Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les douleurs chroniques et notamment les douleurs neuropathiques sont particulièrement difficiles à traiter par les solutions thérapeutiques actuellement disponibles. Par conséquent, il existe un besoin crucial de découvrir et d'exploiter de nouveaux concepts d'antalgiques afin de traiter ce type de douleurs. Parmi les différentes pistes possibles, le système glutamatergique semble particulièrement intéressant puisque le glutamate est le principal neurotransmetteur propageant l'information douloureuse. Notre hypothèse est que l'activation du récepteur mGlu4 spinal inhiberait la neurotransmission glutamatergique et réduirait donc l'excès de douleur observé lors de douleurs chroniques. Grâce notamment au développement du premier agoniste orthostérique sélectif de mGlu4, nous avons mis en évidence que le récepteur mGlu4 n'altère pas la perception de la douleur aiguë mais qu'il influe, au contraire, sur l'aspect pathologique de la douleur en inhibant l'allodynie et l'hyperalgie mécanique ou thermique présentes lors de douleurs chroniques. Nous montrons que la modulation de l'hypersensibilité par mGlu4 semble provenir de sa capacité à inhiber la transmission glutamatergique via un couplage négatif avec les canaux calciques de type N au niveau de la couche II de la moelle épinière et plus particulièrement au niveau des fibres exprimant le transporteur vésiculaire VGLUT3. L'ensemble de nos résultats permettent de valider le récepteur mGlu4 spinal comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement des douleurs chroniques. En effet, les agonistes de mGlu4 pourraient être des antalgiques puissants et sélectifs des douleurs pathologiques. / Chronic pain and in particular neuropathic pain are particularly difficult to treat by therapeutic options currently available. Therefore, it is a crucial to develop new concepts of analgesics to treat this type of pain. Among the various possibilities, targeting the glutamatergic system seems to be particularly interesting since glutamate is the main neurotransmitter propagating the pain information. Our hypothesis is that the activation of spinal mGlu4 receptor would inhibit the spinal glutamatergic neurotransmission and would thus reduce the excess of pain observed in chronic pain.Thanks to the development of the first orthosteric agonist selective for mGlu4 and the use of transgenic animals, we demonstrated that mGlu4 receptor does not alter the perception of acute pain but that it does affect the pathological aspect of pain by inhibiting the allodynia and the hyperalgesia (mechanical and thermal) usually observed in chronic pain. We show that the mGlu4 modulation of the hypersensitivity seems to result from the ability of the receptor to inhibit the glutamatergic transmission through a negative coupling with N-type calcium channels in the lamina II of the spinal cord and especially at the level of fibers expressing the vesicular transporter VGLUT3. Taken together, our results validate spinal mGlu4 as a potential therapeutic target for the treatment of chronic pain. Indeed, mGlu4 agonists could be potent and selective painkillers of pathological pain.

