Reg-1α est une protéine essentielle du système digestif impliquée dans des fonctions de prolifération, différenciation et régénération. Elle est exprimée et sécrétée par les neurones du système nerveux central où elle stimule la croissance neuritique et régule la différenciation et la migration des cellules précurseurs neurales via son récepteur EXTL3 et la voie GSK-3β. Par ailleurs, Reg-1α est surexprimée dans les cerveaux de patients Alzheimer et nos études préliminaires montrent qu’elle est associée à Tau hyperphosphorylée. Nous avons étudié dans ce contexte (1) le rôle de Reg-1α dans les processus neurodégénératifs liés à Tau et les voies de signalisation impliquées et (2) sa localisation dans le cerveau de souris transgéniques exprimant Tau mutée P301L/R406W. Nous avons montré que la surexpression de Reg-1α dans des neurones différenciés ne modifie pas significativement la voie Akt/GSK-3β/P-Tau mais induit la formation d’amas de Tau anormalement phosphorylée et une perturbation modérée du transport axonal. Par contre, sur des neurones surexprimant TauP301L, Reg-1α stimule la phosphorylation de Tau via Akt/GSK-3β entrainant la formation accentuée de renflements neuritiques et la perturbation sévère du transport axonal. In vivo, Reg-1α augmente avec l’âge dans le cerveau des souris contrôles et son expression est plus importante dès 5 mois chez les souris PLB2 Tau comparée aux souris sauvages. De plus, Reg-1α est associée à l’accumulation de Tau phosphorylée en S202 chez les souris transgéniques. Reg-1α est une protéine pouvant moduler l’hyperphosphorylation de Tau et le transport axonal et donc pourrait jouer un rôle dans le développement des tauopathies. / Reg-1α is an essential protein of the digestive system involved in proliferation, differentiation and regeneration functions. It is also expressed and secreted by neurons of the central nervous system where it stimulates neurite outgrowth and regulates differentiation and migration of neural precursor cells via its receptor EXTL3 and GSK-3β pathway. Moreover, Reg-1α is overexpressed in the brain of Alzheimer's patients and our preliminary studies show that it is associated with hyperphosphorylated Tau. We studied in this context (1) the role of Reg-1α in neurodegenerative processes associated with Tau and the involved signaling pathways and (2) its location in the brain of transgenic mice expressing mutated Tau P301L/R406W (PLB2 mice). We showed that overexpression of Reg-1α in differentiated neurons does not significantly modify the Akt/GSK-3β/P-tau pathway. However it induces the formation of neuritic swellings associated with abnormal phosphorylated Tau and leads to the disruption of axonal transport. Furthermore, in neurons overexpressing TauP301L, Reg-1α overexpression stimulates Tau phosphorylation via Akt/GSK-3β regulation and results in the increase of neuritic bulges and severe disruption of axonal transport. In vivo, Reg-1α expression increases with age in brains of control mice and is already higher in 5 month-old PLB2 Tau mice compared with age-matched controls. Cellular localization showed that Reg-1α is associated with the accumulation of phosphorylated Tau S202 in PLB2 mice. Finally, Reg-1α can regulate Tau hyperphosphorylation and axonal transport and consequentely could be involved in Tauopathy development.

