Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2005.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2005

De senaste decennierna har en miniatyriseringstrend inom ingenjörsvetenskaperna blivit allt större. Komplexa maskiner eller processer skalas ner till en allt mindre skala. Det kan vara motorer som inte är större än 500 μm eller kemiska analyser som vanligtvis görs på en större laboratorieutrustning som nu går att utföra på en yta på ca 2x4 cm. En sådan utrustning som kan utföra kemiska analyser kallas ofta för ”Lab-on-a-Chip” (LoC) och innehåller kemiska kretsar som hanterar mikroflöden av analysvätskor. En del av dagens forskning för att ta fram nya LoC handlar om att möta ett behov av portabel, billig och snabb analysutrustning i utvecklingsländer. Dock finns ett problem med att få ut produkter på marknaden. De flesta LoC som presenteras i forskningsrapporter idag är tillverkade av polydimetylsiloxan (PDMS). Det är en elastomer som lämpar sig väl för småskalig prototypframställning, men är svår att producera i stor skala, dessutom krävs ofta extern utrustning för att vätskeflöde skall uppstå. Det finns även LoC i papper, vilkas porösa struktur möjliggör för spontan vätsketransport, wicking, utan extern utrustning. Dessa är billiga och har nått större framgång. Exempelvis är vanliga graviditetstest som går att köpa på apoteket ofta LoC i papper. Textiliers fukt- och vätskehantering är relevant för komfort, och för många beredningsprocesser. Exempelvis är wicking ett välstuderat område som det finns djup kunskap om i den textila sektorn. Denna kunskap kan utnyttjas för att skapa ett textilt LoC. Att använda textila tekniker innebär möjligheter att styra vätskeflödet med hjälp av garn med och utan wickingförmåga. Denna studie undersöker hur en vävs naturliga X-Y-system av varp- och väftgarner kan utnyttjas för att skapa en kontrollerad vätskestyrning, en textil kemisk krets. Arbetet har utgått från frågan om hur en väv kan konstrueras för att leda en vätska från ett varpgarn till ett väftgarn utan läckage i oönskad del av väven. Två olika garner valdes: ett monofilament av polyeten för de områden där vätskeledning ej var önskvärd och ett multifilament av Coolmax® polyester med god wickingförmåga där vätskan vara avsedd att transporteras. Tre parametrar testades; bindningen i de delar av väven som var avsedd för vätsketransport (önskad väg); bindningen där vätskan skulle övergå från ett varpgarn till ett väftgarn (vägskälet); och antalet wickande trådar (trådigheten). Åtta olika kombinationer avseende dessa parametrar testade. Samtliga parametrar hade signifikant inverkan på läckaget. Den konstruktion med minst läckage in i oönskad väg var den med bindning över två trådar i önskad väg, flotteringar i vägskälet och var tvåtrådig. Den framtagna vävens möjlighet att användas i en biosensor undersöktes genom ett försök att konstruera en elektrokemisk glukosmätare. Som elektroder valdes en silverbelagd polyamid. Vid preparering av elektroderna skedde en oväntad reaktion mellan det silverbelagda garnet och en av de ingående kemikalierna, prussian blue. Därför kunde ingen detektion av glukos ske. Det noterades även att den textila kemiska kretsens wickingförmåga försämrades då den utsattes för våta prepareringsprocesserna av elektroderna. Från experimentet med att konstruera en textil glukosmätare drogs slutsatsen att preparering av elektroderna bör ske innan invävning i den textila kemiska kretsen.

Zugl.: Braunschweig, Techn. Univ., Diss., 2008

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung bisensitiver Hydrogelsysteme für die Realisierung hoch leistungsfähiger chemischer Transistoren in der Mikrofluidik. Dabei wurden unterschiedliche (semi)interpenetrierende Polymernetzwerke auf Basis von N Isopropylacrylamid und Acrylsäure hergestellt und ihre Quelleigenschaften und mechanischen Stabilität bei unterschiedlichen Stimuli untersucht. Hierfür wurde die TANAKA-Kinetik modifiziert, um sie auf Proben unterschiedlicher Aspektverhältnisse anpassen zu können. Es zeigte sich der wechselseitige Einfluss der Teilnetzwerke auf die Quellgeschwindigkeit und Stabilität der (semi)interpenetrierende Polymernetzwerke. Durch eine Optimierung der Synthese konnten die Volumenänderungen der sensitiven Hydrogele gesteigert werden.