La plasticité du système nerveux central face aux contraintes environnementales ou morphologiques est un processus fondamental mis en place afin de permettre à l’animal de maintenir des comportements adaptés. Parce que le comportement locomoteur est essentiel à la survie de l'animal, les mécanismes neuronaux permettant sa genèse doivent s’adapter aux modifications morphologiques de l’organisme pendant son développement. Pour aborder cette question, nous avons développé un nouveau modèle expérimental pour lequel les modifications morphologiques au cours du développement sont extrêmes et impliquent des reconfigurations à long terme du système nerveux. L'amphibien Xenopus laevis lors de sa métamorphose est, en effet, un modèle pertinent pour étudier (par des approches comportementales, neuroanatomiques, électro-physiologiques et pharmacologiques), les mécanismes impliqués dans la réorganisation des réseaux neuronaux locomoteurs de la moelle épinière face à des modifications extrêmes du schéma corporel. En effet, pendant sa métamorphose, l'animal passe d'un mode de locomotion ondulatoire mettant en jeu sa musculature axiale, à un mode de locomotion appendiculaire grâce aux membres néo-formés. Il existe de plus des stades intermédiaires où les deux modes de locomotion coexistent et expriment des relations fonctionnelles variables. Nos expériences d’électrophysiologie extracellulaire nous ont permis de dégager la dynamique temporelle de l’émergence du réseau de neurones commandant la locomotion appendiculaire adulte et de ses relations fonctionnelles avec le réseau locomoteur commandant la nage larvaire lorsque ces deux réseaux coexistent. D’après les résultats présentés, il apparaît un changement de l’équilibre fonctionnel et des interactions entre les commandes locomotrices ondulatoire et appendiculaire, faisant des stades intermédiaires de la métamorphose les témoins privilégiés du passage de relais progressif entre les deux systèmes locomoteurs. Nos travaux ont également démontré que l’activité de chaque réseau ainsi que leurs relations fonctionnelles sont sujettes à modulation glutamatergique et aminergique destinées à adapter la locomotion aux besoins de l'animal. Nous montrons que certains modulateurs (tels que le glutamate, la sérotonine et la noradrénaline) exercent des effets opposés sur les réseaux locomoteurs larvaires et adultes, alors qu'à l'inverse, la dopamine conserve les mêmes propriétés modulatrices sur ces réseaux malgré les profonds bouleversements subis pendant le développement. Outre leur rôle modulateur, nos résultats suggèrent aussi un rôle des afférences aminergiques dans la maturation des réseaux locomoteurs et ouvrent de nombreuses interrogations quant aux mécanismes impliqués dans la plasticité des afférences neuromodulatrices elles-mêmes au cours de la métamorphose. L’apparition et la disparition de neurones sérotoninergiques intraspinaux concomitantes avec la croissance des membres postérieurs, et précédant la régression de l'appendice caudal laissent envisager un rôle de la sérotonine dans la maturation du réseau locomoteur appendiculaire ou dans la chronologie de la régression du réseau axial. / Plasticity of the central nervous system is fundamental to an animal's capacity to adapt to continually changing biomechanical and environmental demands. Although the neuronal mechanisms underlying such essential behaviours as locomotion must adapt to an organism's morphological modifications during growth and development, the associated changes that occur in central nervous function remain poorly understood. To address this issue, we have developed a new experimental model - the amphibian Xenopus laevis during its metamorphosis - in which the extreme biomechanical modifications occurring during this critical period necessitate a correspondingly extensive and long-term reorganisation of locomotor neural circuitry within the animal's spinal cord. During metamorphosis, the locomotory strategy of Xenopus shifts from undulatory swimming involving axial tail-based movements, to appendicular propulsion that uses the newly formed limbs. At intermediate metamorphic stages, moreover, the two locomotor strategies coexist within the same animal as the secondary limb-based motor circuitry is progressively replaces the primary axial network as the limbs are added and the tail regresses. By making extracellular recordings of spontaneous "fictive" locomotor patterns generated by isolated brainstem/spinal cord preparations, we have charted the temporal dynamics of the emergence of the appendicular neuronal network and determined its functional relationship with larval axial locomotor circuitry through the metamorphic period. Our results have shown that the limb circuitry is initially present but not functional, functional but subordinate to the embryonic axial network, functionally independent from the axial network, and ultimately alone after axial circuitry disappears with tail resorption. Furthermore, the use of pharmacological approaches established that during the metamorphic transition, the coexisting spinal locomotory networks and their functional interactions are subject to glutamatergic and aminergic modulation in order to adapt locomotory performance to the immediate behavioural needs of the animal. Interestingly, the neuromodulators glutamate, serotonin and noradrenaline exert directly opposing influences on the larval and adult locomotor networks, while dopamine preserves a similar modulatory action on the two circuits in spite of their profound remodelling during metamorphic development. Finally, in addition to a short-term modulatory role, our immunocytochemical evidence suggested that descending aminergic systems may contribute to the long-term maturation of spinal locomotor circuitry during metamorphosis in parallel with their own developmental reconfiguration. Specifically, the appearance and disappearance of a population of intraspinal serotonergic neurons concomitant with hindlimb growth and preceding tail regression suggested a role of serotonin in the maturation of the appendicular locomotor network and/or in the chronology of axial network regression.

