de caractériser des substrats cellulaires, et plus particulièrement membranaires, de PRL-3 qui seraient impliqués dans le processus métastatique du MU. Mes résultats montrent que la surexpression de PRL-3 dans des cellules de MU, empêchent l’adhérence des cellules au collagène I et la maturation de structures d’adhérence (FAs) en anneaux impliquant l’intégrine β1 (Itg β1), de manière dépendante de son activité catalytique et de son ancrage membranaire. Nous avons également montré que PRL-3 interagit avec l’Itg β1 et la déphosphoryle sur son motif de phosphorylation intracytoplasmique riche en S/T (T788 et T789), dont l’état de phosphorylation est connu pour réguler l’adhérence cellulaire. Ainsi, mes travaux de recherche ont permis d’identifier PRL-3 comme régulateur des structures d’adhérence à la matrice extracellulaire (MEC) au travers de la régulation de l’Itg β1 et potentiellement de la kinase FAK. De plus, dans les FAs nous avons observé que PRL-3 régule spécifiquement l’agrégation de l’Itg β1 mais pas celle de l’Itg β3, ainsi nous émettons l’hypothèse que cette régulation par PRL-3 serait différentielle entre les intégrines et dépendante de la MEC. Dans le MU, la migration accrue des cellules par PRL-3 peut également être expliquée par une accumulation de la métalloprotéase MT1-MMP/MMP14 à la surface des cellules. Cette protéine transmembranaire est responsable de la dégradation de différents substrats de la MEC et peut-être trouvée dans les FAs. Un travail auquel j’ai contribué, a montré que PRL-3 favoriserait l’accumulation de MMP14 à la membrane plasmique par l’accélération de son trafic vésiculaire. Enfin durant la dernière année de ma thèse, nous avons entrepris de tester les effets de la pentamidine, un antiparasitaire aux propriétés anti-cancéreuses, sur l’inhibition de l’activité de PRL-3. In vivo, la pentamidine induirait une inhibition moyenne de la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffes murins de MU et de métastases. Les essais in vitro sont encore en cours. / Uveal Melanoma (UM) is a rare tumor that affects around 500 French people each year. Despite a successful treatment of the primary tumor, 50% of patients develop metastasis primarily to the liver in the years following diagnosis. Currently, systemic adjuvant therapy has been unsuccessful for effective treatment. As such, identifying genes involved in both prognosis and metastasis is important for a better understanding of this disease and in turn for designing better treatment strategies. Our group previously identified that overexpression of the gene encoding PRL-3/PTP4A3, a protein tyrosine phosphatase, is highly correlated with metastatic tumor progression and predicts poor prognosis in patients with UM. It is also known that PRL3 is implicated in the metastatic process of various cancers. Overexpression of PRL-3, but not the inactive mutant of PRL3 (C104S), in an ocular melanoma cell line significantly increased cell migration in vitro and invasion in vivo, suggesting a direct role of PRL3 in the metastatic process in UM. We also showed that FTI-277, a farnesyltransferase inhibitor that prevents PRL-3 anchorage to the plasma membrane, abolishes PRL-3-induced UM cell migration on collagen I, suggesting that PRL-3 anchorage is important for cell migration. The aim of my thesis was to identify intracellular, and in particular, membrane substrates that could play a role in UM metastasis. My results show that PRL3 overexpression in UM cells prevents both the spreading of cells to the extracellular matrix (ECM), and the formation of large focal adhesions structures (FA) involving integrin β1 (Itg b1).These biological effects are PRL-3-activity and anchorage dependent. We show that PRL-3 interacts with and dephosphorylates Itg b1 on cytoplasmic threonine 788 and 789, residues that are known to be involved in cell adhesion. Our results identify PRL-3 as a new regulator of cell adhesion structures to the ECM via the regulation of Itg b1 and most likely the focal adhesion kinase (FAK). In FA, we observed that PRL-3 specifically regulates the aggregation of Itg b1 but does not affect integrin β3, so we suppose that this regulation could be specific to certain integrins. In UM cells, the PRL-3-induced cell migration could also be explained by membrane accumulation of the metalloprotease MT1-MMP/MMP14 in the presence of PRL3. This transmembrane proteinase is responsible for ECM degradation and can be found in FA. Moreover, we demonstrated that the vesicular trafficking of MT1-MMP is accelerated in the presence of active PRL-3 but not in presence of the inactive mutant of PRL-3 (C104S). During the last year of my thesis, another aspect of my PhD project was to study the biological effect of pentamidine, an antiparasitic which is known to inhibit the phosphatase activity of PRLs in vitro. In vivo, we show that pentamidine treatment induces a decrease of tumor growth in a UM patient-derived xerograph model. Overall, the results of my thesis suggest that PRL-3 plays an important role in UM metastasis.

