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La migration cellulaire dirigée est un processus crucial lors du développement embryonnaire, de la cicatrisation, de la réponse immunitaire mais aussi lors de la formation de métastases. La réussite de ces processus nécessite que les cellules perçoivent un signal asymétrique, l'interprète et s'oriente pour migrer de façon dirigée. In vivo, la migration est dirigée par de nombreux signaux du microenvironnement cellulaire. L'hypoxie, ou diminution du niveau d'oxygène tissulaire, est une caractéristique importante de l'environnement cellulaire dans l'embryon et dans les tumeurs solides. Du fait de la limitation de la diffusion de l'oxygène, l'hypoxie génère in vivo des gradients d'oxygène. Nous avons développé une méthode originale dans laquelle des cellules épithéliales génèrent elles-mêmes gradient d'oxygène in vitro. Et de façon très intéressante, ces cellules sont capables de migrer de façon directionnelle vers des concentrations en oxygène plus élevées. Cette capacité d'aérotaxie est indépendante de la respiration mitochondriale et des acteurs de réponse à l'hypoxie. Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) seraient les médiateurs de la réponse migratoire au gradient. La production asymétrique de ROS entre l'avant et l'arrière des cellules serait à l'origine de l'activation différentielle du récepteur EGFR et de la persistance des cellules vers des concentrations plus importantes en oxygène. Cette capacité chimio-attractante de l'oxygène, connue chez les bactéries, mais non décrite pour des cellules eucaryotes, pourrait jouer un rôle majeur lors du développement embryonnaire et dans la dissémination métastatique / Cell migration is a crucial process during embryonic development, wound healing, immune system but also metastasis. Success of these processes relies on the capacities of cells to sense an asymmetric signal, interpret it and orient themselves to migrate in a directed manner. In vivo, migration is guided by several signals from the cellular microenvironment. Hypoxia, or decrease in the level of tissue oxygen, is an important feature of the cellular environment in the embryo and in solid tumors. Owing to the limitation of oxygen diffusion, hypoxia often generates oxygen gradients in vivo. We have developed an original method in which epithelial cells themselves generate oxygen gradient in vitro. And interestingly, these cells are able to migrate directionally to higher oxygen concentrations. This aerotaxis ability is independent of mitochondrial respiration and hypoxia response pathway. The reactive oxygen species (ROS) would mediate the migratory response to the gradient. The asymmetric production of ROS between the front and the back of the cells would be at the origin of the differential activation of the EGFR receptor and the persistence of cells towards higher oxygen concentrations. This chemoattractant capacity of oxygen, known in bacteria, but not described for eukaryotic cells, could play a major role in embryonic development and in metastatic dissemination

Une forte production de la chimiokine CCL2 par les cellules malignes et les cellules stromales a été démontrée dans la plupart des cancers humains. Ainsi, l’axe chimiokinique CCR2/CCL2 est un important marqueur du développement des cancers ; ce même axe est associé à la récurrence de tumeurs après thérapie anticancéreuses. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Treg) ont des capacités immunosuppressives robustes et contribue à la croissance tumorale. Durant cette thèse, je me suis intéressé à la fonction de l’expression du récepteur de chimiokine CCR2 par ces cellules dans le contexte de thérapies anticancéreuses. Nous avons montré que le récepteur de chimiokines CCR2 contrôle la migration des Treg en contexte tumoral, chez l’homme et la souris, et que son expression par les Treg peut servir de biomarqueur de la réponse à la chimiothérapie. Notre étude indique une nouvelle fonction de CCR2 et définie un nouveau sous-type de Treg impliqué dans la régulation de l’immunité antitumorale. En parallèle, nous avons pu mettre en évidence que les métastases pulmonaire sont composées à la fois de macrophages résident du tissu et de macrophages recrutés via l’axe CCR2. La présence de macrophages résidents au sein des tumeurs pourrait contribuer à l’hétérogénéité des microenvironnements de diffèrent type de tumeurs. Le récepteur CCR2 est important pour le la phase de rechute après chimiothérapie, indiquant un rôle limité des macrophages résidents dans ce phénomène. De plus, nous avons montré que le VEGF joue un rôle direct dans la survie des TAM. Ainsi, la combinaison de la chimiothérapie avec un anticorps anti-VEGF cible simultanément les TAM résidents et recrutés et permet d’augmenter l’efficacité de la chimiothérapie. / Malignant and stromal cells are strong producer of the chemokine CCL2 in most human cancers. The chemokine axis CCR2/CCL2 is thus a key marker of cancer development, but is also associated with relapse following therapy. Tumour associated macrophages (TAM) and regulatory T cells (Treg) display robust