L’accumulation cérébrale progressive de peptides amyloïdes générés à partir du clivage du précurseur du peptide amyloïde (APP) par les sécrétases est un mécanisme central de la maladie d’Alzheimer. C’est pourquoi, améliorer la compréhension de la régulation et de l’homéostasie du métabolisme de l’APP est devenu primordial. Partant de ce constat, nous avons supposé qu’une partie de la réponse pourrait être apportée par la caractérisation de nouveaux acteurs du métabolisme de l’APP. De part leurs rôles cruciaux dans le cerveau (développement, plasticité et réparations) et dans le métabolisme de l’APP (α-sécrétases), les ADAMs sont des protéines d’intérêt dont certaines fonctions ou rôles restent à déterminer. Précédemment, par une approche transcriptomique ciblant la famille des ADAMs dans des cerveaux de patients et de contrôles, ADAM30 a été retrouvée sous-exprimée dans le cerveau des patients atteints de la pathologie. Dans deux modèles cellulaires nous avions constaté que la sous-expression d’ADAM30 entraînait une augmentation de tous les produits du métabolisme de l’APP comme chez les patients. Le résultat opposé a été obtenu lors de la sur-expression d’ADAM30 dans ces cellules. Pour tenter de répliquer ces résultats dans un modèle plus proche de la physiopathologie humaine, nous avons développé un modèle de souris triples transgéniques surexprimant l’APPSweInd et ADAM30 de manière conditionnelle. Dans ce modèle nous avons observé et mesuré une diminution des dépôts amyloïdes dans le cerveau des souris exprimant ADAM30. Dans un second temps puisqu’il avait été montré au laboratoire qu’ADAM30 ne module pas l’activité des sécrétases et ne clive pas directement l’APP, nous avons cherché à déterminer les substrats d’ADAM30 dans le cadre du métabolisme de l’APP. Par une approche systématique nous avons pu déterminer que la Cathepsine D (CTSD) et l’Insuline Receptor Substrat 4 (IRS4) sont deux substrats potentiels d’ADAM30. Dans nos modèles cellulaires et de souris, nous avons pu constater qu’ADAM30 est capable de cliver et d’activer la CTSD. L’activité de la CTSD semble nécessaire pour l’action d’ADAM30 sur le métabolisme de l’APP. Nous avons pu déterminer que l’action spécifique d’ADAM30 pour la CTSD est dépendante de la séquence d’adressage au lysosome située dans l’extrémité C-terminale de l’APP. Comme la CTSD est une protéine Lysosomale, ADAM30 pourrait favoriser spécifiquement l’activation de la CTSD augmentant ainsi la dégradation de l’APP au sein de la voie endosome/lysosome. Ce mécanisme limiterait l’entrée de l’APP dans son métabolisme et donc la production de peptides amyloïdes. Afin de mieux comprendre la spécificité d’action d’ADAM30 pour la CTSD et l’APP, nous avons commencé à travailler sur le rôle potentiel d’IRS4 et la relation entre la voie de signalisation de l’Insuline et le métabolisme de l’APP. Nos travaux nous ont donc permis de mettre en évidence un nouvel acteur du métabolisme de l’APP, ADAM30, intervenant dans la régulation et la dégradation de ce dernier et ainsi d’améliorer notre compréhension des mécanismes de régulations fins impliqués dans le processus physiopathologique de la maladie d’Alzheimer. / Progressive intra-cerebral accumulation of amyloid peptides formed after sequential cleavage of the amyloid peptide precursor (APP) by secretases , is a central mecanism for Alzheimer’s disease. Therefore, a better understanding of APP regulation and homeostasy is now crucial. With this background, we postulate that the characterization of new actors in the APP metabolism could provide a more subtle understanding of this APP metabolism and trafficking. From their obvious implication in brain (development, plasticity and repair) and in APP metabolism (α-secretases), ADAMs (A Disintegrin And Metalloprotease) are an important protein proteins family which still have some undetermined function or role. Previously, a transcriptomic approach targeting ADAMs family bas been done at the laboratory on Alzheimer’s patient or control brains and found ADAM30 as under-expressed in Alzheimer’s patient brains. On cellular models, we confirmed that ADAM30 under-expression was associate with an increase in production/secretion of all the APP metabolim byproducts. Opposite results were found with ADAM30 over-expression. To replicate those results in another model closest to human pathophysiology, we have developed a triple transgenic mice model over-expressing APPSweInd and conditionally over-expressing ADAM30. In this model, we have observed and measured a decrease in amyloid deposits in mice brains over-expressing ADAM30. Secondly, because ADAM30 did not modulate secretase activities and did not cleave APP directly, we decided to determine ADAM30 substrats in the APP metabolism context. With a systematic approach, we have determined that Cathepsin D (CTSD) and Insulin Receptor Substrat 4 (IRS4) are two ADAM30 potential substrats. In our cellular models, we have found that ADAM30 is able to cleave and activate CTSD. This CTSD activity is required for ADAM30 action on APP metabolism. We have determined that ADAM30 specific action for CTSD is dependent on lysosome adressing sequence localised in APP C-terminal part. CTSD is a lysosomal protein and so ADAM30 would make CTSD specific activation easier. This mecanism would be able to increase APP degradation in endosome/lysosome pathway and reduce APP entry in its metabolism. To better understand ADAM30 specific action on CTSD and APP, we begin to investigate the potential role of IRS4 and the relation between insulin signaling pathway ans APP metabolism. Combined together, those data suggest that ADAM30 is a new APP metabolism actor, involved in an early APP regulation and degradation pathway dependent on lysosome activation. This study participate in a better understanding of the fine mecanism regulations involved in Alzheimer’s disease pathophysiological process.