Le système nerveux central possède des réseaux de neurones capables de générer des commandes motrices rythmiques en l'absence d'informations sensorielles. Ces réseaux neuronaux sont communément appelés générateurs centraux de patron (CPG, central pattern generator) et sont impliqués dans plusieurs fonctions et comportements vitaux tels que la locomotion et la respiration. Dans certaines circonstances, ces réseaux neuronaux se doivent d'interagir afin de produire un comportement moteur adapté aux contraintes environnementales ainsi qu'aux exigences de l'organisme. C'est notamment le cas lors d'un effort physique où une augmentation du rythme respiratoire est rapidement observée pour subvenir aux besoins en oxygène de l'organisme. Dans ce contexte de neurosciences intégratives, mon travail doctoral a porté sur l'étude des mécanismes neurogènes responsables de l'interaction entre les CPG respiratoires du tronc cérébral et les CPG locomoteurs de la moelle épinière. Cette étude a été réalisée sur des préparations de tronc cérébral-moelle épinière isolée in vitro de rat nouveau-né (P0 à P2) au sein desquelles les centres respiratoires et locomoteurs sont conservés intacts. Par des approches électrophysiologique, pharmacologique, lésionnelle et neuroanatomique, les mécanismes de coordination entre ces sous-groupes neuronaux ont été étudiés. Dans ce contexte, un des principaux résultats de ce travail doctoral est la mise en évidence de l'existence d'une influence ascendante excitatrice issues des CPG locomoteurs spinaux sur les centres respiratoires, et plus particulièrement sur le groupe respiratoire parafacial, structure située dans le bulbe rachidien et impliquée dans la genèse de la commande respiratoire. Outre son implication dans la modulation du rythme respiratoire, cette influence ascendante module également l'activité des populations neuronales expiratoires des régions spinales thoraciques et lombaires. Ces données constituent la première mise en évidence de l'existence de neurones bi-fonctionnels au sein de la moelle-épinière chez le rat nouveau-né. / The central nervous system contains neural networks that can generate rhythmic motor drive in absence of sensory feedback. These neural networks are commonly called central pattern generators (CPG) and are involved in many vital functions and behaviors, such as locomotion or respiration. In certain circumstances, these neural networks must interact to produce motor behaviors adapted to environmental constraints and the basic needs of organism. This is the case during physical exercise when the respiratory frequency increases in order to satisfy the oxygen needs. In a context of integrative neurosciences, my doctoral work aimed at exploring the neurogenic mechanisms involved in the coordination between the medullary respiratory networks and the spinal locomotor CPG. To address this question, we used an isolated in vitro brain stem-spinal cord preparations from neonatal rats (0-2 days) in which the respiratory and the locomotor networks are kept intact. Using electrophysiological, pharmacological, lesional and neuroanatomical approaches, mechanisms involved in the coordination between locomotor and respiratory rhythms have been studied. The major finding of this doctoral work is the identification of an ascending excitatory influence from spinal locomotor CPG to the respiratory networks, acting particularly on the parafacial respiratory group, which is known to be engaged in the genesis of expiratory activity. In addition to the respiratory frequency modulation, this ascending influence also modulates the activity of spinal expiratory neurons located in lumbar and thoracic segments. These data provide the first evidence for the existence of bi-functional neurons in newborn rat spinal cord.