immunosuppressive capacities and contribute to tumour growth. My thesis work focused on the function of the expression of the chemokine receptor CCR2 by these cell types in the context of anticancer therapies. We have shown that CCR2 controls the migration of Treg in tumoral context, in both human and mice, and that the expression of this receptor by Treg could serve as a biomarker of the response to chemotherapy. Our study indicate a novel function of CCR2, defining at the same time a new Treg subset implicated in the regulation of antitumor immunity.We have also demonstrated that pulmonary metastases are composed of both tissue resident and recruited macrophages. The presence of resident macrophages within tumours could contribute to the heterogeneity of the microenvironment of different tumour types. CCR2 is largely implicated in the relapse phase following chemotherapy, indicating a limited role for resident macrophages in this phenomenon. Meanwhile, we have demonstrated that VEGF plays a direct role in TAM survival. The combination of chemotherapy with an anti-VEGF antibody targets both resident and recruited TAM, thereby enhancing the efficacy of chemotherapy. Finally, we have shown that the CCR2/CCL2 axis is implicated in the response to radiotherapy by enhancing the recruitment of both Treg and TAM. This work provides evidences for a central role of the CCR2/CCL2 axis in mediating Treg and TAM co-localization in response to anticancer therapy, this axis could also contribute to establishment of immunosuppressive networks in tumours. Our results provide a better understanding of the immune mechanism implicated in resistance to anticancer therapies.

Le succès de la réponse immunitaire repose en grande partie sur la capacité des leucocytes à se déplacer et à accomplir leur fonction au sein de structures anatomiques précises. Le fait qu’il puisse exister des mécanismes intrinsèques de coordination entre ces fonctions spécifiques et la migration de ces cellules n’a jamais été étudié auparavant. Nos travaux mettent en évidence, pour la première fois, l’existence d’un couplage entre la migration et la macropinocytose dans les cellules dendritiques qui explorent leur environnement en internalisant une grande quantité de matériel extra-cellulaire. C’est la Chaîne Invariante, protéine chaperon impliquée dans l’apprêtement des antigènes, qui est responsable de ce couplage en détournant le moteur Myosine II de l’arrière de la cellule, où elle promeut la migration, vers l’avant de la cellule. Ce recrutement transitoire de Myosin II autour des macropinosomes à l’avant favorise la macropinocytose et la délivrance de l’antigène dans les lysosomes, mais ralentit la cellule. L’implication de la Myosine II à la fois dans la migration et la capture d’antigène permet donc le couplage moléculaire entre ces deux processus et leur coordination spatio-temporelle. Cependant, les voies de signalisation impliquées dans le couplage avant/arrière dans les cellules dendritiques immatures restent encore méconnues. L’ensemble de mes travaux de thèse montrent que la libération de calcium du réticulum endoplasmique à travers les récepteurs IP3 (IP3Rs) est nécessaire pour maintenir le niveau de phosphorylation de la chaîne légère de Myosin (MLC) et la polarisation avant/arrière de Myosine II au cours de la migration des cellules dendritiques immatures. Nous montrons que les récepteurs IP3R1, 2 et 3 sont requis pour atteindre une vitesse maximale en 2- et 3-Dimension, et que le récepteur IP3R3, et dans une moindre mesure IP3R1, favorisent la persistance des cellules. En revanche, l’inhibition de l’expression du récepteur IP3R3 augmente la capacité des cellules dendritiques immatures à capturer l’antigène, ce qui est en accord avec notre résultat montrant que la capture de l'antigène est inversement reliée à la locomotion de cellules dendritiques. Nous proposons que le relargage du calcium par le réticulum endoplasmique favorise l’activité de la myosine II ce qui permet aux cellules dendritiques de ralentir de façon transitoire. Ce relargage calcique permet aux cellules dendritiques du optimiser l'internalisation des antigènes extracellulaires en maintenant leur polarité ce qui leur permet d’optimiser ainsi leur capacité d'échantillonnage de l’environnement. / The immune response heavily relies on the migration capacity of leukocytes. These cells must stop in precise anatomical locations to fulfill a particular task. But whether and how specific functions are coordinated with migration by cell-intrinsic mechanisms is not known. We here show that in dendritic cells, which patrol their environment for the presence of antigens by internalizing extracellular material, macropinocytosis is coupled to cell migration. Coupling relies on the diversion of the Myosin II motor from its migratory function at the cell rear to macropinosomes at the cell front by the Invariant Chain, a cell-specific regulator of antigen presentation. Transient Myosin II recruitment at the cell front promotes antigen macropinocytosis and antigen delivery to endolysosomes but antagonizes cell migration. Thus, the