The investigation of the physical properties of deoxyribonucleic acid under confinement is an essential step for the all-embracing understanding of the replication and transcription in living cells as well as for the development of the biomimetic nanotechnology. The following report addresses the measure-ment and interpretation of the intramolecular diffusion along stretched λ-DNA-molecules. This work comprises the fabrication of submicroscopic channels via softlithography, the integration of the chan-nels in an experimental setup with a fluorescence microscope and a source-measurement unit, and the experiments with the DNA-stretching in electrical field. The important results are the development of a measuring assembly with stable, softlithographic structures in Ormostamp, the direct imaging and measurement of the intermolecular diffusion along stretched DNA-molecules in channels with cross sections down to 100 x 300 nm2, and the qualitative and quantitative analysis on the basis of models of polymer physics.

The mechanical parameters of biological cells are relevant indicators of their function or of disease. For example, certain cancerous cells are more deformable than healthy cells. The challenge consists in developing methods that can measure these parameters while not affecting the cell. The Optical Stretcher is a microfluidic system that deforms single suspended cells without contact using lasers and determines the cells’ viscoelastic properties. The advantage compared to standard methods of molecular biology is that cells do not need to be treated with additional markers. Basic versions of the Optical Stretcher have existed for some years. These allow the measurement of homogeneous cell populations. Up until now, it was only possible to calculate average population values of compliance. To characterize inhomogeneous populations however, it is necessary to consider each single cell and measure additional mechanical or optical parameters such as the refractive index. This work highlights various extensions of the Optical Stretcher. A novel procedure, including an improved image processing algorithm, is presented to analyze mechanical data in real time. In combination with measurements of the optical refractive index, single cells can now be characterized in more detail. Moreover, it is now possible to extract interesting subpopulations that can be further examined with molecular biology techniques. Depending on the intended purpose, novel devices for cell measurements, based on microfluidic and optical considerations, are presented. The fundamental concept involves microstructured chips that can be integrated into a commercial microscope. These chips offer the possibility of separating measured cell populations according to their mechanical properties. This separation, including mathematical classification, is demonstrated. These methods are tested with cell types of differing mechanical properties to prove their applicability in practice. Single cells are sorted into their respective population of origin. These novel methods offer the possibility of a versatile device to be applied in biophysical research.

Als Totalanalysesysteme (TAS) werden Geräte bezeichnet, welche komplette chemische Analysen eigenständig ausführen. Die Einführung solcher Systeme ermöglicht einen effizienteren Arbeitsablauf in Analyselaboren, da beispielsweise die Probenmanipulation, Aufreinigung und die physikalisch-/chemische Analyse automatisiert in einem Arbeitsgang durchgeführt werden können. Die speziellen Mikrototalanalysesysteme benötigen geringere Probemengen im $\mu$L- Bereich. Durch Kontamination, Agglomeration oder einem Verschluss etwaiger Kanäle in mikrofluidischen Totalanalysesystemen kann es zu einem kompletten Systemausfall kommen. Eine Alternative bildet die akustische Levitation, um derartige Störfälle durch gänzlichen Verzicht auf Gefäße und Wandkontakte gezielt zu reduzieren. Damit die akustische Levitation erfolgreich in Mikrototalanalysesystemen Anwendung finden kann, bedarf es der technischen Weiterentwicklung von Analysemethoden und Kopplungstechniken. In der vorliegenden Arbeit wird das Hauptaugenmerk auf die Kopplung von Levitationstechnik und Massenspektrometrie gelegt. Darüber hinaus wurden spektroskopische Experimente durchgeführt, welche auf Totalreflektionen innerhalb der Tropfen beruhen. Die besonders gute Reflektion hängt damit zusammen, dass sich die Phasengrenze zwischen Luft und Flüssigkeit im Schwebezustand durch molekulare Wechselwirkungen ständig erneuert und keine produktionsbedingte raue Oberfläche aufweist. Die Kombination aus automatischer Tropfengenerierung, Spektroskopie sowie der entwickelten Methode zur Ionenerzeugung aus dem Probevolumen und der massenspektrometrischen Analyse bilden die Grundlage eines neuartigen Mikrototalanalysesystems für geringe Probemengen. / As a total analysis system (TAS) an instrument is called which carries out complete chemical analysis procedures independently. The introduction of such systems offers a more efficient workflow in analytical laboratories because the sample manipulation, purification and the actual automated analysis can be carried out in one single operation. Specialized and already existing micro total analysis systems require currently a small amount of sample in the $\mu$L range. Owing to contamination, agglomeration and thus cross-secion reduction of incorporated channels in micro fluidics total analysis systems it can lead to a complete system interruption. Hence, the implementation of acoustic levitation in these systems is interessting alternative in order to avoid such kind of problems by abandoning vessels and wall contacts completely. To ensure acoustic levitation in micro total analysis systems can be successfully applied, technical development of analytical methods and coupling techniques is required. In the present work, the coupling of levitation technology and mass spectrometry is the prioritized topic but, in addition, spectroscopic experiments based on total reflections within the levitated droplet are as well realized in order to gain process insights. The particularly good reflection at the freely levitated droplet's circumference is due to the fact that the phase boundary between air and liquid is renewed by molecular interactions constantly and has no production-related rough surface. The combination of automated droplet generation, spectroscopy as well as the developed method for ion generation from the sample volume and mass spectrometry forms the basis of a novel micro total analysis system for small sample quantities.