Dans la première partie du travail, nous avons étudié l’expression génique dans les cancers thyroïdiens survenus après l’explosion de la centrale nucléaire de Tchernobyl. L’incidence des cancers thyroïdiens papillaires a fortement augmenté après l’accident de Tchernobyl chez les enfants, offrant l’opportunité exceptionnelle d’étudier les caractéristiques moléculaires des cancers thyroïdiens radioinduits. Contrairement aux études précédentes qui comportaient toutes des facteurs confondants, nous avons pu investiguer l’expression des ARN messagers des tumeurs et de leurs tissus contra-latéraux normaux de patients exposés et de patients non exposés aux retombées radioactives, en utilisant une cohorte de patients appariés pour l’âge et l’ethnicité. L’irradiation d’une population conduit au développement de cancers dans une fraction de cette population. Les individus atteints peuvent l’avoir été de manière stochastique, ou à cause d’une prédisposition ou sensibilité particulière à l’irradiation. La comparaison des tumeurs exposées et non exposées permet d’étudier l’effet de l’irradiation, et celle des tissus normaux contralatéraux offre la possibilité d’étudier la susceptibilité aux radiations dont les implications sont nombreuses en médecine (radio-diagnostic, cancers secondaires) et en radioprotection. L’expression génomique complète a été analysée sur puces Affymetrix pour les tissus de 45 patients. Vingt-deux de ces patients ont été exposés aux retombées de Tchernobyl, vingt-trois autres, appariés selon l'âge et résidant dans les mêmes régions de l'Ukraine, n'ont pas été exposés à l’irradiation. Notre travail a mis en évidence l’existence d’une signature transcriptionnelle permettant de différencier les tissus normaux exposés des non exposés, les gènes qui composent cette signature ayant trait à la prolifération ;nos résultats suggèrent qu’un niveau plus élevé de prolifération dans les tissus normaux pourrait être associé aux cancers radioinduits, soit en tant que facteur prédisposant au cancer, soit en tant que conséquence de la radiation.<p><p>La deuxième partie du travail a été consacrée à la caractérisation in vitro de différentes lignées cellulaires humaines de cancers thyroïdiens. Ces lignées sont souvent employées comme modèles pour l’étude et le développement d’approches thérapeutiques pour ces cancers mais notre laboratoire a démontré que ces lignées s’étaient dédifférenciées au cours de leur propagation in vitro et que leurs profils transcriptionnels se rapprochaient essentiellement des tumeurs les plus dédifférenciées, les cancers anaplasiques. Nous avons tenté de ré-induire dans ces lignées l’expression des marqueurs de différenciation de la thyroïde au moyen d’agents épigénétiques, l’idée étant que ces gènes dont l’expression est caractéristique de la thyroïde ne s’expriment plus suite à l’action de mécanismes épigénétiques comme la méthylation au niveau de leurs promoteurs. Les cancers thyroïdiens dédifférenciés étant les plus agressifs et ayant perdu l’expression des facteurs de différenciation dont le transporteur sodium/iodure (NIS), ils sont inaccessibles au traitement par l’iode radioactif I131. La réexpression des marqueurs de différenciation thyroïdienne permettrait d’une part d’employer plus adéquatement les lignées comme modèle d’étude des cancers différenciés, et d’autre part d’envisager l’emploi de(s) substances(s) qui ont permis cette réexpression en tant que médicaments pour les cancers dédifférenciés. Nos travaux montrent que les traitements épigénétiques des lignées cancéreuses ne permettent pas une réinduction significative de la différenciation mais tendent à démontrer que l’inactivation épigénétique provoque dans ces lignées la perte de l’expression de gènes n’ayant aucun rôle utile pour la cellule au cours des milliers de réplications in vitro / In the first part of the work, we studied gene expression in thyroid cancers following the explosion of the Chernobyl nuclear power plant. The incidence of thyroid papillary cancers rose sharply after the Chernobyl accident in children, providing an exceptional