requirement for Myosin II for both migration and antigen capture provides a molecular mechanism to couple these two processes and allow their coordination in time and space. However, the signaling pathways involved in back/front coupling in migrating immature DCs remain unknown. Here we show that calcium released from the endoplasmic reticulum through IP3 Receptors (IP3Rs) is required to maintain Myosin regulatory light Chain (MLC) phosphorylation and Myosin II back/front polarization during DC locomotion. We found that while IP3R1, 2 and 3 are required for immature DCs to reach maximal speed in 2-Dimensional and 3-Dimensional environments, IP3R3 and to a lesser extent IP3R1 positively regulate their persistency. On the contrary, silencing of IP3R3 increases antigen uptake by immature DCs, consistent with our finding showing that antigen capture is inversely coupled to DC locomotion (Appendix, manuscript #1). We propose that by promoting myosin II activity, calcium released from the ER help DCs to transiently slow-down to uptake extracellular antigens without losing their polarity and thereby optimizes their environment sampling capacity.

Dans cette thèse, nous avons concentré notre étude sur les mécanismes qui génèrent la polarité cellulaire, en particulier dans le cas de la migration cellulaire. Malgré les derniers développements concernant l’observation de l’activité des RhoGTPases, les principes qui dictent la capacité des cellules à coordonner plusieurs modules de signalisation en parallèle ne sont toujours pas compris. L’optogénétique est un outil d’intérêt pour disséquer ces réseaux de signalisation à partir de la création d’une perturbation dont les caractéristiques spatiotemporelles sont contrôlées. Tout d’abord, à partir de la caractérisation des différents processus biophysiques en jeu, nous avons établi les relations quantitatives entre l’illumination et les gradients moléculaires que l’on induit. Nous avons déterminé qu’il est possible de créer des gradients subcellulaires avec une résolution spatiale de l’ordre de 5 μm et temporelle d’environ 3 minutes Ensuite, nous avons utilisé cette approche optogénétique pour contrôler l’activité de Cdc42, Rac1 et RhoA. Nous avons caractérisé les effets subcellulaires de l’activation de ces RhoGTPases en utilisant l’activité de membrane, les changements de forme cellulaire et leurs déplacements comme rapporteurs de la polarisation et de la migration. Nous avons ainsi montré qu’une activation locale de RhoGTPase permet la réorganisation interne des cellules jusqu’à générer un phénotype de migration.Enfin, nous avons caractérisé les effets d’une activation locale de RhoA sur différents acteurs moléculaires comme les points focaux d’adhésion, l’actine et les moteurs moléculaires myosines. Nous avons mesuré alors la dynamique de l’intégration des points focaux dans le cytosquelette et analysé la réponse du réseau d’acto-myosine au cours d’évènements de rétraction.Notre approche optogénétique couple le contrôle d’une perturbation à la mesure de la réponse cellulaire simultanément de manière directe et reproductible. Elle apporte une méthode pour contrôler la polarité cellulaire et une manière de disséquer des réseaux de signalisation à l’échelle subcellulaire. / In this thesis we focus on the mechanisms that establish cell polarization, particularly during cell migration. Despite latest developments that enable visualization of RhoGTPases activity, the underlying principles dictating the cell’s ability to coordinates multiple signaling modules is still unclear. Optogenetic methods have been recognized as promising tools to dissect these intracellular signaling networks by allowing perturbations to be spatially and temporally controlled. We established the quantitative relationship between illumination patterns and the corresponding gradients of induced signaling activity through the characterization of the biophysical properties of CRY2/CIBN. We determined that it is possible to create subcellular gradients of recruited proteins of different shapes of choice up to spatial resolutions of 5μm and temporal ones of ca. 3 minutes.We applied the aforementioned optogenetic approach as a means to perturb the activity of cdc42, Rac1 and RhoA. We characterized the effects of subcellular activation of those RhoGTPases using membrane activity, cell shape changes and cell displacement as reporters of cell polarization and migration. We show that localized activation of RhoGTPases can trigger cellular organization and drive the cell into a migrating state.We also characterized the effects of local activation of RhoA on different cellular effectors as focal adhesion complexes, actin filaments and myosin molecular motors. We measured the dynamics of the newly formed focal adhesion complexes and the acto-myosin complex during retraction events.Altogether, our optogenetic methodology enables simultaneous measurement of the imposed perturbation and the cell response in a straightforward and reproducible way. It provides a quantitative way to control cell polarity and a step forward in the dissection of subcellular signaling networks.