Au cours de l'ovogenèse, les stades vitellogéniques nécessitent une énergie considérable, et leur formation doit être ajustée en fonction d'autres besoins physiologiques. En utilisant la drosophile comme modèle, j'ai montré que la signalisation Insuline régule une transition du cycle cellulaire, mitose/ endocyle (M/E), une étape critique qui contrôle l'entrée des follicules en vitellogenèse. Mes travaux montrent que la transition M/E porte le rôle d'un point de contrôle nutritionnel. La carence protéique induit un blocage de cette transition au travers d'une interaction entre FoxO, Cut et Notch, empêchant une perte d'énergie. Ce blocage reste réversible, autorisant la reprise de l'ovogenèse sous retour à une alimentation normale. Ce travail montre qu'un point de contrôle nutritionnel au cours de l'ovogenèse permet de coupler des signaux métaboliques et développementaux pour protéger les tissus des dommages liés à la carence. D'autre part, j'ai montré que la signalisation Insuline contrôle la migration d'une cohorte de cellules d'origine épithéliale pour assurer la fertilité de l'ovocyte. L'insuline participe à la formation d'extensions cytoplasmiques riches en actine. Lors de ce processus, la signalisation Insuline contrôle notamment l'expression de chickadee, qui code pour la Profiline, une protéine nécessaire pour la polymérisation de l'actine qui permet la motilité des cellules. L'ensemble de ce travail montre que des tissus somatiques assurent l'homéostasie de l'ovogenèse malgré des conditions de nutritions fluctuantes. Ces travaux posent les bases de l'étude de nouveaux aspects de l'ovogenèse, potentiellement conservés chez les mammifères.

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer. / The Gab1 scaffolding protein allows signaling of multiple Receptors Tyrosine Kinase (RTKs). Among other things, it allows VEGFR2 signaling, an essential RTK to mediate angiogenesis via VEGF in endothelial cells. In response to VEGF, Gab1 is tyrosine phosphorylated, resulting in the formation of a signaling protein complex involved in the remodeling of the actin cytoskeleton and the migration of endothelial cells. Gab1 is a key modulator of angiogenesis in vitro and in vivo. However, despite the importance of Gab1 in endothelial cells, the molecular mechanisms involved in mediating its functions remain poorly defined and the participation of the second family member, Gab2, remains unknown. Initially, we demonstrated that as with Gab1, Gab2 is tyrosine phosphorylated, it associates with similar signaling proteins and induces cell migration in response to VEGF in endothelial cells. However, Gab2 does not interact with VEGFR2 and is not essential for the activation of Akt and the promotion of cell survival. In fact, we found that the expression of Gab2 attenuates the expression of Gab1 and activation of VEGF-mediated signaling. In light of these results, we propose that in endothelial cells stimulated with VEGF, Gab2 acts as a negative regulator of pro-angiogenic signals induced by Gab1. Cell migration is a crucial step in angiogenesis, though, few studies have investigated the involvement of Gab1 in regulating different molecular mechanisms for actin remodeling leading to endothelial cell migration. We demonstrated that Gab1 mediates activation of Rac1 GTPase via the formation and localization of a protein complex including the GEF VAV2, p120 Catenin and Cortactin to lamellipodia of endothelial cells in response to VEGF. Furthermore, we show that the assembly of this complex correlates with the ability of VEGF to induce endothelial cell invasion and capillary sprouting, phenomena essential to the angiogenic process. RhoGTPases are also regulated by specific inactivators, "Rho GTPase activating proteins" or GAPs. The involvement of GAPs in promoting angiogenesis is relatively poorly described. Here we describe for the first time the role of the GAP CdGAP in endothelial cells and demonstrate its importance in mediating VEGF signaling via tyrosine phosphorylation of Gab1 and activation of Rac1 and Cdc42 RhoGTPases. Due to its importance in the activation of signaling pathways critical in VEGF signaling, CdGAP is thus an important protein for the regulation of various essential biological activities such as cell migration, sprouting and therefore in vitro and ex vivo angiogenesis. In addition, embryos of CdGAP knock-out mice exhibit vascular defects, excessive branching vessels, haemorrhages and edema which may be responsible for the 44% mortality seen in CdGAP knock-out mice expected. Our studies contribute to a better understanding of the molecular mechanisms induced by VEGF and demonstrate the central involvement of Gab1 and regulators of RhoGTPases in promoting angiogenesis. This understanding could lead to the identification of new targets and therapeutic approaches to improve the treatment of patients with uncontrolled neovascularization associated with diseases such as cancer.