opportunity to study the molecular characteristics of radiation-induced thyroid cancers. Unlike previous studies that included confounding factors, we were able to investigate the expression of messenger RNA from tumors and their normal contra-lateral tissue of patients exposed and not exposed to the fallout using a cohort of patients matched for age and ethnicity. The irradiation of a population leads to the development of cancer in a fraction of the population. Affected individuals may have been stochastically, or because of a particular predisposition or susceptibility to irradiation. Comparison of tumors exposed and unexposed allows to study the effect of irradiation, and the contra-lateral normal tissue offers the possibility to study the susceptibility to radiation whose implications are numerous: medical (radio - diagnosis, secondary cancers ) and radiation protection. The complete gene expression was analyzed on Affymetrix for tissues of 45 patients. Twenty- two of these patients were exposed to fallout from Chernobyl, twenty-three, matched for age and residing in the same regions of Ukraine have not been exposed to radiation. Our work has demonstrated the existence of a transcriptional signature allowing to differentiate exposed and unexposed normal tissues, and the genes that compose the signature are related to proliferation; our results suggest that a higher level of proliferation in normal tissues may be associated with radiation-induced cancers, either as a predisposing factor for cancer,or as a result of the radiation.<p><p>The second part was devoted to the in vitro characterization of different human cell lines of thyroid cancer. These lines are often used as models for the study and development of therapeutic approaches for these cancers, but our laboratory has demonstrated that these cell lines dedifferentiated during their in vitro propagation and their transcriptional profiles are essentially closer to the most dedifferentiated tumors, the anaplastic cancers. We tried to re- induce in these lines the expression of differentiation markers of thyroid using epigenetic agents, the idea being that these genes whose expression is characteristic of thyroid are no longer expressed due to epigenetic mechanisms such as methylation of their promoters. Dedifferentiated thyroid cancers are more aggressive and have lost the expression of differentiation factors including sodium/iodide transporter(NIS), they are inaccessible to treatment with radioactive iodine I131. Re-expression of thyroid differentiation markers could allow in one hand to use more adequately cell lines as models to study differentiated cancers, and secondly to consider the used substances that helped this re-expression as drugs for the dedifferentiated cancers. Our work shows that epigenetic treatments for cancer cell lines do not allow a significant re-induction of differentiation but tend to demonstrate that the epigenetic inactivation in these cell lines causes the loss of expression of genes that have no useful role in the cells over thousands of replication in vitro .<p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction : La dysfonction primaire du greffon (DPG) post-transplantation pulmonaire est la principale cause de décès en phase péri-opératoire. Sa physiopathologie n’est pas encore totalement élucidée mais les lésions d’Ischémie/Reperfusion (I/R) pourraient constituer un facteur important de son développement. L’I/R et la DPG sont caractérisées par des dommages de l’endothélium vasculaire et de l’épithélium alvéolaire, un œdème pulmonaire et une réaction inflammatoire exacerbée. La résorption de l’œdème dépend du rétablissement de l’intégrité fonctionnelle alvéolaire, dont la capacité à réabsorber les ions Na+ (via les canaux ENaC), et secondairement le liquide par les cellules alvéolaires. Nous avons émis l’hypothèse que la dysfonction épithéliale alvéolaire, causée par l’I/R, présente dans les greffons donneurs (GD), jouerait un rôle clef dans le développement de la DPG chez les receveurs. Notre but était d’identifier de biomarqueurs, associés