La migration cellulaire concerne des cellules individuelles ou bien des groupes de cellules migrant de manière collective et coordonnée. De nombreux processus physiologiques, notamment au cours du développement embryonnaire, ainsi que pathologiques, notamment lors de maladies inflammatoires ou de la formation de métastases nécessitent des mouvements cellulaire collectifs. Au cours de l'ovogénèse chez la Drosophile, un groupe de cellules, appelés cellules de bordure, migrent entre les cellules nourricières, collectivement, au sein du follicule ovarien. Ces cellules de bordure constituent un modèle de choix pour étudier les mécanismes régulant la migration collective in vivo. La migration de ce groupe de cellules est divisée en deux phases. Lors de la première moitié de migration, du début de la migration à la moitié du parcours, les cellules de bordure adoptent un mouvement linéaire, au cours duquel chaque cellule maintient sa position au sein de l'entité, et une seule et même cellule conduit le groupe vers l'avant. Ensuite, à mi-chemin, ces groupes commencent à effectuer des mouvements de rotation sur eux-mêmes pour aller atteindre l'ovocyte, permettant à n'importe quelle cellule de pouvoir mener la migration. L'objectif de ma thèse a été d'élucider les mécanismes régulant le choix entre ces deux modes de migration (linéaire et rotationnel). Le cytosquelette d'acto-myosine est un des acteurs principaux régulant la contraction cellulaire nécessaire à la motilité des cellules. Au cours de ma thèse, nous avons mis en évidence le rôle de la myosine non musculaire de type II dans le contrôle du passage d'un mouvement linéaire à rotationnel. Nos travaux démontrent que l'apparition des mouvements de rotation effectués par les cohortes de cellules de bordure est corrélée à une augmentation de l'activité de la myosine non musculaire de type II. De plus, nous avons montré que l'activité de la myosine non musculaire de type II pouvait être régulée de manière antagoniste par les récepteurs de guidance. En conclusion, mes travaux de thèse nous ont permis de démontré le rôle clé de la myosine non musculaire de type II dans l'adaptation du mode de migration au cours de mouvements collectifs des cellules de bordure. De plus nous avons identifié les facteurs régulant l'activité de la myosine non musculaire de type II. En effet, cette dernière est régulée positivement par EGFR. / In many biological processes, cells can move individually or in a coordinated and collective manner. Collective migrations are necessary during several embryo developmental processes, and pathologies such as inflammatory diseases or metastasis formation. During Drosophila oogenesis, border cells, a group of 6-10 cells, migrate in between nurse cell until the oocyte, within the egg chamber and provide a good model to study collective cell migration in vivo. Border cell migration is divided in to two phases. From the anterior pole of the egg chamber to the half of migrated distance, border cell adopt a linear movement, in which each cell maintain its position within the cluster and one leader cell drive the migration. Midway of the migration path, border cell clusters rotate to reach the oocyte. During this second phase, any cell can take the lead of the migration. The aim of my PhD research works was to identify mechanisms regulating the choice between linear and rotational movements. Acto-myosin cytoskeleton is one of the main regulators of cell contraction necessary for cell motility. Through our research, we demonstrated that non-muscle myosin II (NMII) regulate the switch between linear and rotational behaviour. These results led us to identify mechanisms regulating NMII activity during border cell migration. Border cells express two guidance receptors: PVR (Platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) receptor Related) and EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Recent studies shown that PVR play a crucial role in the first phase and EGFR predominantly regulate the second phase of migration. Our data shows that NMII is antagonistically regulated by PVR and EGFR. Indeed, the inhibition of NMII in border cell over expressing EGFR completely blocks the rotational movement To conclude, my PhD works allow us to demonstrate the key role of NMII for the regulation of border cell migration. Moreover, we found that EGFR positively regulates NMII activity.