Le traçage rétrograde des voies corticales chez le singe a permis d’étudier deux sujets liés. En premier lieu, des injections dans 40 aires d'un atlas cortical de 91 aires ont permis de constituer une base de données cohérente sur la connectivité corticale à l’échelle de l’hémisphère. Les structures sous-corticales favorisant la communication corticale via la formation de boucles cortico-sous-cortico-corticales ont été examinées. Nous montrons que la force des projections du claustrum (considéré comme ayant une affiliation étroite avec le cortex) vers chaque aire explorée est exceptionnelle. De plus, un chevauchement des neurones marqués dans le claustrum a été observé suite à des paires d'injections dans des aires largement éloignées, y compris dépourvues de connexions cortico-corticales directes. A l’aide d’outils de la théorie des graphes, nous avons examiné la centralité des 40 aires et du claustrum dans le réseau cortical. En particulier, le claustrum est le meilleur exemple d’une aire pouvant prétendre au statut de « hub ». Ces résultats soulignent l'importance d'étudier les principes organisationnels du cortex via l'analyse de la topologie de son réseau. En second lieu, nous avons étudié le développement de la voie corticospinale par laquelle le cortex influence la planification, l'exécution et le contrôle de la motricité fine. Nous montrons que la topologie des projections corticospinales chez l’adulte émerge suite à un processus développemental de raffinement des projections ipsi- et controlatérale étendues. Ces résultats suggèrent que le développement de la connectivité corticale pourrait être régulé de manière dynamique et spécifique aux primates / The retrograde tracing experiments in macaque cortex in this thesis had two related objectives. Firstly, injections in 40 cortical areas (from a 91-area atlas) allowed the construction of a hemisphere-wide consistent database of cortical connectivity. We examined which subcortical structures promote cortical communication via the formation of cortico-subcortical-cortical loops. The claustrum, which we argue has a tight affiliation with the cortex, showed uniquely strong outputs to every cortical area. Widely separated injection pairs led to overlapping labelled neurons in the claustrum including those pairs lacking direct cortico-cortical connections. Using graph theoretic tools, we examined how central the 40 areas and claustrum are in the cortical network, specifically with respect to hub status. This showed that the claustrum is, beyond doubt, the prime hub of the cortex. These findings emphasise the importance of studying the organizational principles of the cortex via the analysis of its network topology. Secondly, we investigated the development of the corticospinal pathway, a route over which the cortex directly influences the planning, execution and control of fine voluntary movements. We show that the adult pattern of corticospinal projections emerges via a developmental process from a widespread ipsi- and contralateral distribution. These findings suggest that the developmental refinement of cortical connectivity might be dynamically regulated and primate specific

Alors que la douleur physiologique est essentielle à la survie de l'individu, les douleurs chroniques sont purement délétères pour l'organisme et la qualité de la vie. Malheureusement, les traitements actuels se limitent à des médicaments peu efficaces ou présentant un mauvais rapport bénéfice / risque. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes d'établissement et de persistance des douleurs chroniques, comme les douleurs neuropathiques, afin de concevoir des stratégies thérapeutiques efficaces contre ces pathologies. De nombreuses études ont montré que les canaux calciques de type T sont impliqués dans les états douloureux chroniques. Par exemple, le sous-type Cav3.2, est exprimé tout au long du circuit neuronal nociceptif. Dans le système nerveux périphérique, les canaux Cav3.2 ont un rôle pronociceptif et sont désormais validées comme cibles pour la recherche de thérapies innovantes. En revanche, le rôle du canal Cav3.2 au niveau central, et en particulier dans la moelle épinière, un point névralgique de convergence, d'intégration et de transmission des informations nociceptives, reste à explorer.Grâce à un modèle murin Cav3.2GFP-Lox knock-in créé par l'équipe, nous avons pu identifier/localiser précisément les neurones Cav3.2 positifs dans tout le système nerveux et