à la dysfonction épithéliale des GD et au développement de DPG chez les receveurs. Méthodes : L’impact d’un protocole mimant une I/R a d’abord été évalué sur des cultures primaires de cellules alvéolaires de rats. Puis, nous avons étudié l’impact de l’I/R in vivo grâce à des modèles de stress inflammatoire par infusion de LPS ou transplantation unilatérale chez le porc. Finalement, des biopsies de tissus de GD ont été recueillies durant les transplantations pulmonaires. Après détermination du grade de DPG chez les receveurs, nous avons étudié les facteurs et les altérations alvéolaires associés. Résultats : Une baisse d’expression des protéines de jonctions serrées (ZO-1), des canaux ioniques ENaC et CFTR ainsi qu’une réduction de la résistance transépithéliale et de la capacité de réparation suite aux lésions ont été observées suite au protocole mimant l’I/R dans le modèle de cultures primaires de cellules alvéolaires. Un traitement avec un activateur du canal K+ KvLQT1 (R L3) a permis d’améliorer la vitesse de réparation, l’intégrité de la barrière épithéliale et l’expression d’ENaC et CFTR. Dans nos modèles animaux, nous avons observé une réponse pro-inflammatoire et une altération des protéines ZO-1, ENaC et CFTR. Nos données préliminaires indiquent aussi une infiltration inflammatoire et une baisse d’ENaC, CFTR et ZO-1, déjà présentes dans les GD ayant subits une I prolongée, chez les receveurs ayant ensuite développés une DPG. Conclusion : Nos résultats soutiennent notre hypothèse du développement d’une dysfonction épithéliale alvéolaire, caractérisée par une altération de biomarqueurs de fonctionnalité et d’intégrité (ENaC, CFTR et ZO-1), en lien avec l’I/R et la DPG. / Background: Primary graft dysfunction (PGD) after lung transplantation is the first cause of death in the perioperative phase. The PGD pathophysiology is not fully elucidated, but Ischemia/Reperfusion (I/R) injury might be an important factor. I/R and PGD both feature endothelial/ epithelial damage, lung edema and inflammation. Edema resorption then depends on the restoration of the alveolar functional integrity, especially the ability of alveolar epithelial cells to reabsorb Na+ (through ENaC channels) and fluid. We hypothesized that alveolar epithelial dysfunction (related to I/R), observed within donor grafts, then plays a key role in the development of PGD in lung recipients. Our goal was to identify novel biomarkers, associated with epithelial dysfunction within donor’s grafts, and then PGD development in recipients. Methods: The impact of a protocol mimicking hypothermic ischemia and reperfusion was first tested on primary rat alveolar epithelial cell cultures. Then, the impact of I/R was studied in vivo using models of inflammatory stress induced by LPS infusion or after unilateral transplantation in pigs. Finally, lung biopsies from donor grafts were collected during lung transplantations. After defining PGD scores within the recipients, associated factors and alveolar alterations were finally analyzed. Results: In primary cell cultures, the protocol mimicking hypothermic I/R induced a decrease in tight junction proteins (ZO-1), transepithelial resistance, wound repair capacity as well as ENaC and CFTR channel expression. Treatment with a KvLQT1 K+ channel activator (R-L3) accelerated the repair rates and enhanced barrier integrity (ZO-1 staining) as well as ENaC and CFTR protein expressions. In the porcine models, an exacerbated inflammatory response was observed along with alveolar damage, lung edema and decreased ZO-1, ENaC and CFTR expressions. Our preliminary data using human samples collected during lung transplantations also indicate an inflammatory response and reduced ENaC, CFTR and ZO-1 expressions, already observed within lung grafts, submitted to longer cold ischemia duration, among lung recipients then developing a PGD. Conclusion: Altogether these data support our hypothesis of an alveolar epithelial dysfunction, featuring an alteration of functionality and barrier integrity biomarkers (ENaC, CFTR and ZO-1), associated with I/R and DPG.