Les cellules peuvent migrer sous différentes conditions qui dépendent de l’environnement biochimique ou mécanique. Connaître les mécanismes de la migration, les protéines impliquées et leur régulation est essentiel pour comprendre les processus de morphogénèse ou certaines situations pathologiques. Dans ce contexte, la migration collective des cellules est un processus clé qui intervient pendant le développement ainsi que dans la vie adulte. Elle joue un rôle très important pour la formation et l’entretien des couches épithéliales, notamment au cours du développement embryonnaire et pendant la cicatrisation des trous épithéliaux résultant, par exemple, d’une blessure. Lorsque l’épithélium présente une discontinuité, des mécanismes actifs qui impliquent une migration coordonnée des cellules sont nécessaires pour préserver l’intégrité des tissus. Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes impliqués dans la fermeture des trous dans un épithélium. Pour des blessures de faible taille, le mode de fermeture dit de purse string est souvent évoqué, impliquant la contraction d’un anneau contractile d’acto-myosine qui ferme la blessure. Pour des blessures de tailles plus importantes, il est courant d’observer un mécanisme différent conduisant { la migration active des cellules du bord qui couvrent la surface “libre”.Pour étudier ces aspects de manière quantitative et reproductible, nous avons développé une nouvelle méthode basée sur des techniques de microfabrication et de lithographie dite « molle » qui permet de faire une étude quantitative de la fermeture des trous épithéliaux. Nous avons fabriqué des substrats de micropiliers de diamètre et de forme variés dans les quels les cellules sont libres de pousser entre les microstructures. Lorsqu’elles sont parvenues à confluence, on retire le substrat qui laisse apparaître des trous contrôlés.De cette manière, nous avons observé que les cellules épithéliales forment des lamellipodes pour la fermeture de ces trous. Le mécanisme de fermeture dépend de la taille des trous et nous avons pu observer différents régimes en fonction de diamètre des piliers. Les trous petits (de la taille d’une seule cellule) sont fermés par un mécanisme passif alors que la fermeture de trous plus larges nécessite un mécanisme actif de migration conduisant à la formation de lamellipodes et à des modes de migration collective. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l’aspect mécanique de la fermeture des trous épithéliaux. Pour cela, nous avons utilisé un système d’ablation laser pour rompre quelques cellules dans une monocouche épithéliale. Nous avons alors mesuré les forces de traction que les cellules exercent au substrat et leur évolution temporelle et spatiale. Nous avons pu mettre en évidence différents modes de traction: au début, les cellules exercent des forces de traction importantes sur leur substrat pour laisser place à des contraintes mécaniques qui sont davantage issues d’un processus collectif au travers de la formation d’un câble multicellulaire qui les relie les cellules de bord entre elles. En conclusion, ce travail nous a permis d’obtenir des informations sur les mécanismes dynamiques de fermeture des tissus épithéliaux qui sont évidemment impliqués dans la cicatrisation des blessures mais aussi dans certains problèmes de malformations congénitales lors l’embryogenèse. / Most cells migrate under the appropriate conditions or stimuli; understanding the mechanisms of migration, the players involved, and their regulation, is pivotal to tackle the pathological situations where migration becomes an undesired effect. While largely overshadowed by the study of single cell migration, collective cell migration is a very relevant process that takes place during development as well as in adult life. Collective migration is very relevant for the formation and maintenance of epithelial layers: extensive migratory processes occur during the shape of the embryo, as well as during the healing of a skin incision in the adult. When openings or discontinuities appear in the epithelia, it is crucial that the appropriate mechanisms are activated.In the present work we attempt at deciphering what are the mechanisms involved in gap closure. Until now, most of the literature concerning the subject has reported contradictory results, mainly arising from the complexity of the process and the lack of systematic analysis. We have designed a novel approach to address epithelial gap closure under well-defined and controlled conditions. By using our gap patterning method, we have observed that epithelial cells extend lamellipodia when exposed to a newly available space. Interestingly, we found that the closure of such gap depends on the size: small gaps are closed by a passive physical mechanism, while large gaps are closed through a Rac-dependent cell crawling mechanism, in a collective migration-like manner. 11Abstract (English)Most cells migrate under the appropriate conditions or stimuli; understanding the mechanisms of migration, the players involved, and their regulation, is pivotal to tackle the pathological situations where migration becomes an undesired effect. While largely overshadowed by the study of single cell migration, collective cell migration is a very relevant process that takes place during development as well as in adult life. Collective migration is very relevant for the formation and maintenance of epithelial layers: extensive migratory processes occur during the shape of the embryo, as well as during the healing of a skin incision in the adult. When openings or discontinuities appear in the epithelia, it is crucial that the appropriate mechanisms are activated.In the present work we attempt at deciphering what are the mechanisms involved in gap closure. Until now, most of the literature concerning the subject has reported contradictory results, mainly arising from the complexity of the process and the lack of systematic analysis. We have designed a novel approach to address epithelial gap closure under well-defined and controlled conditions. By using our gap patterning method, we have observed that epithelial cells extend lamellipodia when exposed to a newly available space. Interestingly, we found that the closure of such gap depends on the size: small gaps are closed by a passive physical mechanism, while large gaps are closed through a Rac-dependent cell crawling mechanism, in a collective migration-like manner. Next, we also addressed the mechanical component of epithelial gap closure. In this study, we took advantage of a laser-ablation system to disrupt some cells within an epithelial monolayer, and study how the remaining cells sealed that gap. By measuring the traction forces that cells exert on the substrate along the closure, we observed that cells first pulled on the substrate to propel themselves. By the last steps of closure, there is a transition in the direction of the force, so that cells are pulled to the center of the gap due to the assembly of a supracellular actin cable. Altogether, this work provides valuable knowledge on the current understanding of the mechanisms accounting for epithelial gap closure. We believe that a better comprehension of these mechanisms can help to shed light in clinically relevant situations where epithelial gap closure is impaired.

La migration cellulaire joue un rôle essentiel dans le développement des organismes multicellulaires et dans certaines pathologies comme le cancer, où elle permet la formation de métastases. Le trafic vésiculaire est un régulateur clé de la migration cellulaire, notamment en contrôlant la localisation de protéines impliquées dans la migration telles que les intégrines, les cadhérines et les récepteurs transmembranaires. En particulier, notre laboratoire a montré que l'endocytose contrôle l'orientation et la communication cellulaire durant la migration cellulaire collective. Notre hypothèse est que d'autres événements du trafic vésiculaire pourraient aussi être impliqués dans ce type de migration. Ainsi, le but de cette thèse a été de déterminer la fonction des petites GTPases Arf, importantes pour la formation de vésicules et le tri de cargo dans ces vésicules et de leurs régulateurs dans la migration cellulaire collective. Un modèle pour étudier la migration cellulaire collective est les chambres d’œufs de Drosophila melanogaster. En effet, lors de l’ovogénèse, des cellules folliculaires appelées cellules de bordure migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Conformément à notre hypothèse, un fort défaut de migration est observé lorsque les Arfs sont déplétées spécifiquement dans les cellules de bordure. De plus, un constat similaire est observé après la déplétion de certains régulateurs des Arfs (ArfGAPs et ArfGEFs). Notamment, nous avons démontré que l’ArfGAP Drongo et sa fonction d'activation de l’activité GTPase sont essentielles pour le détachement initial des cellules de bordure du tissu folliculaire. Drongo promeut le détachement en contrôlant la localisation de la myosine phosphatase afin de réguler l’activité de la myosine II à l’arrière des cellules. De plus, nous avons montré que Drongo agit sur l’Arf de classe III (Arf51F) de manière antagoniste à l’ArfGEF Steppke pour déplacer la myosine phosphatase de l’arrière du groupe de cellules. D’un autre côté, nous avons aussi démontré qu’une autre GAP, ArfGAP1, contrôle la directionnalité de migration. Cette ArfGAP agit potentiellement en régulant la localisation de certains déterminants de la migration tels que l’E-cadhérine et les récepteurs tyrosine kinase. Ainsi, nos recherches ont démontré un rôle essentiel des Arfs ainsi que des rôles spécifiques de deux ArfGAPs dans la migration cellulaire collective. / Cell migration is implicated in various important biological processes, notably it is central for the dissemination of cancer cells. Vesicular trafficking is a key regulator of cell migration, notably by controlling the localisation of proteins involved in migration such as integrins, cadherins