induire une délétion tissulaire spécifique de Cav3.2 par l’action de la Cre recombinase, pour ensuite en évaluer les effets sur la sensibilité à la douleur. Dans la moelle épinière, nous avons constaté que Cav3.2 est fortement exprimé dans les neurones des laminae superficielles, et sont principalement des neurones excitateurs. La suppression de Cav3.2 spinal par une approche virale a démontré comportementalement : i) l’abolition de l’allodynie au froid et mécanique, de l’hyperalgésie mécanique, ainsi que des douleurs spontanées, en condition neuropathiques chez les mâles et les femelles, ii) une altération de la perception au chaud en condition neuropathique avec un effet différentiel dépendant du sexe, et iii) une réduction de l’anxiété associée aux douleurs chroniques, iv) la suppression des effets analgésiques d’un traitement systémique d’un bloqueur pharmacologique de canaux calciques de type T. Mécanistiquement, les enregistrements extracellulaires in vivo des neurones de projection spinaux démontrent une diminution de l'intégration et de la transmission des messages nociceptifs pathologiques des fibres périphériques C et A-delta lorsque le canal Cav3.2 est délété dans les réseaux spinaux. Cette approche de délétion a été développée avant et après l'induction du modèle de douleur neuropathique pour en évaluer les effets préventifs et curatifs.Les résultats démontrent que la délétion du canal spinal Cav3.2 a des effets préventifs et curatifs sur les symptômes des douleurs neuropathiques. Dans une perspective clinique pour le développement d'analgésiques basés sur les inhibiteurs calciques de type T, nous suggérons de cibler Cav3.2 spinal en plus des canaux dans les neurones afférents primaires par des molécules pénétrant le système nerveux central. / Physiological pain is essential for individual survival, but chronic pains are purely deleterious for the organism and the life quality. Unfortunately, current therapies are limited to drugs with a low efficacy or with a bad benefit/risk ratio. It is thus urgently necessary to better understand the establishment and persistence mechanisms of those chronic pains, like neuropathic pain in order to design efficient therapeutic strategies against this pathology. Many studies have shown that T-type calcium channels are involved in chronic pain states, like Cav3.2 subtypes, all along the nociceptive circuit. In the peripheral nervous system, Cav3.2 channels have pronociceptive impact and are now approved as a target for innovative therapies development. In contrast, the role of Cav3.2 channel in the central nervous system, and especially in the spinal cord, a crucial hotspot of nociceptive information convergence, integration and transmission, remains to be explored.Thanks to a Cav3.2-GFP-Lox murine model created by the team, we were able to i/ identify and precisely localize Cav3.2 positive neurons in all the nervous system and ii/ induce tissue specific deletion of Cav3.2 by the Cre recombinase action, to evaluate effects on pain sensitivity. At the spinal level, we found that Cav3.2 is prominently expressed in lamina II neurons comprising mostly excitatory neurons. Knocking-out spinal Cav3.2 by a viral approach has demonstrated behaviorally i) an abolition of cold and mechanical allodynia, mechanical hyperalgesia and spontaneous pain like behaviors under neuropathic conditions in males and females, ii) an alteration of the hot perception, under pathological pain conditions, with a differential effect in a sex dependent manner, and iii) a modification of anxiety associated to chronic pain, iv) a suppression of the analgesia induced by a systemic treatment with a brain penetrant T-type channel blocker. Mechanistically, extracellular in vivo recordings of spinal projection neurons demonstrate a decrease in integration and transmission of pathologic nociceptive messages from peripheral C- and A-delta fibers by Cav3.2 ablation in spinal networks. This approach has been developed before and after induction of the pain model to evaluate the preventive and curative effect of the treatment.Altogether, the results demonstrate that spinal Cav3.2 channel deletion has preventive and curative effects regarding neuropathic pains symptoms. In a clinical perspective for the development of analgesics based on T-type calcium channel blockers, we suggest the utility of targeting spinal Cav3.2 additionally to channels in primary afferent neurons, a notion already well established.