For the elucidation of the dynamics of signal transduction processes that are induced by cellular interactions, defined events along the signal transduction cascade and subsequent activation steps have to be analyzed and then also correlated with each other. This cannot be achieved by ensemble measurements because averaging biological data ignores the variability in timing and response patterns of individual cells and leads to highly blurred results. Instead, only a multi-parameter analysis at a single-cell level is able to exploit the information that is crucially needed for deducing the signaling pathways involved. The aim of this work was to develop a process line that allows the initiation of cell-cell or cell-particle interactions while at the same time the induced cellular reactions can be analyzed at various stages along the signal transduction cascade and correlated with each other. As this approach requires the gentle management of individually addressable cells, a dielectrophoresis (DEP)-based microfluidic system was employed that provides the manipulation of microscale objects with very high spatiotemporal precision and without the need of contacting the cell membrane. The system offers a high potential for automation and parallelization. This is essential for achieving a high level of robustness and reproducibility, which are key requirements in order to qualify this approach for a biomedical application. As an example process for intercellular communication, T cell activation has been chosen. The activation of the single T cells was triggered by contacting them individually with microbeads that were coated with antibodies directed against specific cell surface proteins, like the T cell receptor-associated kinase CD3 and the costimulatory molecule CD28 (CD; cluster of differentiation). The stimulation of the cells with the functionalized beads led to a rapid rise of their cytosolic Ca2+ concentration which was analyzed by a dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the Ca2+-sensitive dye Fura-2. After Ca2+ imaging, the cells were isolated individually from the microfluidic system and cultivated further. Cell division and expression of the marker molecule CD69 as a late activation event of great significance were analyzed the following day and correlated with the previously recorded Ca2+ traces for each individual cell. It turned out such that the temporal profile of the Ca2+ traces between both activated and non-activated cells as well as dividing and non-dividing cells differed significantly. This shows that the pattern of Ca2+ signals in T cells can provide early information about a later reaction of the cell. As isolated cells are highly delicate objects, a precondition for these experiments was the successful adaptation of the system to maintain the vitality of single cells during and after manipulation. In this context, the influences of the microfluidic environment as well as the applied electric fields on the vitality of the cells and the cytosolic Ca2+ concentration as crucially important physiological parameters were thoroughly investigated. While a short-term DEP manipulation did not affect the vitality of the cells, they showed irregular Ca2+ transients upon exposure to the DEP field only. The rate and the strength of these Ca2+ signals depended on exposure time, electric field strength and field frequency. By minimizing their occurrence rate, experimental conditions were identified that caused the least interference with the physiology of the cell. The possibility to precisely control the exact time point of stimulus application, to simultaneously analyze short-term reactions and to correlate them with later events of the signal transduction cascade on the level of individual cells makes this approach unique among previously described applications and offers new possibilities to unravel the mechanisms underlying intercellular communication. / Zelluläre Interaktionen sind wirkungsvolle Mechanismen zur Kontrolle zellulärer Zustände in vivo. Für die