and transmembrane receptors. In particular, our laboratory has shown that endocytosis controls orientation and cellular communication during collective cell migration. Our hypothesis is that other events of vesicular trafficking might be implicated in collective cell migration. Thus, the purpose of this thesis was to assess the function of small GTPases Arf, important for vesicle formation and cargo sorting into those vesicles, and their regulators in collective cell migration. A powerful model to study collective cell migration is the migration of follicular cells named border cells during oogenesis in Drosophila melanogaster. Border cells (BCs) detach from the follicle epithelium surrounding the egg chambers and form a small cluster of six to ten cells that migrates invasively between the giant nurse cells that compose the center of the egg chamber, toward the oocyte. Accordingly to our hypothesis, a strong migration defect is observed when the Arfs are depleted specifically in the border cells. Moreover, a similar finding is observed after depletion of some Arfs regulators (ArfGAPs and ArfGEFs). In particular, the ArfGAP Drongo and its GTPase-activating function are essential for the initial detachment of the border cell cluster from the basal lamina. We demonstrated through protein localization and genetic interactions that Drongo controls the localisation of the myosin phosphatase in order to regulate myosin II activity at the back of the cluster and promote border cells detachment. Moreover, we showed that Drongo acts on the class III Arf (Arf51F) antagonistically to the guanine exchange factor Steppke to displace myosin phosphatase from the back of the cluster. On the other hand, we have also demonstrated that the GAP ArfGAP1 controls the directionality of migration. This ArfGAP potentially acts by regulating the localization of certain determinants of migration such as E-cadherin and receptors tyrosine kinase. Thus, our research has demonstrated an essential role for Arfs in collective cell migration and specific contributions of two ArfGAPs in this migration process.

La morphogenèse cellulaire représente l’ensemble des évènements qui dictent la forme et la structure d’une cellule. Ces changements morphologiques sont importants pour de nombreux mécanismes vitaux, comme le développement embryonnaire, la réaction inflammatoire ou encore la cicatrisation. Pour cela, la morphogénèse cellulaire dépend principalement du remodelage du cytosquelette cellulaire qui, une fois associé à la membrane plasmique, forme l’armature de la cellule. L’ezrine, la radixine et la moésine appartiennent à la famille de protéines ERM et lient la membrane plasmique au cytosquelette d’actine et aux microtubules. De ce fait, les protéines ERM sont impliquées dans différents processus fondamentaux nécessitant un remodelage du cortex cellulaire tels que la mitose et la migration. Dans un contexte pathologique, la surexpression et/ou la sur-activation des protéines ERM corrèlent avec un haut potentiel métastatique et un pauvre pronostic chez les patients. Une meilleure compréhension de la régulation de ces trois protéines pourrait ainsi aider au développement de nouvelles solutions thérapeutiques. L’objectif de mon doctorat portait sur l’identification et la caractérisation de nouvelles voies de signalisation régulant les protéines ERM. Dans un premier temps (i), j’ai participé au développement et la caractérisation de sondes BRET2 permettant de suivre l’activité de chaque protéine ERM en temps réel. Ces sondes BRET2 sont d’ailleurs compatibles avec des études à grande échelle ce qui nous permettra de réaliser des cribles génomiques et chimiques dans le but d’identifier, respectivement, de nouveaux régulateurs et inhibiteurs pharmacologiques des protéines ERM. Ensuite (ii), grâce aux sondes BRET2, nous avons identifié les microtubules en tant que nouveaux régulateurs négatifs des protéines ERM. Nous avons alors montré que la dépolymérisation des microtubules d’interphase à l’entrée en mitose participe à l’activation des protéines ERM et à l’arrondissement cellulaire. Enfin (iii), nous avons montré que le récepteur couplé aux protéines G TPα régule l’activité des protéines ERM dans des cellules de cancer du sein triple négatif. Cette régulation est d’ailleurs importante pour la motilité de ces cellules. Pour conclure, en plus d’avoir développé de nouveaux outils utiles pour des études à grande échelle, mon travail de doctorat a permis de mettre en lumière deux nouvelles voies de signalisation régulant les protéines ERM au cours de la mitose et la migration cellulaire. Sans compter l’apport de nouvelles informations sur un aspect fondamental, mon travail a apporté de nouvelles pistes de réflexion quant aux rôles des protéines ERM dans le développement des métastases. / Cell morphogenesis represents the set of events that dictate the shape and structure of a cell. These morphological changes are important for many vital mechanisms such as embryonic development, inflammatory response, or wound healing. Cell morphogenesis depends mainly on the remodeling of the cell cytoskeleton which forms the framework of the cell when associated with the plasma membrane. Ezrin, radixin and moesin belong to the ERM family and crosslink the plasma membrane to the actin cytoskeleton and microtubules. Therefore, ERMs are involved in various fundamental processes requiring remodeling of the cell cortex such as mitosis and migration. In a pathological context, overexpression and/or overactivation of ERMs correlate with high metastatic potential and poor prognosis in patients. Thus, a better understanding of the regulation of these three proteins could help in the development of new therapeutic solutions. The aim of my PhD work was to identify and characterize novel signaling pathways regulating ERMs. In a first step (i), I participated in the development and characterization of BRET2 biosensors allowing to follow the activity of each ERM protein in real time. These BRET2 biosensors are compatible with large-scale studies which will allow us to perform genomic and chemical screens to identify, respectively, new upstream regulators and pharmacological inhibitors of ERMs. Secondly (ii), based on BRET2-chemical screen, we identified microtubules as new negative regulators of ERMs. We then showed that depolymerization of interphase microtubules at mitosis entry triggers ERM activation and cell rounding. Finally (iii), we showed that the G protein-coupled receptor TPα regulates the activity of ERMs in triple negative breast cancer cells. This regulation is important for the motility of these cells. To conclude, in addition to having developed new tools useful for large-scale studies, my PhD work has uncovered two new signaling pathways regulating ERMs during mitosis and cell motility. In addition to providing new information on a fundamental aspect, my work has provided new insights into the roles of ERMs in the development of metastasis.

La caractérisation d’échantillons biologiques s’effectue très souvent au microscope optique. Or, il est techniquement difficile d’isoler quelques cellules rares parmi une culture hétérogène en se basant strictement sur des caractéristiques observables au microscope, comme la localisation, la morphologie ou le déplacement, car il n’existe pas nécessairement de marqueur moléculaire unique qui leur sont associés. Afin de répondre à cet enjeux, le laboratoire dans lequel j’ai effectué mon stage de maîtrise a récemment développé la Single Cell Magneto Optical Capture (scMOCa), qui utilise des réactifs communs et un laser de faible puissance pour attacher des billes ferromagnétiques à la membrane plasmique cellulaire et permet d’isoler magnétiquement les cellules d’intérêt. Le présent ouvrage rapporte l’application de la scMOCa à la migration de cellules métastatiques ainsi que les adaptations apportées à la technique nécessaires à la réalisation du projet. Notamment, le volume de cellules uniques capturé a été augmenté d’un facteur d’environ 250 grâce à l’automatisation de la technique et à l’étude du photoblanchiement de la fluorescéine, phénomène à la base de la scMOCa. Brièvement, l’expérience consiste à capturer les cellules uniques présentant les phénotypes migratoires les plus importants, définis par l’analyse de leur trajectoire, parmi une culture hétérogène de cellules métastatique. Les résultats de l’expérience démontrent une conservation des phénotypes migratoires après plusieurs mitoses. Aussi, l’expression génétique relative fait ressortir des gènes et groupes de gènes propres à la migration cellulaire. / The characterization of biological samples depends heavily on the optical microscope. However, it is technically challenging to isolate rare cells among a heterogeneous culture solely based on visual inspection at the microscope. Indeed, characteristics like location, morphology or displacement do not necessairly have specific related molecular markers. In order to solve this issue, the laboratory where I accomplished my master internship developped the Single Cell Magneto Optical Capture (scMOCa) wich uses commun reagents and a low powered laser to attach ferromagnetic beads on the cell plasma membrane and isolate the cells of interest with magnetic tools. The present work reports the application of scMOCa to the metastatic cell migration and the implemented adaptations to the technique in order to carry out the project, especially by increasing the number of single cells being isolated by a factor of 250. This adaptation requiered the study of photobleaching, phenomenon at the foundation of scMOCa. Briefly, the experiment consists to capture the cells presenting the most important migratory phenotypes, defined by their track analysis, among a heterogeneous metastatic cell culture. The experimental results show that the migratory phenotypes are preserved after several cell divisions. Also, the relative gene expression highlights some genes and gene groups owned to cellular migration.