Les douleurs neuropathiques sont associées dans la moelle épinière à des altérations neuronales et gliales. Ces cellules libèrent des médiateurs inflammatoires comme l'interleukine-6, jouant un rôle pro-nociceptif et qui active principalement la voie JAK/STAT3. Dans ce contexte, nous avons étudié l'implication éventuelle de la voie dans ce type de douleurs. Dans différent modèles de lésions de nerf périphérique chez le rat, la voie JAK/STAT3 spinale est activée de façon précoce et prolongée, surtout dans la microglie. L'inhibition de cette voie par un agent pharmacologique a démontré son implication dans la genèse de l'hypersensibilité douloureuse. Pour inhiber plus spécifiquement la voie JAK/STAT3, nous avons injecté dans la corne dorsale de la moelle épinière un vecteur lentiviral à fort tropisme glial (LV-SOCS3). L'injection préventive de ce vecteur chez des rats neuropathiques diminue l'expression d'IL-6, ATF3 et MCP-1 et réduit fortement l'hypersensibilité mécanique.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les douleurs neuropathiques, celles qui sont provoquées par des lésions du système nerveux central ou périphérique, sont les plus difficiles à traiter du fait de leur résistance aux traitements antalgiques classiques. Les traitements utilisés aujourd'hui font appel à des classes thérapeutiques non spécifiquement ciblées sur la douleur, en particulier des antidépresseurs et des anticonvulsivants. Leur efficacité limitée ne repose en fait que sur des observations empiriques. Une meilleure connaissance des processus physiopathologiques sous-tendant les douleurs neuropathiques constitue un préalable à toute innovation thérapeutique, et c'est à cette fin que je me suis appliqué à développer deux modèles de douleurs neuropathiques chez le rat pour en étudier les caractéristiques comportementales, fonctionnelles, cellulaires et biochimiques. Le premier modèle visait à l'induction d'une douleur neuropathique centrale provoquée par la section complète de la moelle épinière au niveau thoracique (T8-T9) ; le second a consisté à injecter, directement au niveau spinal, par voie intrathécale (i.t.), le facteur neurotrophique BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor ; dont l'implication dans les voies de signalisation nociceptive est bien établie dans la littérature). Dans les deux cas, les conséquences pro-algiques de ces interventions ont été comparées à celles induites par la ligature unilatérale du nerf sciatique, qui constitue encore aujourd'hui un modèle classique, mais très imparfait, d'une douleur neuropathique périphérique. Dès le 2ème jour après la section spinale, et jusqu'au moins deux mois plus tard, les rats lésés présentent une forte allodynie mécanique (test des filaments de von Frey) dans le territoire cutané juste en avant de la lésion. Cet effet traduit bien une neuropathie centrale car il n'existe pas chez les rats " sham " qui ont subi l'intégralité de l'intervention chirurgicale à l'exception de la section spinale. L'allodynie mécanique est associée à une induction significative de l'expression (RTqPCR) de marqueurs de souffrance neuronale (ATF-3) et d'activation microgliale (OX-42, récepteurs P2X4, P2X7 et TLR4) et astrocytaire (GFAP), ainsi que du BDNF et de cytokines pro-inflammatoires (IL-1ß, IL-6, TNF-α), mais de façon plus transitoire, ceci dans les ganglions de racines dorsales et/ou la moelle épinière dorsale (comme à la suite de la ligature du nerf sciatique, mais avec des cinétiques différentes). Pour sa part, l'injection intrathécale i.t. d'une dose infra-nanomolaire unique de BDNF (0.3 - 3.0 ng) induit aussi une forte allodynie et une hyperalgésie mécaniques, au niveau des pattes postérieures, qui se développent en 3-5 jours, et perdurent pendant deux semaines. Cependant, au contraire de la section spinale (et de la ligature du nerf sciatique), l'injection i.t. de BDNF ne provoque pas d'activation microgliale ni d'induction de cytokines. Elle entraine en revanche une auto-induction du BDNF, qui semble clé pour l'hyperalgésie puisque celle-ci peut être, en grande partie, supprimée par l'administration d'un inhibiteur du récepteur TrkB du BDNF, la cyclotraxine B (20 mg/kg i.p.), comme d'ailleurs l'hyperalgésie induite par la ligature du nerf sciatique. Au plan pharmacologique, un antalgique opiacé comme le tapentadol s'est révélé efficace dans les deux modèles. De même, les anticonvulsivants, comme la prégabaline et la gabapentine, ont réduit la douleur neuropathique chez les rats injectés par le BDNF i.t. et chez les rats CCI-SN. En conclusion, il semble que l'injection intrathécale de BDNF, qui évite la réalisation de lésions par intervention chirurgicale, puisse constituer un nouveau modèle pertinent de douleur neuropathique chez le rat. De plus, nos résultats laissent à penser que le blocage de la voie de signalisation BDNF-TrkB pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour la réduction des douleurs neuropathiques périphériques. (...)