Entschlüsselung der dabei beteiligten Signaltransduktionsprozesse müssen definierte Ereignisse entlang der zellulären Signalkaskade erfasst und ihre wechselseitige Beziehung zueinander aufgeklärt werden. Dies kann von Ensemble-Messungen nicht geleistet werden, da die Mittelung biologischer Daten die Variabilität des Antwortverhaltens individueller Zellen missachtet und verschwommene Resultate liefert. Nur eine Multiparameteranalyse auf Einzelzellebene kann die entscheidenden Informationen liefern, die für ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalwege unabdingbar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Methode, welche die gezielte Kontaktierung einzelner Zellen mit anderen Zellen oder Partikeln ermöglicht und mit der die dadurch ausgelösten zellulären Reaktionen auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen analysiert und miteinander korreliert werden können. Da dies die schonende Handhabung einzeln adressierbarer Zellen erfordert, wurde ein auf Dielektrophorese (DEP) basierendes mikrofluidisches System eingesetzt, welches die berührungslose Manipulation mikroskaliger Objekte mit hoher zeitlicher und örtlicher Präzision erlaubt. Das System besitzt ein hohes Potential zur Automatisierung und Parallelisierung, was für eine robuste und reproduzierbare Analyse lebender Zellen essentiell, und daher eine wichtige Voraussetzung für eine Anwendung in der Biomedizin ist. Als Modellsystem für interzelluläre Kommunikation wurde die T-Zell-Aktivierung gewählt. Die Aktivierung der einzelnen T-Zellen wurde durch ihre gezielte Kontaktierung mit Mikropartikeln („beads“) induziert, welche mit Antikörpern gegen spezielle Oberflächenproteine, wie die dem T-Zell-Rezeptor assoziierte Kinase CD3 oder das kostimulatorische Protein CD28, beschichtet waren. Die Stimulation der Zellen mit den funktionalisierten beads führte zu einem raschen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, welche über eine ratiometrische Detektion des Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs Fura-2 gemessen wurde. Anschließend wurden die einzelnen Zellen aus dem mikrofluidischen System isoliert und weiterkultiviert. Am nächsten Tag wurden Zellteilung und die CD69-Expression – ein wichtiger Marker für aktivierte T-Zellen – analysiert und auf Ebene der individuellen Zelle mit dem zuvor gemessenen Ca2+-Signal korreliert. Es stellte sich heraus, dass der zeitliche Verlauf des intrazellulären Ca2+-Signals zwischen aktivierten und nicht aktivierten, sowie zwischen geteilten und nicht geteilten Zellen signifikant verschieden war. Dies zeigt, dass Ca2+-Signale in stimulierten T-Zellen wichtige Informationen über eine spätere Reaktion der Zelle liefern können. Da Einzelzellen äußerst empfindlich auf ihre Umgebungsbedingungen reagieren, war die Anpassung der experimentellen Vorgehensweise im Hinblick auf die Zellverträglichkeit von großer Bedeutung. Vor diesem Hintergrund wurde der Einfluss sowohl der mikrofluidischen Umgebung, als auch der elektrischen Felder auf die Überlebensrate und die intrazelluläre Ca2+-Konzentration der Zellen untersucht. Während eine kurzzeitige DEP-Manipulation im mikrofluidischen System die Vitalität der Zellen nicht beeinträchtigte, zeigten diese unregelmäßige Fluktuationen ihrer intrazellulären Ca2+-Konzentration selbst bei geringer elektrischer Feldexposition. Die Ausprägung dieser Fluktuationen war abhängig von der Expositionszeit, der elektrischen Feldstärke und der Feldfrequenz. Über die Minimierung ihres Auftretens konnten experimentelle Bedingungen mit dem geringsten Einfluss auf die Physiologie der Zellen identifiziert werden. Die Möglichkeit, einzelne Zellen zeitlich definiert und präzise mit anderen Zellen oder Oberflächen zu kontaktieren, die unmittelbare Reaktion der Zellen zu messen und diese mit späteren Ereignissen der Zellantwort zu korrelieren, macht die hier vorgestellte Methode einzigartig im Vergleich mit anderen Ansätzen und eröffnet neue Wege, die der interzellulären Kommunikation zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären.